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Effects of paeoniflorin on pathological changes in global brain ischemia model rats

芍药苷对大鼠全脑缺血模型的影响



全 文 :≈{  潘洪平 o杨嘉珍 o莫祥兰 o等 q葛根素注射液对急性脑缺血模型大鼠 脑细胞损伤的保护作用 ≈ q中国中药杂志 oussxovskyl}wxzq
Εφφεχτσ οφ πυεραριν ον εξπρεσσιον οφ νυχλεαρ φαχτορ καππαΒ
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≈责任编辑 古云侠  
≈收稿日期   ussy2tu2ts
≈通讯作者   3 孙蓉 oר¯}ksxvtl{u|w|{wvoƒ¤¬}ksxvtl{{{zxt|zo∞2°¤¬¯}¶∏±µ²±ªvtuƒ uyvq± ·¨
芍药苷对大鼠全脑缺血模型的影响
孙 蓉 t3 o衣银萍 u o吕丽莉 t o张作平 u o孙 虎 t o刘国卿 v
ktq山东省中医药研究院 o山东 济南 uxsstw~
uq济南杏林生物技术有限公司 o山东 济南 uxsstw~
vq中国药科大学 药理教研室 o江苏 南京 utsss|l
≈摘要   目的 }观察芍药苷对脑缺血后再灌流期间血脑屏障及神经病理改变的影响 ∀方法 }采用四血管阻断
kw∂ ’l全脑缺血再灌流损伤模型 o对模型动物给予芍药苷高 !中 !低剂量 k分别为 usotsox °ª# ®ªpt l静脉注射 o并
设假手术组 o模型组 o阳性对照灯盏花素组 ∀对大鼠神经行为学 o缺血区脑组织超氧化歧化酶 k≥’⁄lo丙二醛
k ⁄„l含量 o透射电镜检查 o血脑屏障通透性 k………lo脑组织兴奋性氨基酸 k∞„„l含量进行检测 ∀结果 }芍药苷对
w∂ ’完全性脑缺血模型有明显的保护作用 ~芍药苷可明显增加大鼠脑组织 ≥’⁄含量 o降低  ⁄„含量 o减轻脑缺血
对脑组织造成的氧化应激损伤 ~芍药苷能显著改善细胞核 !核周质 !线粒体 !髓鞘的病理改变 o对脑缺血发挥保护作
用的形态学基础 ~芍药苷能显著减轻缺血 !缺氧造成的 ∞„„含量增加 o抑制 ∞„„所导致的兴奋性神经毒性 ∀结论 }
芍药苷具有显著的保护脑缺血后脑水肿 !脑组织氧化应激损伤 !细胞超微结构病变 !血脑屏障作用 o其保护机制与
抑制细胞内钙离子超载 !抗自由基 !降低 ∞„„含量有关 ∀
≈关键词   芍药苷 ~脑缺血再灌注损伤 ~血脑屏障
≈中图分类号   • u{xqx ≈文献标识码   „ ≈文章编号   tsst2xvsukusszluv2uxt{2sx
#{txu#
第 vu卷第 uv期
ussz年 tu月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo Œ¶¶∏¨ uv
⁄ ¦¨¨°¥¨ µo ussz
缺血性脑损伤时血管内皮细胞损伤 !血脑屏障
遭破坏产生脑水肿 ~神经细胞 !胶质细胞的膜磷脂损
伤 o≤¤u n o‘¤n流入细胞内 o≤¤u n超载 ~兴奋性氨基酸
谷氨酸 k‘ ⁄„l受体神经毒作用等 o造成神经元损
伤直至死亡 ∀笔者已经进行了芍药苷对局灶性脑缺
血复灌后神经行为学 !脑组织含水量 !病理组织学检
查 !血脑屏障通透性 !脑血流的影响 ≈t  ∀本研究旨
在观察芍药苷对四血管阻断 kw∂ ’l完全性脑缺血模
型 ≈t 复灌后动物神经行为学 !缺血区脑组织 ≥’⁄o
 ⁄„含量 !兴奋性氨基酸检测 o透射电镜观察 !血脑
