全 文 :[Abstract] Objective:ToobservetheefectofArmilariameleapolysaccharideonmicebonemarowcelsdamagecausedbyCy
clophosphamide.Method:Kunmingpurebredmicewereusedandstochasticdividedinto5groups:normalcontrolgroup,positivecontrol
group(rhGCSF20μgkg
-1·d-1),damagegroupofCyclophosphamide(150mg·kg-1·d-1),theprotectivegroupwithAmeleapolysaccha
ride,lowdose(250mg·kg-1·d-1)andhighdose(500mg·kg-1·d-1).PositivecontrolwasscrhGCSF6dandipCyclophosphamide3
d.Ameleapolysaccharidewasip8d.andCyclophosphamideip3d.WBC,RBC,PLT,BMNCwerecountedinperipheralbloodandbone
marowcels.Themyelogramwereanalyzedinbonemarow.Result:TheWBC,RBC,PLT,BMNCofprotectivegroupandpositivecontrol
groupwerehigherthandamagegroup(P<001)significanflyhighdosegroupincreaserthanlowdosegroupinprotectivegroupthenumbed
ofPromyelocyticandlobulationnuclearofmarow.Conclusion:Ameleapolysaccharidehaspreferablyprotectiveefectondamagingmice
bonemarowcelcausedbyCyclophosphamide.
[Keywords] Armilariameleapolysaccharide;Cyclophosphamide;bonemarowcel
[责任编辑 方文贤]
[收稿日期] 20040527
[通讯作者] 谷卫,Tel:(0571)87783517,Fax:(0571)87022776,
Email:guwei@aiocrm.com
小檗碱对 3T3L1脂肪细胞脂联素表达的影响
谷 卫,曾文衡,胡海英
(浙江大学 医学院 附属第二医院,浙江 杭州 310009)
[摘要] 目的:探讨小檗碱和胰岛素对3T3L1脂肪细胞脂联素表达的影响。方法:检测分别经小檗碱及胰岛
素处理后3T3L1脂肪细胞脂联素表达水平改变,以βactin为内对照,半定量法RTPCR测定脂联素mRNA表达。结
果:经小檗碱(10μmol·L
-1)干预后3T3L1脂肪细胞脂联素表达显著增加(P<005),加入胰岛素后脂联素的表达受
到抑制,高浓度胰岛素有显著抑制作用(P<005)。结论:体外实验中,小檗碱使3T3L1脂肪细胞脂联素的表达增
加,而胰岛素可抑制小檗碱增加脂联素表达的作用。
[关键词] 小檗碱;脂联素;胰岛素;3T3L1脂肪细胞
[中图分类号]R2855 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2005)04028603
小檗碱是中药黄连的主要成分,具有改善胰岛
素抵抗和降血糖作用[1]。近年的研究发现脂肪细胞
不仅是脂质的贮存库,它还分泌多种激素参与机体
的能量代谢。脂联素(adiponectin)就是其中一种与
胰岛素敏感性密切相关的脂肪细胞因子。大量研究
表明:动物和人体的血浆脂联素浓度与空腹血糖浓
度、空腹胰岛素浓度、胰岛素抵抗呈负相关;与胰岛
素敏感性呈正相关[2]。本研究通过观察小檗碱和胰
岛素对体外脂肪细胞脂联素表达的影响,探讨脂联
素表达的调控机制和小檗碱改善胰岛素抵抗的分子
机制。
1 材料和方法
11 材料和试剂 3T3L1脂肪细胞株由中国科学
院生物化学和细胞生物学研究所赠送;DMEM细胞
培养粉购自Gibco公司;特级新生小牛血清,胎牛血
清购自杭州四季青生物制品公司;重组人普通胰岛
素购自 Novo公司;地塞米松,3异丁基1甲基黄嘌
呤购自 Sigma公司;小檗碱购自抚顺制药厂;Trizol
购自 GibcoBRL公司;RTPCR试剂盒购自 Promega
公司。
12 方法
121 3T3L1细胞培养和诱导 将3T3L1脂肪细
胞用含10%小牛血清高糖 DMEM培养液在 37℃,
5%CO2的条件下培养,细胞状态良好时接种于培养
板,待细胞融合2d后,加含05mmol·L-13异丁基
1甲基黄嘌呤,025μmol·L
-1地塞米松,10μg·mL
-1
胰岛素、10%胎牛血清的高糖DMEM培养48h,换以
含10μg·mL
-1胰岛素的培养液再培养48h,随后以
10%胎牛血清的高糖DMEM培养液继续培养,2d换
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培养液1次,诱导分化8~12d的3T3L1细胞90%
多呈脂肪细胞表型,可用于试验。取10μmol·L
-1小
檗碱的有效浓度为工作浓度。
122 小檗碱在不同浓度胰岛素下对脂肪细胞脂
