全 文 :竹节参总皂苷的制备工艺及含量测定
何毓敏,鲁科明,袁 丁,张长城
(三峡大学 医学院,湖北 宜昌 443002)
[摘要] 目的:优选竹节参总皂苷的提取纯化工艺,并测定其含量。方法:运用正交试验设计,以药材中总皂
苷的转移率作为考察指标,筛选最佳提取工艺;用正丁醇萃取合并醇溶丙酮沉淀法纯化得到精制皂苷;分别采用
分光光度法和HPLC测定其中总皂苷和三萜苷元齐墩果酸的含量。结果:提取工艺以药材粗粉10倍量的60%乙
醇,浸泡2h后加热回流提取3次,每次3h最佳;纯化工艺中以正丁醇萃取3次,以85%乙醇充分溶解后,边搅拌
边缓慢加入4~5倍量丙酮沉淀效果最佳。经纯化后总皂苷可达8348%,其中三萜苷元齐墩果酸可达3830%。
结论:本工艺条件对竹节参总皂苷的提取收率高且稳定,测定方法简便可行,重现性好。
[关键词] 竹节参;皂苷;齐墩果酸;制备工艺;含量测定
[中图分类号]R283;2841 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)22260705
[收稿日期] 20080401
[基金项目] 湖北省自然科学基金项目(2006ABA204);湖北
省科技攻关计划项目(2005AA301C06)
[通讯作者] 袁丁,Tel:(0717)6397501,Email:yxyyd@ctgu.
edu.cn
竹节参为五加科人参属植物竹节参 Panaxja
ponicusC.A.Mey.的干燥呈竹鞭状根茎,具有滋补
强壮、散瘀止痛、止血祛痰的功效[1]。其主要活性
成分是皂苷类,现已分离鉴定出 20余种皂苷成
分[2],化学结构以齐墩果烷型皂苷为主,水解后可
生成齐墩果酸。现代药理研究表明,竹节参总皂苷
具有明显的抗炎、抗氧化、降血糖等作用[3]。目前
有关竹节参中总皂苷提取纯化方面的研究报道并不
多,为适应研制开发以竹节参总皂苷为基本药物成
分的药物制剂的需要,作者对竹节参中总皂苷的提
取和纯化工艺进行了较系统的考察,并对得到的产
品建立了总皂苷及三萜苷元齐墩果酸的含量测定方
法,旨在为竹节参总皂苷制剂原料的制备及质量控
制提供实验依据。
1 仪器与试药
Waters2690型高效液相色谱仪,配996型光电
二极管阵列检测器,Milennium32色谱工作站;WFZ
UV-2100型紫外可见分光光度计[尤尼柯(上海)
仪器有限公司];KQ-250B型超声波清洗器(昆山
市超声仪器有限公司);DL-5B低速大容量离心机
(上海安亭科学仪器厂)。对照品齐墩果酸(批号
110709200304)和人参皂苷 Re(批号 110754
200421)均购自中国药品生物制品检定所。甲醇为
色谱纯,实验用水为双蒸水,其余试剂均为分析纯。
竹节参药材采自湖北省恩施州宣恩县竹节参
GAP基地,经宜昌市药品检验所中药室鉴定。
2 方法与结果
2.1 提取工艺
2.1.1 正交试验设计 根据皂苷类成分提取的有
关文献[45],影响提取效果的主要因素有乙醇浓度、
料液比、回流时间、提取次数、浸泡时间等。根据预
试验结果,以总皂苷的转移率为考察指标,拟定了
L16(4
5)正交试验,其因素水平见表1。
表1 因素水平
水平
A
乙醇
/%
B
料液比
/倍
C
回流时间
/h
D
提取次数
E
浸泡时间
/h
1 40 6 10 1 1
2 50 8 15 2 2
3 60 10 20 3 3
4 70 12 25 4 4
2.1.2 试验方法与结果 准确称取干燥的竹节参
粗粉(20~40目)40g(生药中总皂苷含量 14355
mg·g-1),分别按表1的试验条件进行回流提取,
过滤,合并滤液,转移至500mL量瓶中,加水稀释至
刻度,摇匀,精密吸取10mL,按2.3项下方法分别
测定各次提取液中总皂苷的含量,按下式计算其转
移率。实验结果见表2,极差分析和各因素效应关
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系见表3,方差分析见表4。
总皂苷转移率=提取液中总皂苷质量/mg药材中总皂苷质量/mg×100%
表2 L16(4
5)正交试验结果(珋x±s,n=3)
No.
