全 文 ：冬凌草甲素诱导肝癌细胞凋亡中
…¦¯2u及端粒酶变化的研究
张俊峰 o陈规划 3 o陆敏强 o李 华 o蔡常洁 o杨 扬
k中山大学 附属第三医院 肝移植中心 o广东 广州 xtsyvsl
≈摘要   目的 }探讨冬凌草甲素诱导人肝癌细胞 …∞2zwsu凋亡中 …¦¯2u表达及端粒酶活性的变化 ∀方法 }以
{otyouwovu Λ°²¯# pt不同浓度的冬凌草甲素作用于体外培养的 …∞2zwsu细胞 o应用流式细胞仪检测细胞凋亡 o
‹ ²¨ ¦«¶·vvux{荧光染色法 ∀ • ¶¨·¨µ± ¥¯²·观察 …¦¯2u o…¤¬表达变化 ∀应用 °≤• 2∞Œ≥„及 • ×2°≤• 法检测细胞凋亡
前后端粒酶活性及端粒酶 «×∞• × °• ‘„表达水平的变化 ∀结果 }冬凌草甲素可诱导肝癌细胞 …∞2zwsu发生细胞
凋亡 o具有明显的量 2效与时 2效关系 ∀冬凌草甲素作用 ys «后 o在 ‹ ²¨ ¦«¶·vvux{荧光染色图片上可见核浓缩及核
碎裂等典型的细胞凋亡特征 ∀凋亡过程中 …¦¯2u蛋白表达的降低和 …¤¬蛋白上调 o同时端粒酶 «×∞• × °• ‘„的表
达水平及端粒酶活性均明显降低 ∀结论 }冬凌草甲素在诱导肝癌细胞 …∞2zwsu发生细胞凋亡过程中 o能降低端粒
酶 «×∞• × °• ‘„的表达水平和端粒酶活性 o同时抗凋亡蛋白 …¦¯2u表达的降低和促凋亡蛋白 …¤¬上调 ∀
≈关键词   冬凌草甲素 ~肝癌 ~细胞凋亡 ~ …¦¯2u~…¤¬~端粒酶
≈中图分类号   • u{x1x ≈文献标识码   „ ≈文章编号   tsst2xvsukussylut2t{tt2sw
≈收稿日期   ussy2sx2ts
≈基金项目   国家重点发展研究计划 k|zv l资助项目
kussv≤…xtxxszl
≈通讯作者   3 陈规划 o ר¯} k sus l {zx|xxuvo ∞2°¤¬¯} ª«2
¦«¨ ±t|xxƒ ª½¶∏°¶1 §¨∏1¦±
冬凌草甲素是从冬凌草中提取出来的一种以贝
壳杉烯 k ±¨·2®¤∏µ¨± l¨为骨架的四环二萜类化合物 o
其化学结构为 ≤us ‹uy ’z ≈tou  ∀大量资料证明 ≈tovow  o
冬凌草甲素对多种肿瘤均具有明显的抑制作用 o其
对实体瘤如食道癌 !胃癌 !肝癌等的治疗已广泛应用
于临床 o并取得了明显的疗效 ∀冬凌草甲素对肝癌
细胞诱导凋亡机制研究 o目前文献未见报道 ∀笔者
以人肝癌细胞株 …∞2zwsu细胞为研究对象 o观察
了不同浓度的冬凌草甲素对 …∞2zwsu细胞诱导凋
亡过程中 …¦¯2uo…¤¬蛋白表达及人端粒酶活性及人
端粒酶逆转录酶 k«∏°¤± ·¨¯²° µ¨¤¶¨ µ¨√ µ¨¶¨ ·µ¤±2
¶¦µ¬³·¤¶¨o«×∞• ×l°• ‘„变化 ∀旨在探讨凋亡相关
蛋白 …¦¯2u o…¤¬及端粒酶变化在冬凌草甲素对
…∞2zwsu细胞诱导凋亡中的作用 ∀
1 材料
111 细胞系 人肝癌细胞 …∞2zwsu细胞购自上海
中国科学院细胞库 ∀
112 药物 冬凌草甲素的提取按照文献报道 ≈x  o
纯度在 |xh以上 ∀
113 主要试剂 • ° Œtywso美国 ŠŒ…≤’公司产
品 ∀小牛血清 o杭州四季青生物制品厂产品 ∀ ‹²2
¦¨«¶·vvux{染液由中山大学药学院提供 ∀ …¦¯ o …¤¬
抗体购自 °«¤µ°¬±ª¨ ±公司 ∀端粒酶活性检测试剂