屏障通透性的影响 o旨在为临床应用芍药苷治疗脑
缺血提供进一步的理论依据 ∀
1 材料
1q1 药品与试剂 氯化硝基四氮唑蓝 k‘…×lk上
海前进试剂厂生产 o批号 usstsxsul~伊文思蓝 k美
国 ≥¬ª°¤公司生产 l~芍药苷 k山东省中医药研究院
分离提供 o纯度  |xh l~注射用灯盏花素 k昆明龙
津药业有限责任公司生产 o批号 sus|t{l∀
1q2 动物 雄性 • ¬¶·¨µ大鼠 o购自山东大学实验动
物中心 o合格证号鲁动质 ussustssv∀
1q3 仪器 …≥uts¶电子天平 k北京塞多利斯有限
公司 l~˜∂ putss型紫外 2可见分光光度计 k中美合
资 ˜‘Œ≤’l~Š…vsv基本型电子天平 k ·¨¯ µ¨2ײ·¤§²
公司 l~电热恒温干燥箱 k上海医用设备厂 l~ {vx p
xs型氨基酸分析测试仪 k日本日立公司 l∀
2 方法
2q1 动物分组与给药方法 取上述 • ¬¶·¤µ大鼠 |s
只 o按体重随机分为 y组 }假手术组 !模型组 !芍药苷
高 !中 !低剂量组分别为 usotsox °ª# ®ªpt !灯盏花
素组 ~阳性对照组按体表面积比值 u倍量折算大鼠
剂量为 | °ª# ®ªpt o按 t °# ®ªpt体积静脉给药 ~
假手术组和模型组按同等体积给予生理盐水静脉注
射 o每日 t次 o连续给药 v §∀
2q2 完全性脑缺血再灌注损伤模型的建立 大鼠
手术前禁食不禁水 { «o采用四血管阻断 kw∂ ’l完全
性脑缺血模型 o轻度乙醚麻醉动物后电凝双侧椎动
脉 ouw «后再将大鼠乙醚麻醉 o仰位固定在恒温手
术台上 o夹闭双侧颈总动脉 t «o然后去除动脉夹恢
复血流 ∀模型成功标准 }夹闭颈总动脉 ts ¶出现翻
正反射消失 !双眼球上翻 !呼吸加深 !竖毛 ∀实验中
死亡 !持续昏睡以及出现抽搐发作的动物均被剔除 ∀
假手术组的大鼠 o不电凝双侧椎动脉 o也不夹闭双侧
颈总动脉 o其余操作相同 ∀手术复灌后逐层缝合局
部组织 !肌肉 !皮下筋膜及皮肤 ~各组均在脑缺血再
灌流 vs °¬±时股静脉注射 uh伊文思蓝 2生理盐水
液 kuxs °ª# ®ªpt l~上述所有药物组大鼠均在手术
复灌同时静脉给药 o假手术组和模型组均给生理盐
水静脉注射 o然后继续给药 u §∀复灌 w{ «后 o进行
各项检查 ∀
2q3 神经行为学评分 手术结束动物完全清醒后 o
立即进行第 t次行为学评分 o手术 uwow{ «后再评
分 t次 o参照全脑缺血组 ¨°¤¼法分级标准 ≈u 和文
献报道的评分标准 ≈w  o进行脑卒中指数评价 o评分
标准见表 t∀
表 t 脑卒中指数评价标准
症状和体征
脑卒中
指数 r分 症状和体征
脑卒中
指数 r分
毛蓬乱竖起 t 动作缓慢或活动减少 t
触耳反应加强 t 头翘起 v
不闭眼睛 v 眼睑下垂 t
后肢向外向后伸展 v 原地转圈 v
抽搐或阵挛 v 四肢无力 y
总分 ux
轻度脑缺血得分  ts 重度脑缺血得分 ∴ ts
2q4 脑组织 ≥’⁄o ⁄„含量的测定 ≈x  在复灌后
w{ «动物断头后取脑缺血组织 o用低温的 °…≥冲洗
u次 o在组织研磨器中打匀浆 o≥’⁄酶活性检测采用
黄嘌呤氧化酶法 o ⁄„活性检测采用硫代巴比妥酸
法 o操作步骤均按试剂盒操作说明书进行 o用紫外 2
可见分光光度计进行测定 ∀
2q5 ××≤染色及脑组织透射电镜检查 脑缺血再
灌注后 o断头处死动物 o取脑 !称重后 o从前向后作 u
°°厚冠状切片共 y片 o放入 uh ××≤的生理盐水
中 ovz ε 避光孵育 vs °¬±o××≤染色标本 o观察梗死