总皂苷
/g·L-1
平均转移率
/%
No.
总皂苷
/g·L-1
平均转移率
/%
1 347±007 3020 9 1100±036 9582
2 728±012 6340 10 1026±084 8934
3 975±026 8493 11 778±040 6779
4 996±021 8669 12 626±028 5449
5 876±034 7626 13 902±023 7853
6 789±006 6871 14 651±044 5665
7 592±034 5158 15 957±040 8334
8 827±035 7199 16 906±020 7885
表3 总皂苷平均转移率极差分析
A B C D E
K1 6631 7020 6139 4823 6872
K2 6714 6953 6937 7043 7241
K3 7686 7191 7735 8234 7167
K4 7434 7301 7654 8364 7185
R 1055 348 1596 3541 369
表4 方差分析
方差来源 离均差平方和 自由度 方差 F P
A 32957 3 10986 1091 <005
B(误差) 3021 3 1007
C 66360 3 22120 2196 <005
D 322891 3 107630 10687 <001
E 3301 3 1100 109
注:[F005(3,3)=928,F001(3,3)=2946]
通过极差分析可知总皂苷的提取最佳工艺条件
为D4C3A3E2B4;由方差分析可知,提取次数对总皂
苷收率有极显著影响,乙醇浓度和回流时间对总皂
苷收率有显著影响。由于D4和D3差别不大,考虑生
产成本,最终确定最佳提取工艺为A3B3C3D3E2,即:
乙醇 60%,加 10倍量溶剂,浸泡 2h,回流提取 3
次,每次回流3h。
按上述最佳提取工艺进行3批药材的验证试
验,竹节参总皂苷的转移率分别为 9528%,
9781%和 9697%,表明本提取工艺较为稳定可
靠,且提取率较高。
2.2 竹节参总皂苷的富集与纯化
将按最佳工艺条件提取所得的提取液减压回收
溶剂至无醇味,此时可见有褐色沉淀析出,将残留液
和沉淀物一并定量转移至500mL量瓶中,加适量水
经超声处理(功率250W,频率50kHz)使溶解,继续
加水稀释至刻度,摇匀后静置6h以上,亲脂性杂质
此刻不溶而沉淀出,滤除;上清液再用水饱和正丁醇
等量萃取,经回收正丁醇,得到竹节参的总皂苷粗提
物。进一步将竹节参总皂苷粗提物首先溶于少量乙
醇溶液中,然后缓慢加入丙酮,加时搅拌,滴加结束后
于常温下静置4~6h,待浅褪色至淡黄色产物沉出,离
心(3500~4000r·min-1)分离,收集沉积物,用适量
丙酮洗涤后减压真空干燥,得到精制的竹节参总皂苷。
2.2.1 正丁醇萃取次数对竹节参总皂苷富集效果
的影响 以总皂苷的萃取转移率和总皂苷含量为指
标进行考察,结果见图1。综合试验结果并考虑实
际回收成本和生产效率,选择以含水正丁醇等量萃
取3次为宜。
萃取转移率=正丁醇部位中总皂苷质量/mg提取液中总皂苷质量/mg ×100%
-■--粗总皂苷产率;-▲--总皂苷质量分数
图1 萃取次数对总皂苷富集效果的影响
2.2.2 丙酮沉淀用量对纯化效果的影响 实验发
现,丙酮沉淀的用量受总皂苷粗提物醇溶试剂的种
类和用量的影响。无水乙醇对总皂苷粗提物的溶解
性能并不理想,加入一定比例的水可以提高其溶解
度;醇溶试剂的用量增大,总皂苷沉淀完全时需要的
丙酮用量也随之增加。同时,丙酮沉淀的用量对析
出总皂苷的量有较大影响。实验过程中,将竹节参
粗皂苷以适量的85%乙醇溶液充分溶解后,以总皂
苷的沉淀转移率和总皂苷含量为指标,考察丙酮沉
淀用量对纯化效果的影响,结果见图2。综合试验
结果并考虑实际生产成本,选择以4~5倍量丙酮沉
淀处理为宜。
沉淀转移率=丙酮析出物中总皂苷质量/mg正丁醇部位中总皂苷质量/mg×100%
-●--精制皂苷得率;-◆--总皂苷质量分数
图2 丙酮用量对总皂苷纯化效果的影响