盒 k°≤• 2∞Œ≥„ ®¬·l 购自 …²¨ «µ¬±ª¨µ2 ¤±±«¨ ¬° 公
司 ∀端粒酶 «×∞• × ¦⁄‘„扩增引物由上海生物工程
有限 公 司 合 成 o上 游 引 物 为 xχ ×≤„≤≤׊2
Š„Š„ŠŠŠ×Š„„ŠŠ≤„≤׊××∞vχo下游引物为 xχ„×2
Š≤׊≤≤Š„׊„≤≤×≤≤Š×Š„vχo扩增产物为 uvx ¥³∀
• ‘„提取试剂盒 k×µ¬½²¯ • ‘„ ®¬·l购自 ¬©¨ × ¦¨«2
±²¯²ª¬¨¶公司 ∀
114 仪器及设备 ≤’u细胞培养箱 !普通及倒置显
微镜 k美国 ’ ¼¯°³∏¶产品 lo平板离心机 k上海产 lo
ƒ„≤≥¦¤±型流式细胞仪 k… ¦¨·²± ⁄¬¦®¬±¶²±o美国 l∀
2 方法
211 细胞培养 将 …∞2zwsu细胞接种于含 tsh
灭活小牛血清的 • ° Œtyws培养液中 o在 vz ε oxh
≤’u饱和湿度下培养 o每 u ∗ v §换液 t次 o取对数生
长期的细胞进行实验 o分别以 {otyouwovu Λ°²¯ #
pt不同浓度的冬凌草甲素溶液处理细胞 o加等量培
养液为对照组 ∀
212 细胞凋亡率 收集不同药物浓度处理不同时
#tt{t#
第 vt卷第 ut期
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Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vto Œ¶¶∏¨ ut
‘²√ °¨¥¨ µo ussy
间后的 …∞2zwsu细胞 o以 °…≥缓冲液清洗 u次后
再将细胞沉淀充分混匀 o用 zsh的冷乙醇 w ε 固定
uw «以上 ∀然后离心去除乙醇固定液 o用 °…≥清洗
t次后 o加入 uss Λª# °pt的 • ‘„酶 o流式细胞仪
分析不同 ⁄‘„含量的细胞分布 ∀应用  ²§¬©¬·×
t1ssk „≤l分析系统进行数据处理 o低于 Št期的细
胞 k亚 Št期 l为凋亡细胞 o其占细胞总数的比例为凋
亡细胞比例 ∀
213 细胞凋亡 用胰酶消化后 o收集不同浓度的药
物处理 ys «后的 …∞2zwsu细胞 o离心 kv sss µ#
°¬±pt o v °¬±l后将细胞吹打均匀 o涂片并干燥后 o
用甲醛液 kws ª# pt l固定 ts °¬±o然后用蒸馏水洗
u次 o室温下待干 ~然后用 «²¨ ¦«¶·vvux{kx °ª#
pt l染色 x °¬±o用蒸馏水洗 u次 o室温下晾干 o在荧
光显微镜下观察 o并随机拍照 ∀
214 • ¶¨·¨µ± ¥¯²·分析 收集 u ≅ tsy个 r°细胞 o
用冻的 °…≥洗 u次 o在 w ε 裂解 vs °¬± o离心 tx
°¬± o用 tsh ≥⁄≥2°„Š∞分离 o转到尼龙滤膜上 o分
别加入 tΒt sss …¦¯2u o …¤¬单抗 u «后用 °…≥和
ׅ≥×洗各 u次 otΒt sss辣根过氧化物酶标记的二
抗 ŒªŠ孵育 t «o ׅ≥×洗 u次 o应用 ∞≤• ¶¨·¨µ±
¥¯²·检测系统测定 ∀
215 端粒酶活性的检测 采用端粒重复扩增
kו „°l酶连免疫吸附法 k∞Œ≥„l∀扩增引物分别
为 } ≤÷xχ2≤≤≤×ׄ≤≤≤×ׄ≤≤≤×ׄ≤≤≤×ׄ 2vχ 和
×≥ xχ2„„×≤≤Š×≤Š„Š≤„Š„Š××2vχ∀方法按说明书