情况 ∀经 ××≤染色后 o正常组织呈红色 o梗死组织
为白色 ∀
取材 }根据 ××≤染色结果 o判断缺血部位 o准确
地在所需部位剪取 x °°v大小的组织 o投入 uh戊二
醛 2 ¬¯¯²±¬ª固定液中 w «以上 ∀漂洗 }用缓冲液充
分洗涤 o每次 tx °¬±o连续 w次 o将残存的戊二醛洗
掉 o以免与锇酸发生反应 o生成沉淀 o影响观察 ∀后
固定 }以 th 锇酸固定 t ∗ u «o期间摇荡 w次 ∀漂
洗 }用缓冲液洗涤 vs °¬±o要充分洗涤 o以免固定液
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残留在细胞内而影响酶的活性 ∀脱水 }丙酮或乙醇
逐级脱水 oxsh ozsh o|sh otssh ´ otssh µ o
tssh ¶ o每个浓度 tx °¬±∀ tssh脱水剂之前所用
器皿要全部加热烤干 o更换脱水剂时要避免组织表
面干燥 o做到迅速 ∀还氧丙烷置换 }用纯还氧丙烷 o
每次 tx °¬±o连续 u次 o置换出组织中的丙酮或乙
醇 ∀浸透 }还氧丙烷 Β树脂 € tΒtot «~还氧丙烷 Β树
脂 €tΒuou «~纯树脂 v «以上 ∀包埋 }快速包埋 o避
免标本表面干燥 ∀聚合 }zs ε o{ «∀修块 !切片 }首
先暴露出组织 o修成长方形 o进行超薄切片 ∀染色 !
检查 }先铀染 vs °¬±o再铅染 ts ∗ tx °¬±o以备电镜
检查 ∀
2q6 伊文思蓝含量测定 伊文氏蓝用生理盐水稀
释成 uh溶液 o使用前测定其标准曲线 ≈y  ∀在复灌
后 w{ «取脑 !精密称取 u ªo剪碎后用组织研磨器初
步研磨 o加入 tsh三氯醋酸沉淀蛋白质 o再用无水
乙醇打匀浆 o以 x sss µ# °¬±pt反复离心 !洗涤 v次 o
然后用 vs倍于脑组织质量的浓氨水提取组织内伊
文氏蓝 o取上清液在 yss ±°测定吸收度 kΑlo空白
对照液用氨水 !冰醋酸和乙醇配成 ∀根据标准曲线
求得伊文氏蓝含量 kΛª# ªpt湿重 l∀
2q7 兴奋性氨基酸含量测定 ≈z  ∞„„主要包括谷
氨酸 kŠ ∏¯l和天门冬氨酸 k„¶³lu种 o是中枢内的兴
奋性神经递质 ∀在复灌后 w{ «动物断头后取脑缺
血组织 o称重 o加 wh磺基水杨酸 x °匀浆 o置高速
冷冻离心机以 x sss µ# °¬±pt离心 ots °¬±后取上
清液上机待测 ∞„„含量 ∀用氨基酸分析测试仪测
定 o计算机控制自动进样 ∀
2q8 统计方法 实验数据以 cξ ? σ表示 o采用组间 τ
检验 ∀
3 结果
3q1 神经行为学评价 结果表明 }完全性脑缺血模
型组大鼠神经行为学有明显改变 o与假手术组比较
有极显著性差异 o说明造模成功 ∀芍药苷高 !中 !低
剂量对完全性脑缺血模型大鼠神经行为学有不同程
度地改善作用 o与模型组比较分别有非常显著性差
异和显著性差异 ∀提示给大鼠静注芍药苷后 o对
w∂ ’全脑缺血模型有明显的保护作用 ∀见表 u∀
3q2 脑组织 ≥’⁄o ⁄„含量的影响 结果表明 }完
全性脑缺血模型组大鼠脑组织 ≥’⁄含量明显降低 o
 ⁄„含量明显增加 o与假手术对照组比较有极显著
性差异 o说明造模成功 ∀芍药苷高剂量对模型大鼠
表 u 芍药苷对完全性脑缺血模型大鼠不同时间的
脑卒中指数的影响 kcξ ? σ, ν € tsl
组别
剂量
r°ª# ®ªpt
术后清醒
即刻
术后 uw « 术后 w{ «
假手术 p s1w ? s1x s1u ? s1w s1t ? s1v
脑缺血模型 p x1u ? t1xul y1s ? t1wul x1| ? t1wul