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综上所述,竹节参总皂苷的制备工艺为:取竹节
参药材粗粉(20~40目),加10倍量60%的乙醇溶
液,浸泡2h后,加热回流提取3次,每次3h,合并
提取液。减压回收溶剂至无醇味,加适量水稀释后
放置,离心,取上清液,用含水正丁醇等量萃取3次,
合并萃取液,减压回收溶剂至无正丁醇馏出,将稠浸
膏用85%乙醇溶液充分溶解,然后缓慢加入4~5
倍量丙酮,加时搅拌,于常温下静置4~6h使沉淀
分离完全,离心,收集沉淀物并用适量丙酮洗涤,热
风(60~80℃)干燥得产品。
2.3 总皂苷含量测定[67]
2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷 Re
对照品适量,加甲醇制成每1mL含132mg的对照
品溶液,摇匀,即得。
2.3.2 供试品溶液的制备 取精制的竹节参总皂
苷提取物约02g,精密称定,置25mL量瓶中,加甲
醇溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液即得。
2.3.3 显色方法及检测波长的确定 准确吸取
2.3.1项下对照品溶液50μL及2.3.2项下供试品
溶液40μL,分别置于10mL具塞试管中,水浴挥干
溶剂,依次加入新配制的 5%香草醛冰醋酸溶液
02mL,高氯酸08mL,加塞,摇匀,于60℃水浴加
热15min,取出,置冰水浴中冷却3min,加冰醋酸稀
释至刻度,摇匀,随行试剂作空白,于波长400~700
nm扫描。供试品溶液及对照品溶液均在波长约
552nm处有良好吸收峰,空白无干扰,如图3所示。
因而选择552nm作为测定波长。
1.对照品溶液;2.供试品溶液;3.空白对照溶液
图3 可见光吸收曲线
2.3.4 标准曲线的制备 精密量取2.3.1项下对
照品溶液 02,04,06,08,10mL,分别置于 10
mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,准确吸取10
mL,置于10mL具塞试管中,按2.3.3项下方法操
作,随行试剂作空白,分别于552nm处测定吸光度,
以吸光度(A)为纵坐标,以人参皂苷 Re对照品质量
浓度(C,μg·mL-1)为横坐标,绘制标准曲线,得回
归方程A=00714C-00062,r=09993,表明人
参皂苷Re在264~1320mg·L
-1与吸光度的线性
关系良好。
2.3.5 含量测定 按2.3.2项下方法制备各批次
样品的供试品溶液,每次取供试品溶液40μL,分别
置于10mL具塞试管中,按2.3.3项下方法操作,每
样做3个平行试验,于552nm处测定吸光度,根据
标准曲线计算总皂苷的含量,结果见表5。
2.4 皂苷元齐墩果酸含量测定
2.4.1 色谱条件 YMCpackODSAQ色谱柱(46
mm×250mm,5μm),流动相甲醇水冰醋酸三乙
胺(90∶10∶004∶002),检测波长210nm,流速10
mL·min-1,柱温30℃。在此色谱条件下,齐墩果
酸色谱峰能达到基线分离,色谱图见图4。
2.4.2 标准曲线的制备 准确称取齐墩果酸对照
品适量,加甲醇制成每1mL含107mg的对照品溶
液。精密量取该对照品溶液05,08,10,15,20
mL,分别置于10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇
匀,准确吸取10μL,按选定的色谱条件进样测定。
以色谱峰面积Y为纵坐标,齐墩果酸对照品的进样
量X(μg)为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程Y=
4499912195X+403816184,r=09991,线性范
围0535~2140mg·L-1。
A.对照品;B.供试品;1.齐墩果酸
图4 竹节参提取物中齐墩果酸的HPLC图