进行 ∀最后以 y|s ±°作为参比波长 ovs °¬±内酶标
仪测定样品在 wxs ±°波长的吸光度 kΑ) ,根据 Α €
Αwxs p Αy|s计算 ∀
216 «×∞• × °• ‘„的检测 k• ×2°≤• l 严格按试
剂盒说明操作 ∀
217 统计分析 实验数据以 cξ ? σ表示 o采用 ≥„≥
y1tu统计软件进行方差分析 o并对各组之间进行两
两比较 ∀
3 结果
311 细胞凋亡率的变化 ty ∗ vu Λ°²¯ # pt的冬
凌草甲素均可诱导细胞凋亡发生 o细胞凋亡率随作
用时间的延长而逐渐增加 ∀ uw ∗ vu Λ°²¯ # pt的
药物作用 ys «后凋亡细胞数量达高峰 k xsh lo明
显高于其他浓度冬凌草甲素的诱导凋亡率 kΠ 
s1stl k图 tl∀
312 凋亡细胞 凋亡细胞主要表现为细胞核浓缩

图 t 冬凌草甲素对 …∞2zwsu细胞凋亡率的影响
及细胞核碎裂等典型改变 o { Λ°²¯ # pt的冬凌草
甲素诱导细胞凋亡数较少 o而 ty ∗ vu Λ°²¯ # pt
的冬凌草甲素作用 …∞2zwsu细胞 zu «凋亡细胞可
达 xsh ∗ ysh k图 ul∀
图 u 冬凌草甲素诱导 …∞2zwsu细胞凋亡
‹²¦«¶·vvux{荧光染色 k ≅ ussl
°²¯# pt ~…1 ty Λ°²¯# pt ~≤1uw Λ°²¯# pt ~⁄1 vu Λ°²¯# pt
313 • ¶¨·¨µ± … ²¯·分析 当冬凌草甲素作用 …∞2
zwsu细胞 w{ «o抗凋亡蛋白 …¦¯2u表达降低和促凋
亡蛋白 …¤¬上调 k图 vl∀
图 v 冬凌草甲素作用于 …∞2zwsu细胞 w{ «后
…¦¯2u和 …¤¬表达
k…¤¬蛋白表达上调 o …¦¯2u蛋白表达下降 l
t1对照组 ~u ∗ x1分别为 {otyouwovu Λ°²¯# pt
314 对 …∞2zwsu细胞端粒酶活性的影响 随药物
#ut{t#
第 vt卷第 ut期
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∂ ²¯1vto Œ¶¶∏¨ ut
‘²√ °¨¥¨ µo ussy
浓度的增加和作用时间的延长 o端粒酶活性逐渐下
降 o并呈现出剂 2效应与时间 2效应关系 ouw Λ°²¯ #
pt的冬凌草甲素作用 ys ∗ zu «后 o细胞的端粒酶
活性最低 ozu «细胞的端粒酶活性几近为零 k图 wl∀
图 w 细胞端粒酶活性的变化
315 端粒酶 «×∞• × °• ‘„ 表达水平的变化
«×∞• × ¦⁄‘„全长为 w stx ¥³o编码 ttvu氨基酸的
多肽链 o结果检测到的片段为 uvx ¥³o冬凌草甲素
治疗后 o«×∞• × °• ‘„表达水平显著下降 o uw Λ°²¯
# pt作用 ys «后 o «×∞• × °• ‘„表达水平为阴
性 o这表明在 «×∞• × °• ‘„下降的同时 o端粒酶活
性也显著下降 k图 xl∀
图 x 冬凌草甲素对 …∞2zwsu细胞 «×∞• × °• ‘„
表达水平的影响
t1⁄‘„分子量标准 ~u ∗ y1 so{otyouwovu Λ°²¯# pt冬凌草甲素 ~
z1阳性对照
4 讨论
最近研究证实 o冬凌草甲素有广泛的抗肿瘤作
用 ≈w  ∀冬凌草甲素对实体瘤如肺癌 ≥°≤ 2„2t细胞株
以及淋巴瘤细胞株如 • ¤­¬细胞等均有明显的生长
