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Study on effect of Sho saiko to compound on growth of
nasopharyngeal carcinoma cells in CNE bearing nude mice

小柴胡汤对鼻咽癌细胞生长的抑制作用



全 文 :EfectofGualouXiebai(GLXB)decoctiononplateletderivedgrowth
factorBB(PDGFBB)expressioninlungsfrombleomycinA5induced
pulmonaryfibrosisinrats
LIRuiqin1,XIAOHong2,ZHANGRui1,LIWei1,SONGJianping
(1HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450008,China;
2HenanWorkersColegeofMedicine,Zhengzhou450008,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatetheefectandmechanismofGualouXiebai(GLXB)decoctiononpulmonaryfibrosis.
Method:PulmonaryfibrosiswasinducedbybleomycinA5inSDrats.RatsintreatmentgroupwerekiledafterbeingtreatedbyGLXB
bydecoctiondailyfor28days.Thelungsofalratswereharvestedforhistopathologicalstudies.Thecontentsofplateletderivedgrowth
factorBB(PDGFBB)inlungsweremeasuredandcompared.Result:ThecontentsofPDGFBBinlungshaveincreasedsignificantly
inmodelgroupcomparedwithnormalgroupandtreatmentgroup(P<005).Conclusion:GLXBdecoctioncouldsignificantlyalevi
atetheincreasedPDGFBBexpressioninlungsofpulmonaryfibrosisrats.
[Keywords] pulmonaryfibrosis;plateletderivedgrowthfactorBB(PDGFBB);GualouXiebaidecoction
[责任编辑 古云侠]
[收稿日期] 20080410
[基金项目] 2007年国家大学生创新训练计划项目;2005年中山大学第一批学生科研基金项目(1163166);2005年中山大学实验室开放
基金项目(KF2005017)
[通讯作者] 杨惠玲,Tel:(020)87332626,Email:hlyang@gzsumseducn
小柴胡汤对鼻咽癌细胞生长的抑制作用
林子洪1,夏洪平2,傅 明1,廖威明1,林 调3,陈新桂3,
王海新3,杨惠玲2
(1.中山大学 附属第一医院 关节外科,广东 广州 510080;
2.中山大学 病理生理学教研室,广东 广州 510080;
3.中山大学 中山医学院,广东 广州 510080)
[摘要] 目的:探讨复方小柴胡汤对鼻咽癌高分化鳞癌细胞株1(nasopharyngealcarcinomacelline,CNE1)和
鼻咽癌低分化鳞癌细胞株2(CNE2)生长的抑制作用,试图为该药物的临床开发与应用提供实验数据。方法:按浓
度梯度配置复方小柴胡汤,用MTT实验检测不同浓度复方小柴胡汤对CNE1/2细胞生长的影响,同时运用软琼脂
克隆形成实验检测其对CNE1/2细胞增殖能力的影响;在BALB/cAnu裸鼠右背后皮下接种对数生长期细胞悬液
(5×105个/mL)02mL,成功复制肿瘤模型后随机分为5组,每组8只,于次日复方小柴胡汤按05,025,0125g
·mL-1高、中、低3个剂量给药,同时设阳性对照组和阴性对照组,连续给药15d后,测量肿瘤的体积和质量,计算
体积抑制率和瘤重抑制率,研究复方小柴胡汤对CNE2细胞裸鼠移植瘤的抑制作用。结果:MTT法和克隆形成实
验结果提示,与阴性对照组相比,不同浓度的复方小柴胡汤处理CNE1和CNE2细胞24,48,72h,发现对两株的细
胞生长和增殖能力均存在不同程度的抑制作用,并随药物浓度和作用时间的增加而增强,两者结果显示其半数抑
制浓度约为25g·L-1;与阴性对照组比较,裸鼠体内抑瘤实验发现给复方小柴胡汤治疗组裸鼠肿瘤生长速度明
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显减慢,阴性对照组(076±028)g,(96288±24596)mm3和复方小柴胡汤低浓度治疗组(088±040)g,
