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Studies on absorption mechanism of loganin in intestines of rats

马钱苷肠吸收机制的研究



全 文 :foundintheconcentrationof26mg·L-1和 52mg·L-1.Conclusion:Gastrodinemayactasaneuro-protectorbyweakeningthe
expressionofNR1mRNAinculturedratcerebralcorticalneuronsinjuryinducedbyhypoxiaandhypoglucose.
[Keywords] gastrodine;corticalneurons;hypoxia;NR1mRNA;RTPCR
[责任编辑 古云侠]
[收稿日期] 20071108
[基金项目] 黑龙江省科技厅攻关项目(GC05C31601);黑龙
江省教育厅振兴老工业基地项目(1151gzd25)
[通讯作者] 李文兰,Tel:13936169153,Email:lwldzd@163.
com
马钱苷肠吸收机制的研究
李文兰1,2,扈正婷1,季宇彬1,王晓冬1,徐 栋1
(1哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心,黑龙江 哈尔滨 150076;
2国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心,黑龙江 哈尔滨 150075)
[摘要] 目的:考察药物浓度、肠段、pH及Pgp对马钱苷肠吸收机制的影响规律。方法:将大鼠分为10组:马
钱苷高、中、低剂量组(01,0025,00125mg·mL-1);十二指肠、空肠及回肠组(0013mg·mL-1);pH6,7,8组
(0013mg·mL-1);诱导剂利福平组(00125mg·mL-1)。采用大鼠在体循环灌流法,应用 HPLC测定肠吸收循
环液中马钱苷的浓度,UV法测定肠吸收循环液中即时酚红浓度。结果:马钱苷在00125~01mg·mL-1,其吸收
量与药物浓度呈线性关系,且各浓度吸收速率基本不变;pH对马钱苷吸收没有显著影响;各个肠段的吸收速率及
吸收量顺序为回肠>十二指肠>空肠;此外,Pgp诱导剂利福平对马钱苷的吸收有明显的抑制作用。结论:马钱苷
在肠道的吸收呈一级动力学过程,吸收机制推断为被动扩散;具有特定的吸收部位,宜制成胃肠道滞留型定位释药
系统;马钱苷为Pgp底物,可以通过与Pgp抑制剂合用提高其生物利用度。
[关键词] 马钱苷;吸收机制;HPLC
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)09105204
  马钱苷(loganin)又名马钱素,是中药山茱萸及
许多复方的主要活性成分,具有明显的抗炎、调节免
疫、强心的作用[1,2],在低浓度时有促进淋巴细胞转
化作用,而高浓度时则有抑制作用,提示马钱苷对免
疫反应有双向调节作用[3]。
在口服药物占主导地位的今天,决定其药用价
值的首要环节就是药物吸收的程度和速度。因此,
研究药物的吸收具有重要意义。目前,考察药物吸
收特性的模型有体内、在体和体外3种,各方法都有
其优缺点。综合考察发现,体内及体外2种方法操
作均较为繁琐[4],且实验条件要求高[5,6],比较难以
达到良好的效果。而在体循环灌流法既克服了体内
及体外实验取样困难、洁净度要求高的难点,又接近
正常的生理条件[7],最重要的是实验对象为活体动
物,实验结果与体内结果接近,有较高的实验价值。
鉴于马钱苷较强的药理活性和药用价值,本实
验采用在体循环灌流法对马钱苷的吸收动力学进行
考察,确定影响其吸收的因素及其规律,揭示马钱苷
在肠道内的吸收机制,从而指导临床用药,并为马钱
苷及含马钱苷的中药新剂型的研制提供科学依据。
1 材料
1.1 仪器
WatersHPLC(W2695泵、W2996DAD检测器、
自动进样器、Empower化学工作站);751型紫外分
析仪(上海光谱仪器有限公司);水浴锅型号(上海
一恒仪器有限公司);HL-2型恒流泵(上海嘉鹏科
技有限公司);pH酸度计(北京赛多利斯仪器系统
有限公司);电子天平(美国奥好斯科技有限公司)。
1.2 试剂
水合氯醛;酚红;双蒸水;KB缓冲液(NaCl687g
·L-1,KCl04g·L-1,NaHCO322g·L
-1,NaH2PO4
013g·L-1,MgSO40122g·L
-1,CaCl2025g·L
-1,
葡萄糖5g·L-1);甲醇(色谱纯);冰醋酸(色谱纯)。
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1.3 药物
马钱苷(中国药品生物制品检定所,批号
111640200502,纯度98%)。
1.4 动物
雄性Wistar大鼠(225±20)g,购自长春国家生