抑制作用 o诱导细胞发生凋亡可能为其重要的抗癌
作用机制之一 ≈yoz  ∀
…¦¯2u细胞凋亡抑制基因是目前发现的与凋亡
关系密切的原癌基因之一 ∀ …¦¯2u基因家族成员分
为两类 }…¦¯2u类 o是凋亡抑制因子 o包括 …¦¯2uo…¦¯2
¬¯o…¦¯2º等 ~…¤¬类 o为凋亡促进因子 o包括 …¤¬o
…¤®o…²¬等 ∀ …¦¯2ur…¤¬的比值决定了细胞接受凋
亡信号后细胞的存活与否 o如果 …¤¬占优势 o细胞死
亡 o而 …¦¯2u占优势时 o细胞存活 ≈{  ∀作者应用冬凌
草甲素对肝癌细胞 …∞2zwsu的作用研究发现 o冬
凌草甲素能诱导细胞发生凋亡 o表现为时间和剂量
效应 ∀ ‹ ²¨ ¦«¶·vvux{染色和 ⁄‘„片段分析观察到
典型的凋亡形态学变化 ∀凋亡过程中 …¦¯2u蛋白表
达降低和 …¤¬蛋白上调 o可能为冬凌草甲素体外诱
导细胞发生凋亡的重要机制之一 ∀
端粒酶活性的变化与细胞凋亡的关系目前尚未
完全阐明 o既往资料认为 ≈|  o细胞凋亡过程中 o端粒
酶活性的变化只是细胞发生凋亡过程中的一个伴随
事件 ∀但最近越来越多的资料 ≈ts 显示 o在细胞凋亡
过程中 o端粒酶可能起重要的调节机制 o端粒酶活性
下降可以促进细胞的程序性死亡 ∀在大多数癌组织
中发现端粒酶活化与 …¦¯2u表达下调同时存在 o有
文献报道细胞端粒酶活性与 …¦¯2u表达水平存在密
切关系 ≈tt  ∀作者检测结果也表明了这一点 o在细胞
凋亡过程中 o细胞端粒酶 «×∞• × °• ‘„的表达水平
下降和端粒酶活性下降同时 o伴有 …¦¯2u蛋白表达
的降低和 …¤¬蛋白上调 ∀
本研究结果首次表明 o冬凌草甲素能够通过诱
导人肝癌 …∞2zwsu细胞发生凋亡而发挥抑制肝癌
细胞生长作用 ~细胞端粒酶 «×∞• × °• ‘„的表达水
平和端粒酶活性下降以及上调 …¤¬水平和下调 …¦¯2
u水平可能是冬凌草甲素体外诱导人肝癌 …∞2zwsu
细胞发生凋亡的重要作用机制之一 ∀
≈参考文献  
≈t  ‹¤± ± …o ¬ o ¬≥ ‹ o ·¨¤¯1∞±·2®¤∏µ¤±¨§¬·¨µ³¨ ±²¬§¶©µ²°
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¬¦¤¯ §¨ ·¨µ°¬±¤·¬²± ²©ιν ϖιϖο §¬¶·µ¬¥∏·¬²± ²©…¤¬o ¤ §²°¬±¤±·¬±2
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ussy年 tt月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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«¬¥¬·²µ²©…¦¯2u≈ 1„° °¤·«²¯ot||wotwxkyl}tvuv1
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·¬·¨¯²° µ¨¤¶¨ ·«¨ µ¤³¼≈  1¨∏®¨ °¬¤o ussvotzkvl}xys1
≈tt   ¤±§¤¯  oŽ∏°¤µ• 1…¦¯2u °²§∏¯¤·¨¶·¨¯²° µ¨¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¼≈ 1