2.4.3 精密度试验 精密吸取齐墩果酸对照品溶
液(107g·L-1)10μL,在选定的色谱条件下,重复
进样 6次,结果齐墩果酸峰面积 RSD034%
(n=6)。同一对照品溶液连续进样5d,结果齐墩果
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酸峰面积RSD12%(n=5)。
2.4.4 重复性试验 取同一批竹节参总皂苷提取
物约01g,共6份,精密称定,置25mL量瓶中,按
2.4.3项下的样品测定方法提取测定。结果齐墩果
酸的平均质量分数为 38301mg·g-1,结果 RSD
15%(n=6),表明本方法重复性良好。
2.4.5 稳定性试验 取同一供试品溶液,分别于配
制后0,2,4,8,12,24h后进样10μL进行测定,结
果齐墩果酸峰面积的 RSD10%,表明供试品溶液
在24h内稳定。
2.4.6 加样回收率 取已知齐墩果酸质量分数
(38301mg·g-1)的竹节参总皂苷产品约005g,共
6份,称定后分别精密加入齐墩果酸对照品适量,按
2.4.8项下的样品测定方法提取测定,计算得齐墩果
酸平均回收率9881%,RSD22%(n=6)。
2.4.7 样品测定 取 4批竹节参总皂苷产品各
01g,精密称定,置25mL量瓶中,加甲醇溶解并稀
释至刻度,摇匀,滤过;精密量取续滤液10mL,回收
溶剂至干,残渣加 25%盐酸 20mL、三氯甲烷 25
mL,加热水解10h,水解液用三氯甲烷振摇提取2
次,每次25mL,合并提取液,减压回收溶剂至干,残
渣加甲醇溶解并转移至10mL量瓶中,加甲醇至刻
度,摇匀,以045μm微孔滤膜滤过,在选定的色谱
条件下,分别进样10μL测定,记录峰面积,按外标
法计算含量。结果见表5。
表5 竹节参总皂苷及齐墩果酸质量分数(n=3)
批次
总皂苷
/mg·g-1
SD
齐墩果酸
/mg·g-1
SD
070701 83475 200 38301 086
070702 81115 205 39619 088
070703 79136 159 38249 089
070704 83153 116 38425 093
3 讨论
竹节参的主要有效成分为皂苷类,并以三萜皂
苷为主。三萜类化合物的苷元结构较大,极性低,具
有亲脂性,而糖部分极性大,具有亲水性,这种结构
类型的中药有效成分较适合采用醇法提取。同时,
竹节参的化学研究表明,其皂苷类化合物的结构中
含有羟基、羧基等极性基团较多,亲水性强,因而采
用稀醇提取效果较好。目前关于竹节参总皂苷的提
取工艺研究方面的文献报道较少。本实验采用正交
试验设计,对影响竹节参皂苷醇提工艺的各种因素
进行考察,优选出最佳提取工艺条件,对实际生产有
一定的指导意义。
皂苷类成分的分离纯化难度较大。文献[8]报
道采用大孔吸附树脂分离法纯化皂苷类提取物。因
其理化性质稳定,吸附和分离效能优良,也适合于皂
苷类成分的分离纯化。但是,采用大孔吸附树脂纯
化皂苷的工艺,一般是将醇提液或水提液浓缩后上
样,这可能导致在浓缩时皂苷成分析出损失;以醇提
液浓缩后上样则可能因乙醇未回收完全而降低大孔
吸附树脂对皂苷的吸附容量,并且采用大孔吸附树
脂分离纯化皂苷类成分的工艺考察复杂,能源和试
剂的消耗较大,因而有其局限性。本研究以稀醇提
取正丁醇富集丙酮沉淀分离三步骤完成对竹节参
总皂苷的制备。以总皂苷转移率为评价本工艺的指
标,各步平均转移率分别为醇提(9669%)正丁醇
萃取(8146%)丙酮沉淀(8370%),总转移率达
到6593%,基本符合工业生产要求。
为满足竹节参总皂苷提取物作为制剂原料时质
量控制的准确灵敏和简便实用的要求,本研究还建
立了总皂苷提取物的水解液中齐墩果酸的含量测定
方法。方法学研究表明,所建方法灵敏,准确,干扰
少,重复性好,可为竹节参总皂苷提取物的质量控制
提供一定的参考。
[参考文献]
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海:上海科学技术出版社,1999:5034.