(123966±42193)mm3肿瘤生长明显快于高、中浓度治疗组(022±014)g,(23931±13707)mm3;(020±
016)g,(26342±16657)mm3及CTX阳性对照组(020±010)g,(24672±1946)mm3(P<005)。结论:复
方小柴胡汤能抑制鼻咽癌CNE1和CNE2细胞的生长、增殖,对CNE2裸鼠移植瘤的生长有抑制作用。
[关键词] 复方小柴胡汤;鼻咽癌;裸鼠移植瘤
[中图分类号]R735.905.3 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)22267005
  鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)又称
“广东癌”,是一种发生于鼻咽上皮细胞的恶性肿
瘤,它有很显著的种族和地区分布差异,流行于中国
南方和东南亚,并且在这些地区引起了非常严重的
健康问题。临床上首选的放疗疗法虽几经改良,甚
至与化疗等联合应用,但由于非特异毒性、放疗耐受
和远处转移等弊端,严重制约NPC病人5年生存率
的提高[12]。因此,鼻咽癌的中药辅助治疗一直引起
人们的广泛重视。
近年来中医药治疗恶性肿瘤,在改善症状,提高
生活质量,稳定缩小癌灶,延长生存期等方面的优势
已得到国内和国际同仁的广泛认可[34]。最近笔者
发现一种新的复方能减轻肝癌患者经肝动脉介入化
疗栓塞术后的反应,促进肝功能的恢复,提高患者的
生存质量,该复方小柴胡汤由莪术等多味中药按传
统中医理论配伍组成[5],同时根据临床经验其可以
巩固和辅助恶性肿瘤放化疗的效果,但该复方小柴
胡汤对鼻咽癌的作用如何,尚未见有关报道。本实
验拟通过体内外实验探讨该复方小柴胡汤对鼻咽癌
的抑瘤作用,为阐明该复方小柴胡汤治疗鼻咽癌及
其相应的临床开发应用等提供实验依据。
1 材料
1.1 细胞和动物 NPC高分化鳞癌细胞 CNE1和
低分化鳞癌细胞 CNE2,由中山大学实验动物中心
提供,用含 10%胎牛血清的 RPMI1640培养液培
养;4~6周龄的BALB/cAnu裸鼠40只,体重14~
16g,SPF级,雌雄各半,由中山大学实验动物中心
提供。合格证号SCXK(粤)120040011。
1.2 药物 复方小柴胡汤组方:莪术15g、柴胡10
g、黄芩10g、半夏15g、党参30g、甘草5g、大枣10
g、生姜6g。制备方法:加8倍量的水,水蒸气蒸馏
提取2次,每次2h,药渣与挥发油合并共煮,加8倍
量的水提取2次,每次2h,浓缩,浓缩液合并得含挥
发油的合并液,得率约60%。药物由广州中医药大
学药物化学专业人员制成每毫升含1g生药的含挥
发油的浸膏,置于4℃冰箱保存备用。药材鉴定由
中山大学附属第一医院药学部黄红中助理研究员鉴
定均为正品。
1.3 试剂 环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)(江
苏恒瑞股份有限公司);四甲基偶氮唑蓝[3(4,5
dimethylthiazolyl2)2,5diphenyltetrazoliumbromide,
MTT]、二甲亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)、琼脂
糖、piodonitrotetrazoliumviolet1g·L-1和姬姆萨染
液均购自Sigma公司。
1.4 仪器 Motic数码互动实验由本校形态学实验
提供,CO2恒温培养箱(德国 Heraeus公司),Univer
sal32R离心机(德国),DK-8D型电热恒温水槽
(上海),680型全自动酶标仪(美国BioRad公司)。
2 方法
2.1 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测细胞存活情况 
取对数生长期的 CNE1和 CNE2细胞常规胰酶消
化后,离心,用含10%胎牛血清的 RPMI1640配成
5×104个/mL细胞悬液;将细胞以适当的密度
(5000个/孔)接种于用 96孔培养板中,每孔 100
μL,37℃,5%CO2孵箱中培养12h,待细胞贴壁;每
孔加入复方小柴胡汤(分别含生药 20,10,5,25,
125,0625,03125g·L-1)与无血清的 RPMI
1640培养液,每组6个平行孔,共3块培养板,置培
养箱中继续培养;在 24,48,72h后分别取出一块
板,每孔加入5g·L-1的MTT20μL,继续培养约4
h;加入 DMSO溶解结晶:吸出培养液后,加入 150
μL/孔DMSO,室温下振荡10min,待紫蓝色结晶完
全溶解后,在自动酶标仪上测定各孔的570nm处的
吸光度(A);按以下公式计算每孔的抑制率[4]。
抑制率(%)=A对照 -A实验/A对照 ×100%
2.2 软琼脂克隆实验 称取07g和035g琼脂
糖,分别加入50mL三蒸水,高压蒸气灭菌。溶解后
即为14%和07%的琼脂糖溶液。置于45℃烤
箱中待用;制备2倍的 RPMI1640培养液(含20%
新生牛血清以及2倍双抗),并用其对倍稀释配制
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10,5,25,125,0625g·L-1的复方小柴胡汤。对