…¬²¯ ≤«¨ °ot||zouzukul}twt{v1
Χηανγε οφ Βχλ2u εξπρεσσιον ανδ τελοµ ερασε δυρινγ αποπτοσισ ινδυχεδ
βψ οριδονιν ον ηυµ αν ηεπατοχελλυαρ χαρχινοµ α χελλσ
‹„‘Š ∏±2©¨±ªo ≤‹∞‘Š∏¬2«∏¤o ˜  ¬±ª2±¬±ªo Œ‹∏¤o ≤„Œ≤«¤±ª2¬¨ o ≠ „‘Š ≠¤±ª
(∆επαρτµ εντ οφ ΛιϖερΤρανσπλαντατιον, Τηε Τηιρδ Αφφιλιατεδ Ηοσπιταλοφ Συν Ψατ2σεν Υνιϖερσιτψ, Γυανγζηου xtsyvs, Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ ¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨·«¨ ¦«¤±ª¨ ²©…¦¯2u ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¤±§ ·¨¯²° µ¨¤¶¨ §∏µ¬±ª·«¨ ¤³²³·²¶¬¶¬±§∏¦¨§¥¼ ²µ¬§²±¬±
²± «∏°¤± «¨ ³¤·²¦¨¯¯∏¤µ¦¤µ¦¬±²°¤…∞zwsu ¦¨ ¯¯¶1Μετηοδ}…∞2zwsu ¦¨¯¯¶¬± ¦∏¯·∏µ¨ ° §¨¬∏° º µ¨¨ ª¬√ ±¨ {otyouwovu Λ°²¯# pt §¬©2
©¨ µ¨±·¦²±¦¨±·µ¤·¬²±¶²©²µ¬§²±¬±1 ׫¨ ¦¨ ¯¯ ¤³²³·²·¬¦µ¤·¨ º¤¶§¨ ·¨¦·¨§¥¼ ©¯²º ¦¼·²° ·¨µ¼kƒ≤ lo °²µ³«²¯²ª¼ ²©¦¨¯¯ ¤³²³·²¶¬¶º¤¶²¥2
¶¨µ√ §¨¥¼ ‹ ²¨ ¦«¶·vvux ¶·¤¬±¬±ª1…¦¯2u ¤±§…¤¬ ¬¨³µ¨¶¶¬²±¶º µ¨¨ §¨ ·¨¦·¨§¥¼ • ¶¨·¨µ± ¥¯²·¬±ª1• √¨ µ¨¶¨ ·µ¤±¶¦µ¬³·¤¶¨ ³²¯¼° µ¨¤¶¨ ¦«¤¬±
µ¨¤¦·¬²±k• ×2°≤• l ¤±§°≤• ±¨½¼° 2¨¯¬±®¨ §¬°°∏±²¶²µ¥¨ ±·¤¶¶¤¼ k∞Œ≥„l º µ¨¨ ∏¶¨§·² §¨ ·¨¦·«×∞• × °• ‘„ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¤±§·¨¯²° µ¨2
¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¼1 Ρ εσυλτ: ’µ¬§²±¬± ¬±§∏¦¨§…∞2zwsu ¦¨¯¯¶¤³²³·²¶¬¶¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼o ¤±§·«¨ ¤³²³·²¶¬¶µ¤·¨ º¤¶¥²·« ¬± ·¬° 2¨¤±§§²¶¨2§¨ 2
³¨ ±§¨ ±·°¤±± µ¨1  ¤µ®¨ §°²µ³«²¯²ª¬¦¤¯ ¦«¤±ª¨ ¶²©¦¨¯¯ ¤³²³·²¶¬¶º µ¨¨ ²¥¶¨µ√ §¨√ µ¨¼ ¦¯ ¤¨µ¯¼ ¥¼ ‹ ²¨ ¦«¶·vvux{ ¶·¤¬±¬±ª¤©·¨µ·«¨ ¦¨ ¯¯¶