物产业基地实验动物中心,合格证号 SCXK(吉)
20030004。
2 方法
2.1 酚红检测波长的选择
精密称取马钱苷标准品、酚红、空白循环液适
量,以KB缓冲液配成适当浓度,在200~600nm波
长内扫描。结果表明,酚红在558nm波长处呈现最
大吸收,而在此波长条件下,马钱苷及空白循环液几
乎没有吸收。因此,确定该波长为酚红的检测波长。
2.2 马钱苷色谱的条件建立
色谱柱:SymmetryC18(39mm×150mm,5
μm);流动相01%冰醋酸水溶液甲醇(80∶20);柱
温30℃;检测波长 237nm;流速 08mL·min-1。
分别取马钱苷样品溶液及酚红空白循环液过045
μm微孔滤膜,在上述色谱条件下,进样10μL。实
验分别得出马钱苷样品色谱图及空白循环液色谱图
(图1,2)。
图1 马钱苷样品色谱图
1.酚红及KB缓冲液中各成分;2.马钱苷
图2 空白循环液色谱图
1.酚红及KB缓冲液中各成分
  由图可见:空白循环液及酚红对马钱苷吸收无
干扰,马钱苷色谱峰峰形良好,tR为1066min。因
此,确定以该条件测定循环液中马钱苷的含量。
2.3 标准曲线绘制
2.3.1 酚红标准曲线绘制 精密吸取用 KB缓冲
液配制的质量浓度为10,20,30,40,50mg·L-1的
酚红标准溶液各 05mL,加入 02mol·L-1的
NaOH溶液50mL,摇匀,在558nm处测定吸光度,
以吸光度对质量浓度进行线性回归,求出酚红标准
曲线方程Y=0018X+00429,r=09999(n=5)。
表明酚红在10~50mg·L-1线性关系良好。
2.3.2 马钱苷标准曲线绘制 精密称取马钱苷对
照品1mg,用KB缓冲液定容于10mL量瓶中,配制
成质量浓度为01mg·mL-1的马钱苷对照品溶液,
再以适量的KB缓冲液将其分别稀释为008,004,
002,001mg·mL-1,过045μm微孔滤膜,分别
进样10μL,以峰面积对浓度进行线性回归,求出马
钱苷标准曲线方程:Y=2×106X-41688,r=
09998(n=3)。表明马钱苷在 001~01mg·
mL-1线性关系良好。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度 精密吸取马钱苷对照品溶液(004
mg·mL-1),连续 5次进样 10μL,测定峰面积。
RSD为017%,表明精密度良好。
2.4.2 回收率 取已知含量的样品溶液3份,分别
加入不同体积马钱苷标准品溶液(004mg·
mL-1),使加入马钱苷对照品达到样品中马钱苷的
120%,100%,80%,测定马钱苷。平均回收率为
9963%,RSD为110%。
2.4.3 稳定性 用 KB缓冲液将马钱苷标准品配
制成质量浓度为02mg·mL-1的溶液,置于(37±
5)℃的水浴中加热,分别于05,1,15,2,25,3h
取样测定含量。以峰面积计算 RSD074%。表明
供试品在3h内稳定。
2.5 大鼠在体肠吸收
将50只大鼠分为10组:马钱苷高、中、低剂量
组(01,0025,00125mg·mL-1);十二指肠、空肠
及回肠组(0013mg·mL-1);pH6,7,8组(0013
mg·mL-1);诱导剂利福平组(00125mg·
mL-1)。其中诱导剂组循环液含利福平质量浓度为
01mg·mL-1。将大鼠禁食过夜(自由饮水),用
10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0003mL·g-1),固
定,置加热器上随时调温以保持体温。沿腹腔中线
打开腹腔,结扎胆总管,并分离出所需肠段,于切口
处插管(出液口插管约3cm),结扎。首先用适量的
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生理盐水将小肠内容物冲洗干净,然后用预热的37
℃的缓冲液以5mL·min-1的速度恒定流速平衡10
min,再以空气排净,将伤口用浸有生理盐水的脱脂
棉覆盖保湿,于红外灯下保持大鼠体温。各组循环
液30mL保持(37±5)℃恒温,以5mL·min-1循
环10min后,记为0时,后循环液以1mL·min-1的
流速循环160min。分别于20,40,60,80,100,120,
140,160min时于循环液小瓶中取2mL马钱苷样
品,用微孔滤膜过滤后,取滤液1mL进样,测定各时
间点马钱苷的量。另外取05mL滤液测定酚红的
量,同时补加2mL酚红溶液。最后将大鼠处死,取
剪下被灌流肠段,测量肠内径及长度[8]。采用上述
实验方法分别考察马钱苷浓度、pH、肠段及 Pgp各
因素对马钱苷肠道吸收的影响规律。
以马钱苷剩余药量的对数值对取样时间作线性
回归,由斜率求得吸收速率常数 Ka,由剩余药量可
以求得药物吸收量。
3 结果
3.1 pH对马钱苷吸收的影响
肠道平均pH为74,但由于十二指肠与回肠的
pH分别为4~5及6~8。又考虑到药物吸收可能