灯盏花素 | v1z ? t1zuovl w1u ? t1uuowl w1v ? t1vuovl
芍药苷 us u1| ? s1|uowl v1v ? t1ytoxl v1v ? t1uuoxl
ts v1w ? s1{uovl w1s ? t1uuowl w1t ? t1vuowl
x w1u ? t1xuovl w1w ? t1xuovl w1x ? t1wuovl
注 }与假手术组比 tl Π  s1stoul Π  s1sst~与模型组比 vl Π 
s1sxowl Π  s1stoxl Π  s1sst
脑组织 ≥’⁄含量有明显的增强作用 ~对  ⁄„含量
有明显的降低作用 o与造模对照组比较有非常显著
性差异 ∀芍药苷中 !低剂量对模型大鼠脑组织 ≥’⁄
含量有不同程度的增加作用 o与模型组比较分别有
非常显著性和显著性差异 ~对  ⁄„含量有明显的
降低作用 o与造模对照组比较分别有非常显著性差
异和呈现一定的作用趋势 ∀提示给大鼠静注芍药苷
后 o能够减轻脑缺血对脑组织造成的氧化应激损伤 o
从而发挥对脑缺血的保护作用 ∀见表 v∀
表 v 芍药苷对完全性脑缺血模型大鼠脑组织内 ≥’⁄和
 ⁄„含量的影响 kcξ ? σ, ν € tsl
组别
剂量
r°ª# ®ªpt
≥’⁄
r±˜# °pt
 ⁄„
r±°²¯# pt
假手术 p ts1tx ? u1xzvl t{x1zt ? vz1vv
脑缺血模型 p v1uv ? t1|ttoxl uzu1zt ? wv1{vvl
灯盏花素 | x1{z ? u1vxuoxl uvz1vu ? ux1tvxl
芍药苷 us z1st ? u1{zvowl usz1vx ? vz1wxtoxl
ts y1xw ? u1uxuowl uuv1|u ? u|1zyvl
x x1vv ? t1y|vl uxs1|x ? u{1xxuowl
注 }与假手术组比 tl Π  s1sxoul Π  s1stovl Π  s1sst~与模型组
比 wl Π  s1sxoxl Π  s1st
3q3 脑组织电镜检查结果 假手术组 }神经细胞核
规整 o核膜呈现双层膜结构 o核内染色质淡染 !分布
均匀 ∀核周质 }均匀分布 o淡染 o细胞器正常 ∀线粒
体 }双层膜结构 o内膜向内反复折叠形成嵴 o嵴无肿
胀缩短 o线粒体内染色均匀 o无絮状物 ∀髓鞘 }板层
结构 o排列有序 ∀粗面内质网 }板层结构 o无扩张 !断
裂 ∀核糖体 }均匀附着 ∀
脑缺血模型组 }神经细胞核 }核膜部分不清晰 o
核周间隙扩大 o核内染色质增多 !深染 !浓聚 !向边际
靠拢 ∀核周质 }溶解 !崩解 !趋于坏死 o内部细胞器消
失 ∀线粒体 }双层膜不清晰 o肿胀嵴变短 !有短裂 o基
质不透明 o含有电子致密物 ∀髓鞘 }板层结构排列紊
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乱 o有脱髓鞘现象 ∀粗面内质网 }板层结构排列尚整
齐 o但有断裂现象 ∀核糖体 }基本正常 o滑面内质网 }
扩张明显 ∀
芍药苷高 !中 !低剂量均能显著改善细胞核 !核
周质 !线粒体 !髓鞘的病理改变 !但对粗面内质网和
滑面内质网的影响不明显 o表现在细胞核浓缩现象
减少 o线粒体结构趋于正常 o脱髓现象大大减少 ∀提
示给大鼠静注芍药苷后 o能够减轻模型动物脑组织
超微结构的病理学改变 o这是对脑缺血发挥保护作
用的形态学基础 ∀
3q4 对 ………损害程度的影响 结果表明 }完全性
脑缺血模型对照组大鼠由于 ………通透性增强 o导致
脑组织伊文思蓝含量明显增加 o与假手术对照组比
较有极显著性差异 o说明造模成功 ∀芍药苷高 !中 !