照组为2倍的RPMI1640培养液;制备下层琼脂糖:
取6支离心管,每管中加入500μL含有上述浓度的
药物或培养液。每管中再加入500μL14%琼脂糖
溶液,迅速混匀后加入24孔板中,每孔500μL,每
组两孔;制备上层琼脂糖:①再取6支离心管,各管
中加入440μL含有上述浓度的药物或培养液;②取
培养至对数生长期的CNE1和CNE2细胞,消化成
单个细胞,离心,用适当的培养液重悬至1×105/mL,
在上述离心管中加入60μL/管 (3000个/孔);③取
出07%的琼脂糖溶液,在超净工作台中放置片刻,等
冷至40℃时,加入离心管,500μL/管,吹打均匀,迅
速加入24孔板,500μL/孔;放置37℃,5%CO2的培
养箱培养10~14d;染色并观察:用1g·L-1的碘硝
基氯化四氮唑进行染色,每孔加入01mL染色液,置
培养箱中放置过夜;计数集落形成数:低倍镜(4×物
镜)视野下在每孔的四角和中心随机选取5个视野,
计数直径大于10μm的集落数量[4]。
2.3 复方小柴胡汤对 CNE2裸鼠移植瘤模型的体
内抑瘤实验 用蒸馏水将复方小柴胡汤原药(1g·
mL-1)分别配成每毫升含05,025,0125g生药的
高、中、低3个剂量药液,4℃冰箱保存,用时摇匀。
取对数生长期的 CNE2细胞常规胰酶消化后,离
心,用无血清的 RPMI1640培养液配成5×105个/
mL细胞悬液,小鼠右背后皮下接种,接种体积02
mL/只。造模成功后随机分为5组,每组8只,接种
次日复方小柴胡汤分高、中、低 3个剂量灌胃给药
(002mL·g-1),模型组用同等量经消毒的水灌
胃,阳性药物组采用 CTX腹腔注射,每次20mg·
kg-1,2次/周,连续给药15d。每3d测量肿瘤的长
径(L)和宽径(D)一次,按照公式如下公式计算肿
瘤体积(V=πLD2/6);接种 CNE2细胞16d,颈椎
脱臼处死裸鼠,将肿瘤取出拍照、称重。肿瘤体积和
剥离肿瘤重量的差异运用SPSS120作单因素方差
分析[67]。
2.4 统计学方法 实验计量数据用 SPSS120统
计软件进行方差分析(OnewayANOVA),两两比较
采用LSD(方差齐性)或 Dunet'sT3(方差不齐),实
验数据用 珋x±s表示,针对 MTT法测的抑制率运用
PearsonCorelation进行相关性检测和 LinearLoga
rithmic模型检测其曲线回归效应,检验水准 P<
005为有显著性差异。
3 结果
3.1 复方小柴胡汤对CNE1和CNE2细胞生长的
影响 将7个不同浓度的复方小柴胡汤分别作用于
CNE1和CNE2细胞24,48,72h,用MTT法检测药
物作用后CNE1和CNE2细胞的存活情况,发现复
方小柴胡汤对两株细胞均存在不同程度的抑制作
用,其药效随药物浓度和作用时间的增加而明显增
强,其半数抑制浓度约为25g·L-1(表1)。
表1 复方小柴胡汤对CNE1和CNE2细胞的抑制率(珋x±s)
剂量
/g·L-1
CNE1细胞的抑制率/%
24h 48h 72h
CNE2细胞的抑制率/%
24h 48h 72h
03125 -512±640 041±724 -015±480 -679±1256 -040±465 200±416
0625 1083±522 143±715 2348±379  883±1186 1228±493 1399±599
125 2851±1137 2847±483 428±730 2740±1447 2506±481 3661±714
25 4807±357 4045±816 5324±518 5143±1028 3765±423 5145±265
5 5868±399 6082±299 7138±246 6045±728 5851±420 5956±308
10 6939±274 8157±473 8667±203 6797±774 7454±347 8369±314
20 7947±211 8863±177 9136±279 8365±174 8760±453 8933±392
3.2 复方小柴胡汤对CNE1和CNE2细胞增殖的
影响 软琼脂克隆形成试验发现与对照组相比,5个
不同浓度复方小柴胡汤处理细胞24,48,72h后,药物
处理组的集落形成的数目随着剂量的增加而减少,高
浓度处理组的集落形成的数目明显减少(P<001)。
低浓度处理组虽在形成集落的数量上与对照组相仿,
但可见其集落略小于对照组的平均水平。由结果可
见其半数抑制浓度约为25g·L-1(表2)。
表2 复方小柴胡汤对CNE1和CNE2细胞增殖
的影响(珋x±s)
组别
剂量
/g·L-1
CNE1 CNE2
阴性     - 956±30 823±30
复方小柴胡汤 0625 803±401) 723±351)
  125 617±361) 543±191)
  25 543±331) 437±281)
  5 307±301) 257±181)
  10 173±141) 157±201)
  注:与阴性组比较1)P<005
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3.3 复方小柴胡汤对 CNE2裸鼠移植瘤生长的影