联素表达的影响 在以10μmol·L
-1小檗碱孵育诱
导的3T3L1细胞中分别加入含 0,1,10,100,1000
nmol·L-1胰岛素终浓度,培养48h,设空白对照组。
123 脂联素mRNA的表达 用半定量逆转录聚
合酶链反应(RTPCR)检测脂联素 mRNA的表达。
应用Trizol试剂盒提取诱导分化结束后的细胞总
RNA。用紫外分光光度计进行 RNA定量,用 A260与
A280的比值确定RNA的纯度。脂联素和βactin引物
由上海生物工程技术服务有限公司合成。脂联素上
游引物 5′AAGGACAAGGCCGTTCTCT3′;下游引
物 5′TATGGGTAGTTGCAGTCAGTTGG3′,PCR
产物为222bp。βactin上游引物 5′CCAGGGTGT
GATGGTGGGAATG3′;下游引物 5′CGCACGATT
TCCCTCTCAGCTG3′,PCR产物为 510bp。RT:各
样本取 1μg的 RNA,加入 DEPC水至体积为 1575
mL,70℃水浴 5min,后加入 5×RTbufer5μL,
RNasin10μL,MMLV10μL,dNTP125μL,20pmol
·L-1oligodT10μL,总体积为 25μL,42℃水浴 20
min,冰上终止反应。PCR反应:脂联素反应体系为
cDNA20μL,10×PCRbufer25μL,MgCl215μL,
dNTP05μL,10pmol·L
-1上下游引物各 10μL,Tag
酶 25U,DEPC水补足 25μL;βactin反应体系为
cDNA10μL,10×PCRbufer25μL,MgCl215μL,
dNTP05μL,10pmol·L
-1上下游引物各 05μL,Tag
酶25U,DEPC水补足25μL。扩增条件:95℃预变
性5min,之后95℃变性20s,62℃退火20s,72℃
延长30s,扩增 30个循环,最后 72℃延长 10min。
PCR产物的检测:取 PCR产物5μL,15%琼脂糖凝
胶,100V×30min电泳,紫外线透视仪显影拍照,
Kodakdiginitalscience30分 析 结 果,并 计 算
adiponectin/βactin。
13 统计学处理 数据以珋x±s表示,两组比较用
t检验。
2 结果
21 总RNA的提取和鉴定 RNA经提取后,所有
样品 A260与 A280的比值均在19~23。
22 RTPCR产物的合成和鉴定 3T3L1总 RNA
经RTPCR后的产物进行电泳,与 Marker比较,PCR
产物片断与预期结果(222bp)一致。各组每一样品
RTPCR产物电泳均可在222bp处有清晰的扩增条
带,说明脂联素mRNA扩增的结果是可靠的(图1)。
图1 脂联素mRNA的PCR产物电泳图
23 小檗碱对脂联素基因表达的影响 经灰度扫
描和内标βactinmRNA校正,小檗碱孵育48h后,脂
联素mRNA表达显著增加,较空白组增加 184%
(P<005,表1)。
24 胰岛素对小檗碱增加脂联素表达的影响 10
μmol·L
-1小檗碱孵育后加入不同浓度的胰岛素作用
48h,脂联素表达逐渐降低,在较低浓度(胰岛素浓
度低于100nmol·L-1)时,脂联素表达的降低没有统
计学意义;胰岛素浓度增加到 100nmol·L-1及以上
时,脂肪细胞的脂联素表达较小檗碱组有显著意义
的降低(P<005,表 1)。同空白对照组相比,加入
胰岛素后脂联素表达有下降,但无统计学意义。
表1 小檗碱及不同浓度胰岛素对脂
联素mRNA表达的影响(珋x±s)
组别 胰岛素剂量/nmol·L-1 AdmRNA
对照组 086±027
小檗碱组 102±0191)
小檗碱+胰岛素组 1 079±023
10 076±021
100 070±0172)
1000 067±0192)
注:与空白对照组比较1)P<005;与小檗碱组比较2)P<005
3 讨论
小檗碱是黄连的主要成分,在体内外均具有降
血糖作用,并在临床用药中发现能改善胰岛素抵
抗[3]。脂联素是近几年才发现的脂肪细胞因子,又
称为Acrp30,GBP28,apM1,AdipoQ。它是一种胶原蛋
白,在脂肪细胞中特异性表达,在血清中以较高浓度
存在。在肥胖和胰岛素抵抗时该蛋白表达受到抑
制。脂联素基因敲除小鼠与对照组相比有明显的胰
岛素抵抗[4]。本研究发现,在只加小檗碱的情况下
脂联素表达较空白对照组显著增加,说明小檗碱可
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直接增加离体脂肪细胞脂联素的基因表达,可能和
其改善机体的胰岛素抵抗相关。黄连是中医治疗消
渴症的常用药,小檗碱是黄连的主要成分,故其降血
糖机制在一定程度上反映了黄连这一方面的作用。
10μmol·L
-1小檗碱能显著增加 3T3L1脂肪细胞葡
萄糖的消耗和转运[5],最近的研究表明此浓度的小
檗碱可抑制脂肪细胞瘦素(leptin)和抵抗素(resistin)
的表达[6]。瘦素和抵抗素均是脂肪细胞因子,被认
为有增进胰岛素抵抗作用,而脂联素有改善胰岛素
抵抗的作用。小檗碱对这3种脂肪细胞因子的表达
调控均与其能促进胰岛素敏感性的临床效果一致。
本研究中,当小檗碱的培养液中加入过高浓度
胰岛素时,小檗碱的增加脂联素 mRNA表达的作用
受到抑制。胰岛素浓度达 100nmol·L-1和 1000
nmol·L-1,脂联素表达较只加小檗碱时显著降低,较