受到pH的影响,故取质量浓度为0013mg·mL-1
的马钱苷溶液,采用整肠段(十二指肠上部至回肠
下部)循环灌流法,考察循环液在 pH6,7,8条件
时,马钱苷的吸收情况,探讨了 pH对马钱苷吸收的
影响。见表1。
表1 不同pH条件下马钱苷吸收量及吸收速率常数
(珋x±s,n=5)
pH 吸收量/μg·h-1 Ka/×104min-1
6 297±053 059±0085
7 295±055 065±0090
8 303±058 061±0087
  实验结果表明,溶剂的 pH对马钱苷的小肠吸
收在吸收量及吸收速率方面没有显著变化,这可能
与马钱苷具有良好的水溶性有关。
3.2 浓度对马钱苷吸收的影响
由于pH对马钱苷吸收没有显著影响,故选择
循环液pH74的生理条件下,采用整肠段循环灌流
法考察了不同质量浓度(00125,0025,01mg·
mL-1)马钱苷的吸收情况。见表2。
实验结果表明:马钱苷在 00125~01mg·
mL-1,其吸收量与药物浓度呈线性关系(Y=
86067X-58307,r=09993,n=5),且吸收速率
  表2 不同质量浓度马钱苷吸收量及吸收速率常数
(珋x±s,n=5)
质量浓度/mg·mL-1 吸收量/μg·h-1 Ka/×104min-1
00125 633±115 145±020
00250 1405±266 170±025
01000 8047±1543 152±022
常数基本保持不变,符合一级动力学过程。提示马
钱苷的吸收过程为被动扩散过程。
3.3 不同肠段对马钱苷吸收的影响
取质量浓度为0013mg·mL-1的马钱苷溶液,
在循环液pH74条件下,考察马钱苷在小肠不同吸
收部位十二指肠、空肠及回肠的吸收情况,以明确马
钱苷吸收的部位选择性。见表3。
表3 不同肠段马钱苷的吸收量及吸收速率常数
(珋x±s,n=5)
肠段 吸收量/μg·h-1 Ka/×104min-1
十二指肠 346±061 068±0097
空肠   234±042 045±0064
回肠   1892±315 412±0550
  结果表明:马钱苷在肠道循环灌流160min后,
其在各个肠段的吸收量及吸收速率顺序为:回肠 >
十二指肠>空肠,并且回肠的吸收量和吸收速率常
数较十二指肠、空肠有显著提高(P<005)。表明
马钱苷在小肠的吸收具有部位选择性。
3.4 Pgp对马钱苷吸收的影响
取pH74,00125mg·mL-1的马钱苷溶液
(含利福平01mg·mL-1)为循环液,考察利福平
诱导Pgp条件下的马钱苷吸收情况,验证马钱苷的
吸收是否受到Pgp外泵作用影响。见表4。
表4 Pgp诱导剂对马钱苷吸收量及吸收速率常数的影响
(珋x±s,n=5)
Pgp诱导剂 吸收量/μg·h-1 Ka/×104min-1
含利福平  487±079 106±015
不含利福平 633±115 145±020
  结果表明:含利福平组马钱苷溶液在肠道内经过
160min循环灌流后,发现其吸收量及吸收速率均比
马钱苷组有所降低(P<005),说明马钱苷的吸收受
Pgp的外排作用影响,单独使用生物利用度较低。
4 讨论
4.1 酚红标示循环液体积
小肠吸收的过程中,不仅吸收药物也吸收水分,
使供试液的体积减小,故不能用直接计算药物浓度
的方法计算剩余药量。本实验采用在肠道 pH条件
下不被肠道吸收的酚红来标定循环液的体积,进而
更为准确地计算剩余药量。
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4.2 吸收机制
影响口服药物吸收的因素有很多,主要包括药
物浓度、肠道pH、肠段及 Pgp。大多数药物的吸收
都是以被动扩散的形式从高浓度侧向低浓度侧转
运,其扩散方式符合Fick’s第一定律。本实验结果
表明,马钱苷在00125~01mg·mL-1内,其吸收
量与药物浓度呈线性关系,且吸收速率常数基本保
持不变,符合一级动力学过程,提示马钱苷的吸收过
程为被动扩散过程。研究药物吸收机制最终是为制
剂服务,近年来,随着高分子材料学、分子药理学和
系统工程学等学科的发展,药物剂型及制剂研究已
步入药物传递系统时代,缓控释、靶向药物的研制成
为主流[9]。因此,本实验针对择位吸收考察了马钱
苷在肠道内不同肠段的吸收情况,结果表明马钱苷
在回肠段具有吸收部位选择性。提示马钱苷可以通
过漂浮、沉降和黏附滞留技术等方式达到择位给药
以提高其生物利用度的目的。另外,由于很多药物
的吸收会受到一种存在于肠上皮细胞顶端的药物转
运蛋白Pgp外排作用影响而具有较低的生物利用
度,本实验采用 Pgp诱导剂利福平作为对照,结果
显示含利福平组的马钱苷在吸收量及吸收速率两方
面都有显著降低。说明马钱苷为Pgp底物,受到P
gp外泵作用,在临床用药时可联合使用Pgp抑制剂
提高以马钱苷为活性成分的制剂的生物利用度。
[参考文献]
[1] 杜小伟,范力力,王京辉,等.不同产地制山茱萸中马钱苷的含
量测定[J].中国中药杂志,2006,31(17):1466.