¬¨³²¶¨§·² ²µ¬§²±¬± ©²µys «²∏µ¶~ • ¶¨·¨µ± ¥¯²·¬±ª¶«²º §¨·«¤·…¦¯2u ¬¨³µ¨¶¶¬²± º¤¶§²º±2µ¨ª∏¯¤·¨§¤±§…¤¬ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ∏³2µ¨ª∏¯¤·¨§
¦²±¦∏µµ¨±·¯¼ ¤¯²±ªº¬·«·«¨ ¤³²³·²·¬¦³µ²¦¨¶¶o ¤±§·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©«×∞• × °• ‘„ ¤¶º¨¯¯¤¶¤¦·¬√¬·¼ ²©·¨¯²° µ¨¤¶¨ º µ¨¨ §¨ ¦µ¨¤¶¨§¦²±2
¦∏µµ¨±·¯¼1 Χονχλυσιον: ’µ¬§²±¬± ¦²∏¯§§¨ ¦µ¨¤¶¨ ·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©«×∞• × °• ‘„ ¤±§·¨¯²° µ¨¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¼ ¤¶º¨¯¯¤¶§²º±2µ¨ª∏¯¤·¬²± ²©
…¦¯2u ¤±§∏³2µ¨ª∏¯¤·¬²± ²©…¤¬ ¬¨³µ¨¶¶¬²± §∏µ¬±ª·«¨ ¤³²³·²¶¬¶²©…∞2zwsu ¦¨¯¯¶1
[ Κεψ ωορδσ] ²µ¬§²±¬±~ «¨ ³¤·²¦¨¯¯∏¯¤µ¦¤µ¦¬±²°¤~ ¤³²³·²¶¬¶~ …¦¯2u~ …¤¬~·¨¯²° µ¨¤¶¨ ≈责任编辑 古云侠  
≈收稿日期   ussy2st2ts
≈通讯作者   3 吴小候 oר¯}ksuvl{|stttuu
红花注射液对大鼠肾缺血再灌注损伤
的疗效及机制研究
高 飞 t o吴小候 u3 o罗春丽 v o何云峰 u o张良锁 u o杨 美 w
kt1重庆市第五人民医院泌尿外科 o重庆 wsssyu~ u1重庆医科大学附属第一医院泌尿外科 o重庆 wsssty~
v1重庆医科大学 检验系 o重庆 wsssty~ w1重庆医科大学 解剖教研室 o重庆 wssstyl
≈摘要   目的 }探讨红花注射液对大鼠肾缺血再灌注损伤的疗效及机制 ∀方法 }将 zx只 ≥⁄大鼠分为正常对
照组 !缺血再灌注组 !红花注射液低剂量 kyu1x °ª# ®ªpt l!中剂量 ktux °ª# ®ªpt l和高剂量治疗组 kuxs °ª#
®ªpt lo建立肾缺血再灌注损伤模型 o采用血清肌酐 !尿素氮和血尿渗透压值评价肾功能 oט‘∞检测肾组织细胞凋
亡率 o免疫组化检测肾组织 ¦¤¶³¤¶¨2v蛋白表达的变化 ∀结果 }缺血再灌注损伤后 o肾功能明显减退 o细胞凋亡率和
¦¤¶³¤¶¨2v表达显著升高 kΠ  s1stl~运用红花注射液治疗后 o肾功能显著改善 o细胞凋亡率和 ¦¤¶³¤¶¨2v表达显著降
低 kΠ  s1stl∀结论 }红花注射液对大鼠肾缺血再灌注损伤所致的肾功能损害具有显著的保护作用 o该作用可能
#wt{t#
第 vt卷第 ut期
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∂ ²¯1vto Œ¶¶∏¨ ut
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