响 在BALB/c裸小鼠背部皮下接种了CNE2细胞
成功造模后的第3天,各组均可在种植局部触摸到
新生的肿瘤组织,每隔3d用游标卡尺测量肿瘤的
长、短径来估计肿瘤的体积,发现模型组和复方小柴
胡汤低浓度组肿瘤生长明显快于复方小柴胡汤高、
中治疗组及 CTX治疗组,差异有统计学差异(P<
005)(表3)。种植肿瘤15d后,将肿瘤组织剥离,
切取部分组织做 HE染色,证实所切取的是 NPC组
织(图1)。除CTX组有一只无肿瘤生长外,各只存
活的裸鼠均有肿瘤生长,将剥离的肿瘤组织称重,发
现模型组和复方小柴胡汤低浓度治疗组的肿瘤大小
大于复方小柴胡汤高和中浓度治疗组及CTX组,差
异亦有统计学意义(P<005)(表4)。
表3 复方小柴胡汤对CNE2裸鼠移植瘤体积的影响(珋x±s,n=8)
组别
剂量
/g·kg-1
CNE2移植瘤/mm3
3d 6d 9d 12d 15d
模型 - 788±603 5822±3489 15676±7724 48183±15720 96288±24596
CTX - 029±0581,2) 800±9511,2) 3235±34291,2) 9989±85171,2) 24672±19461,2)
复方小柴胡汤 25 788±575 6828±4296 16864±8444 63827±33210 123966±42193
  5 020±0381,2) 756±6661,2) 2973±24311,2) 10489±67341,2) 26342±166571,2)
  10 054±1011,2) 932±8231,2) 4611±39241,2) 12101±75021,2) 23931±137071,2)
  注:与阴性组比1)P<005;与低浓度治疗组比较2)P<005(表4同)
图1 NPC肿瘤组织HE染色图
表4 复方小柴胡汤对CNE2接种裸鼠15d后
肿瘤的抑制作用(珋x±s,n=8)
组别
剂量
/g·kg-1
瘤重
/g
抑制率
/%
模型 - 076±028 -
CTX - 020±0101,2) 73681,2)
复方小柴胡汤 25 088±040 -1579
  5 022±0141,2) 71051,2)
  10 020±0161,2) 73681,2)
4 讨论
复方小柴胡汤对经肝动脉介入化疗栓塞术后的
肝癌患者的临床研究表明其可减少反应,促进肝功
能的恢复,提高患者的生存质量,改善肌体内环境,
提高放化疗的完成率,控制肿瘤的复发与转移,改善
生存质量。
在体外实验中,与模型组相比,不同剂量的复方
小柴胡汤处理CNE1和CNE2细胞24,48,72h,发
现对两株细胞的生长和增殖能力均存在不同程度的
抑制作用,并随药物浓度和作用时间的增加而增强,
两者结果显示其半数抑制浓度约为25g·L-1,而
在最低03125g·L-1时,复方小柴胡汤对 CNE1
和CNE2细胞的抑制率部分为负值,可能是由于体
外中药低度刺激癌细胞增殖导致抑制效果下降,结
合体内实验及绝大部分体外实验可以获得其抑制
CNE细胞生长的证据。体内实验中,经肿瘤组织
HE染色切片证实为 NPC肿瘤组织,保证了实验的
可靠性,与模型组比较,复方小柴胡汤中、高剂量组
可使裸鼠 CNE2移植瘤生长速度明显减慢(P<
005)。以上资料表明该复方有希望作为一种用于
NPC治疗的新复方中药,至于该复方小柴胡汤通过
什么靶点或信号通路发挥作用,值得进一步探讨。
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StudyonefectofShosaikotocompoundongrowthof
nasopharyngealcarcinomacelsinCNEbearingnudemice
LINZihong1,XIAHongping,FUming1,LIAOWeiming1,LINTiao3,CHENXingui3,
WANGHaixin3,YANGHuiling2
(1.DepartmentofJointSurgery,FirstAfiliatedHospital,SunYatsenUniversity,Guangzhou510080,China;
2.DepartmentofPathophysiology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYatsenUniversity,Guangzhou510080,China;
3.ZhongshanSchoolofMedicine,SunYatsenUniversity,Guangzhou510080,China)
[Abstract] Objective:Toinvestigatetheroleofshosaikotocompound(SSTC)onthegrowthoftheweldiferentiatedsqua
mouscelline1ofnasopharyngealcarcinoma(CNE1)andweldiferentiatedCNE2intumorbearingnudemouse,andtrytosupply