[2] 张兰桐,袁志芳,杜英峰,等.山茱萸的研究近况及开发前景
[J].中草药,2004,35(8):953.
[3] 戴建子,张志豪,唐 蕾,等.山茱萸化学成分及药理作用研究
进展[J].中国药业,2006,15(2):74.
[4] RafMols,SvenDeferme,PatrickAugustijns.Sulfasalazinetrans
portinvitro,exvivoandinvivoabsorptionmodels:contributionof
efluxcariersandtheirmodulationbycoadministrationofsynthet
icnatureidenticalfruitextract[J].JPharmPharmacol,2005,
57:1565.
[5] TOgawa,YOhno,TNaganuma,etal.Efectoflectinsonthe
transportoffoodingredientsincaco2celcultues[J].BioFac
tors,2004,21:399.
[6] YayoiNatsume,HideoSatsu,KazushigeKitamuraetal.Assessment
systemfordioxinabsorptioninthesmalintestineandpreventionofits
absorptionbyfoodfactors[J].BioFactors,2004,21:375.
[7] 马 燕.粉防己碱海藻酸钙缓释凝胶小球的研制[D].沈阳:
沈阳药科大学,2003:34.
[8] 汤继辉,胡容峰,常 宫.丹皮酚大鼠在体小肠吸收动力学研
究[J].中国实验方剂学杂志,2006,12(7):36.
[9] 周建平,霍美蓉.现代药剂学研究新进展[J].中国药科大学学
报,2007,38(2):98.
Studiesonabsorptionmechanismofloganininintestinesofrats
LIWenlan1,2,HUZhengting1,JIYubin1,WANGXiaodong1,XUDong1
(1CenterofResearchonLifeSciencesandEnvironmentalSciences,HarbinUniversityofCommerce,Harbin150076,China;
2EngineeringResearchCenterofNaturalAnticancerDrugs,MinistryofEducation,Harbin150076,China)
[Abstract] Objective:Toinvestigatetheabsorptionmechanismofloganinatdiferentintestinesegmentsofratsandtheinflu
enceofthedrugsolutionconcentration,pH,Pgpinductor.Method:Ratswererandomlydividedinto10groups,high,middleand
lowconcentrationgroups(0.1,0.025,0.0125mg·mL-1),duodenum,jejunumandileumgroups(0.013mg·mL-1),high,middle
andlowpHgroups(0.013mg·mL-1),inducergroup(0.013mg·mL-1).Theintestinecannulationwasperformedforinsiturecir
culation.LoganinconcentrationinthefluxwasmeasuredbythereversedphaseHPLC.Result:Whentheconcentrationwasraised
from0.0125to0.1mg·mL-1,theuptakeofloganinwaslinearlyincreased,andnochangeofKaisnotfound.ThepHoffluxhasno
efectondrugabsorption.TheabsorbeddoseandKasequence(fromhightolow)ofloganinatdiferentintestinesegmentsisileum,
duodenum,jejunum.Furthermore,PgpinductorRFPhasefectontheintestinalabsorption.Conclusion:Theabsorptionofloganin
inintestineofratisafirstorderkinetics,theabsorptionmechanismisprobablythepassivedifusion.Ithasspecificabsorptionlocus
andaccesstolocatingadministration,meanwhileit'sthePgpsubstrate,andcouldincreaseitsfractionofbioavailabilitybycorporation
withPgpinhibitor.
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