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参皂苷的提取工艺研究[J].中草药,2006,37(8):1194.
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Studiesonpreparativetechnologyandquantitativedeterminationfor
extractsoftotalsaponininroofofPanaxjaponicus
HEYumin,LUKeming,YUANDing,ZHANGChangcheng
(MedicalScienceColegeofChinaThreeGorgesUniversity,Yichang443002,China)
[Abstract] Objective:ToexploretheoptimumextractionandpurificationconditionofthetotalsaponinsintherootofPanax
japonicus(RPJ),andestablishitsqualitycontrolmethods.Method:DesignedL16(4
5)orthogonaltestwiththeextractionrateoftotal
saponinsasindex,todeterminetherationalextractionprocess,andthetechniquesofwatersaturatednbutanolextractionandacetone
precipitationwereappliedtopurifythealcoholextractofRPJ.Totalsaponinsweredetectedbyspectrophotometryanditstriterpenoidal
sapogeninoleanolicaciddetectedbyHPLC.Result:TheoptimumconditionsoftotalsaponinsfromRPJwasasfolows:thematerial
waspulverized,dippedin60% ethanolaqueoussolutionasextractsolventat10timesofvolume,andrefluxed3timesfor3heach
time.Extractantofwatersaturatednbutanolwithextractiontimesof3andprecipitantofacetonewithprecipitationamountof45times
wereincludedinthepurificationprocess,whichwouldobtainthequalityproducts.Thecontentoftotalsaponinscouldreachto
8348%,andoleanolicacidto3830%.Conclusion:Theoptimizedpreparativetechnologyisstable,convenientandpractical.The
extractrateofRPJwashighandsteadywiththistechnology,whichprovidednewevidenceforindustrializingproductionoftheplantand
developingnewdrug.
[Keywords] Panaxjaponicus;totalsaponins;oleanolicacid;preparativetechnology;contentdetermination
[责任编辑 鲍 雷]
[收稿日期] 20080610
[作者简介] 韩刚,教授,主要从事中药有效成分及药物新剂
型的研究,Tel:(0315)3726303,Email:tsyxhg@163.com
姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素
稳定性研究
韩 刚,崔静静,毕 瑞,赵琳琳,张卫国
(华北煤炭医学院 药学系 河北省煤矿卫生与安全重点实验室,河北 唐山 063000)
[摘要] 目的:研究姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素在不同 pH缓冲溶液中的稳定性。方法:以
一定pH的缓冲溶液为反应介质,将姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素定量加入到反应介质中,高效液相
色谱法测定姜黄素类化合物浓度的变化,采用动力学方法建立姜黄素类化合物降解速率方程。结果:在相同的条
件下姜黄素类化合物的稳定性依次为:双去甲氧基姜黄素≥去甲氧基姜黄素≥姜黄素。结论:去甲氧基姜黄素对
姜黄素产生稳定作用最强,为姜黄素的天然稳定剂。
[关键词] 姜黄素;去甲氧基姜黄素;双去甲氧基姜黄素;稳定性;HPLC
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)22261103
姜黄素(curcumin,CurⅠ)、去甲氧基姜黄素
(demethoxycurcumin,CurⅡ)和双去甲氧基姜黄素
(bisdemethoxycurcumin,CurⅢ)为常用中药材姜黄
中的有效成分,统称为姜黄素类化合物[1]。这3种
成分结构相近,具有多种相似的药理活性,如抗炎、
抗氧化、降血脂和抗癌活性[2]。近年来研究发现去
甲氧基姜黄素降血脂的活性明显高于姜黄素;防止
细胞脂类过氧化物的形成,去二甲氧基姜黄效果优
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