scientificdataforitsclinicaldevelopment.Method:SSTCwerepreparedbyconcentrationgradients,andtheefectofSSTConthe
growthandproliferationoftheCNE1andCNE2wereinvestigatedbyMTTassayandsoftagarcolonyformationtest.Aftersetingup
thesubcutaneoustumorbearingnudemousemodelattherightlowerback(02mLCNE2celsuspension,5×105/mL),werandom
lydividedfortymiceinto5groupsandgavehigh,middleandlowconcentrationgroupsofSSTC(05,025,0125g·mL-1)byin
tragastricadministration.Positiveandnegativegroupsweresetupforcomparison.Afterconstantadministrationfor15days,thevol
umeandweightofthetumorweremeasuredforinhibitionrate,soastoinvestigatetheroleofSSTContheCNE2bearingtumor.Re
sult:Invitro,comparedwithnegativecontrol,SSTCatdiferentgradientconcentrationswereculturedwiththeCNE1andCNE2for
24h,48hand72h.Itshowedthatthegrowthandproliferationofbothcellineswereinhibitedtosomeextent.Theinhibitionratewas
increasedastheconcentrationandculturetimeincreasing.BothMTTassayandsoftagarcolonyformationtestshowedthatthe50% in
hibitingconcentration(IC50)wasabout25g·L
-1.Invivo,comparedwithnegativecontrol,theSSTCcouldslowdownthetumor
growthintheSSTCtreatedgroups.Thetumorgrowthofthenegativecontrolgroup(076±028)g,(96288±24596)mm3andthe
lowconcentrationgroupofSSTC(088±040)g,(123966±42193)mm3wereobviouslyfasterthanthoseofthehigh,middle
concentrationgroupofSSTC(022±014)g,(23931±13707)mm3;(020±016)g,(26342±16657)mm3andCTXpos
itivecontrolgroup(020±010)g,(24672±1946)mm3(P<005).Conclusion:SSTCcouldeficientlyinhibitthegrowthand
proliferationofCNE1andCNE2invitro,andslowdownthetumorgrowthoftheCNE2bearingnudemice.Itmaybeanewcom
poundofChinesemedicinefornasopharyngealcarcinomatherapy.
[Keywords] Shosaikotocompound;nasopharyngealcarcinoma;tumorbearingnudemice
[责任编辑 古云侠]
征稿启事
《中医药通报》是中华中医药学会主办的系列杂志之一,为国内外公开发行的综合性中医药学术期刊。本刊的办刊方针
和任务是:全面报道我国中医、中西医结合、中药研究在临床、预防、科研、教学等方面的最新进展、成果和诊疗经验,探讨中医
药学术提高的思路和方法,介绍国内外中医药研究动态,开展学术争鸣,反映中医药市场现状与开拓前景,临床治疗新方法及
新药研究开发成果发布。本刊设有院士及专家论坛、进展述评、研究快报、获奖成果介绍、专题笔谈、基础研究、临床论著、临床
报道、诊法研究、理法研究、针炙经络、中药研究、方剂研究、(中药)新药介绍与评价、药物不良反应、实验研究、医史研究、名医
精华、名医研究、学术动态、综述、思路与方法、诊余心语、茧斋夜话、医案医话、病例讨论、护理研究等栏目。
本刊为双月刊,大16开本,每期66页,逢双月25日出版。国内刊号:CN35-1250/R,国际刊号:ISSN1671-2749。国内定
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第33卷第22期
2008年11月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 22
 November,2008