低剂量对模型大鼠脑组织伊文思蓝含量增加有不同
程度的降低作用 o与模型组比较分别有非常显著性 !
显著性差异和呈现一定的作用趋势 ∀提示给大鼠静
注芍药苷后 o能够减轻缺血 !缺氧造成的 ………通透
性增高 o从而降低脑细胞的水肿程度 o发挥对脑缺血
的保护作用 ∀见表 w∀
表 w 芍药苷对完全性脑缺血模型大鼠脑血流量和
………通透性的影响 kcξ ? σ, ν € tsl
组别 剂量 r°ª# ®ªpt 伊文思蓝 rΛª# ªpt湿重
假手术 p u1{{ ? s1{|
模型 p x1xv ? t1zzvl
灯盏花素 |qs v1{{ ? s1zstowl
芍药苷 us v1w{ ? t1tvxl
ts v1{w ? s1|ttowl
x w1v{ ? s1{wul
注 }与假手术组比 tl Π  s1sxoul Π  s1stovl Π  s1sst~与模型
组比 wl Π  s1sxoxl Π  s1st
3q5 对脑组织 ∞„„含量的影响 结果表明 }完全性
脑缺血模型组大鼠脑组织谷氨酸和天冬氨酸含量均
明显增高 o与假手术对照组比较有极显著性差异和非
常显著性差异 o说明造模成功 ∀芍药苷高 !中 !低剂量
对模型大鼠脑组织谷氨酸和天冬氨酸含量增加有不
同程度的降低作用 o与模型组比较分别有极显著性 !
非常显著性 !显著性差异和呈现一定的作用趋势 ∀提
示给大鼠静注芍药苷后 o能够减轻缺血 !缺氧造成的
∞„„含量增加 o抑制 ∞„„所导致的兴奋性神经毒性 o
从而发挥对脑缺血的保护作用 ∀见表 x∀
4 讨论
脑缺血产生大量自由基与脑组织生物膜不饱和
表 x 芍药苷对完全性脑缺血模型大鼠脑组织内 ∞„„含量
的影响 kcξ ? σ, ν € tsl
组别
剂量
r°ª# ®ªpt
谷氨酸
rΛ°²¯# ªpt
天门冬氨酸
rΛ°²¯# ªpt
假手术 p tw1wu ? u1s{ u1yx ? s1zx
模型 p us1{{ ? u1|xvl w1sw ? s1|tul
灯盏花素 | tz1sx ? u1u{toxl v1tz ? s1wvwl
芍药苷 us tx1wz ? u1ssyl u1{t ? s1w{xl
ts ty1{v ? u1x{toxl v1uu ? s1ytwl
x tz1yz ? u1|xtowl v1vs ? s1y|
注 }与假手术组比 tl Π  s1sxoul Π  s1stovl Π  s1sst~与模型组
比 wl Π  s1sxoxl Π  s1stoyl Π  s1sst
脂肪酸发生脂质过氧化连锁反应 o产生大量的
 ⁄„o使脑组织生物膜结构与功能受到损伤 o蛋白
质则发生变性失活 o⁄‘„多核苷酸主链断裂 o碱基
发生修饰 o膜通透性 !离子转运 !膜屏障功能及生物
功能均受影响 o继而出现血管内皮细胞损伤 !血脑屏
障遭破坏产生脑水肿 ~神经细胞 !胶质细胞的膜磷脂
损伤 o≤¤u n !‘¤n流入细胞内 o≤¤u n超载 ~兴奋性氨基
酸 ‘ ⁄„受体神经毒作用等 o造成神经元损伤直至
死亡 ∀本研究结果证实 o芍药苷能增加缺血脑组织
区域的 ≥’⁄含量 o减少  ⁄„含量 o提示芍药苷可抑
制脑缺血后脑内自由基的产生 o提高脑缺血后脑内
≥’⁄的活性 o降低  ⁄„含量 o从而保护脑缺血后继
发神经元的损伤 ∀
Š ∏¯和 „¶³是中枢神经系统内含量最高 o分布
最广泛的 ∞„„类神经递质 ∀现代研究认为 ≈{  ∞„„
在缺氧 !缺血 !持续癫痫 !脑外伤等所致急性神经元
损伤中起着关键性作用 ∀病理状态下细胞外 ∞„„
大量增加 ∀已有研究认为 ≈vots2tu  o∞„„只有在细胞
外液才有兴奋毒性作用 }一是脑缺血时 o激活 „ °„