空白对照组也有降低。这提示可能体外高胰岛素浓
度导致的胰岛素抵抗和其直接作用,远远超过小檗
碱的促胰岛素敏感作用,或者小檗碱的增加胰岛素
敏感性作用被胰岛素所阻滞。小檗碱改善胰岛素抵
抗时血浆脂联素水平有无增高目前还未有文献报
道,其中的机制值得探究。
在对胰岛素抵抗具有基因易感性的恒河猴发生
2型糖尿病过程的纵向研究发现[2],脂联素与空腹
胰岛素水平呈负相关,但在2型糖尿病后期,胰岛素
水平很低,而脂联素分泌仍旧很少,说明高胰岛素不
能完全解释低脂联素水平,可能是脂肪细胞的胰岛
素功能或信号传导调节脂联素分泌,而不是胰岛素
的绝对水平在调节脂联素分泌。Bogan和 Lodish[7]
的研究发现 3T3L1脂肪细胞分泌脂联素需要磷脂
酰肌醇3激酶(PI3K),而 PI3K是胰岛素信号通路
的主要介质。2型糖尿病患者的脂肪细胞中,胰岛
素激活的胰岛素受体亚基1(IRS1)相关性 PI3K活
性下降[8]。由此推论可能是胰岛素降低脂肪细胞
PI3K的活性使脂联素表达水平下降。小檗碱和胰
岛素是否在此有共同作用位点;或者虽然不是同一
个作用位点,但高剂量胰岛素对脂肪细胞的急性作
用掩盖了小檗碱的促进作用,这些仍需进一步研究。
本研究发现小檗碱单独作用可使 3T3L1细胞
脂联素表达显著增加,但高胰岛素浓度抑制该作用。
为进一步阐明脂联素表达的调控机制和探讨中药小
檗碱的降血糖、改善胰岛素抵抗作用途径提供了有
力佐证。
[参考文献]
[1] 谢明智.中药抗糖尿病的药理作用.中国中西医结合杂志,
2001,21:318.
[2] HotaK,FunahashiT,BodkinNL,etal.Circulatingconcentrations
oftheadipocyteproteinadiponectinaredecreasedinparalelwithre
ducedinsulinsensitivityduringtheprogressiontotype2diabetesin
rhesusmonkeys.Diabetes,2001,50(5):1126.
[3] 张 洁,王立琴,于健华.芪黄胶囊合盐酸小檗碱治疗2型糖尿
病临床观察.山东中医杂志,2003,22(10):598.
[4] KubotaN,TerauchiY,YamauchiT,etal.Disruptionofadiponectin
causesinsulinresistanceandneointimalformation.JBiolChem,2002,
277:25863.
[5] 周丽斌,扬 颖,唐金凤,等.小檗碱对脂肪细胞糖代谢的影响.
上海第二医科大学学报,2002,22:412.
[6] 周丽斌,陈名道,宋怀东,等.小檗碱对脂肪细胞瘦素和抵抗素
基因表达的影响.中华内科杂志,2004,43(1):56.
[7] BoganJS,LodishHF.Twocompartmentsforinsulinstimulatedde
finedbyendogenousACRP30andGLUT4.JCelBiol,1999,146:
609.
[8] SmithU,AxelsenM,CarvalhoE,etal.Insulinsignalingandaction
infatcels:associationswithinsulinresistanceandtype2diabetes.
AnnNYAcadSci,1999,892:119.
EfectsofberberineonadiponectinmRNAexpressionin3T3L1adipocyte
GUWei,ZENGWenheng,HUHaiying
(The2ndAfiliatedHospital,MedicalColege,ZhejiangUniversity,Hangzhou310009,China)
[Abstract] Objective:ToexploretheefectsofberberineandinsulinonadiponectinmRNAexpressionin3T3L1adipocyte.Method:
The3T3L1adipocytewastreatedwithberberineandinsulinfor48hours,thelevelofadiponectinmRNAin3T3L1adipocyteexpressionwas
determinedwithsemiquantityRTPCRusingβactinasinternalreference.Result:ThelevelofadiponetinmRNAin3T3L1adipocytewasin
creasedaftertreatedwithberberineonly(P<0.05),theefectofberberinewasinhibitedbyhighconcentrationinsulin(P<005).Conclu
sion:invitro,berberineincreasestheexpressionofadiponectinin3T3L1adipocyte,insulininhibitstheefectofberberine.
[Keywords] berberine;adiponectin;insulin;3T3L1adipocyte [责任编辑 方文贤]
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