受体通道开放 o使细胞内能量和 „×°耗尽 o细胞外
Žn浓度增加 o导致细胞膜去极化 o‘¤n在细胞内堆
积 o≤ p¯和 ‹u ’往细胞内流 o造成以神经元水肿为特
征的急性过程 ~二是通过激活 ∞„„受体 o直接或间
接启动电压依赖性和 ‘ ⁄„受体相关的 ≤¤u n通道 o
大量 ≤¤u n内流 o从而介导了细胞内一系列依赖 ≤¤u n
的生化反应 o引起 ⁄‘„!蛋白质 !磷脂降解 o氧自由
基形成 o线粒体功能障碍 o能量耗竭 o导致神经元逐
步变性 !坏死 ∀通过 ‘ ⁄„受体介导的 ≤¤u n内流在
Š ∏¯神经毒性机制中起了关键作用 ∀
本实验结果证实在大鼠缺血性脑组织中 oŠ ∏¯o
„¶³升高均有非常显著性差异 ∀芍药苷通过改善脑
组织 µ≤…ƒo使脑缺血 !缺氧时能量代谢障碍得到缓
#tuxu#
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⁄ ¦¨¨°¥¨ µo ussz
解 o„×°合成减少得到改善 o能显著降低缺血区脑组
织中的 ∞„„o从而阻断或减弱 ∞„„造成的氧化应激
损伤的级联反应 o抑制 ‘¤n !≤ p¯ !水的大量内流 o改
善细胞肿胀和坏死程度 o保护脑缺血后所造成的继
发性神经元损伤 ∀
本研究证实 o脂质过氧化反应是脑缺血后再灌
注损伤的主要发病机制 o脑缺血后再灌注损伤可以
导致 ………的损害 o使得 ………通透性增加 o进一步加
重脑水肿和氧化应激性损伤的级联反应 ∀本研究数
据和超微结构改变结果显示 o完全性脑缺血动物给
芍药苷可以明显改善神经行为学症状 !血脑屏障通
透性 o脑组织内 ≥’⁄o ⁄„水平 o降低 ∞„„含量 o从
而在多途径显示对完全性脑缺血损伤有明显的保护
作用 o其保护机制可能与下列因素有关 }抑制细胞内
钙离子超载 !抗自由基 !降低 ∞„„含量 ~但是抑制细
胞内钙超载的机制 o对 ………上 °2ª³表达和功能的
作用机制还有待于进一步探讨 ∀
≈参考文献  
≈t  孙 蓉 o吕丽莉 o刘国卿 q芍药苷对不全性脑缺血再灌注损伤
模型 ⁄‘⁄脑能量代谢 !‘’和 ‘’≥的影响 ≈  q中国中药杂
志 oussyovtktsl}{vuq
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≈x  陈春富 o常高峰 o郭述芳 o等 q大鼠完全性脑缺血再灌注损伤
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≈y  熊 文 q谷氨酸对原代培养海马神经细胞兴奋毒作用的研究
≈ q白求恩医科大学学报 ot||zouvkyl}yssq
≈z  朱国行 q脑水肿的研究进展 ≈  q国外医学 # 脑血管疾病分
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≈|  李炜如 q兴奋性氨基酸及钙离子内流在缺血缺氧性脑损伤中
的作用 ≈ q中国实用儿科杂志 ot||zotukwl}uwxq
≈ts  梁英武 q八肽胆囊收缩素对谷氨酸神经毒性的拮抗作用 ≈ q
北京医科大学学报 ot||you{kxl}vy{q
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≈责任编辑 古云侠  
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第 vu卷第 uv期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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