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Study on ligustrazine in reversing multidrug resistance of HepG2/ADM cell in vitro

川芎嗪逆转HepG2/ADM细胞多药耐药性的体外研究



全 文 :的应用 1 济南 }山东科学技术出版社 1t||y1
≈x  崔晓波 o傅国辉 o姜晓姝 o等 1 红细胞膜带 v蛋白及膜流动性在
病理状态下的变化 1 哈尔滨医科大学学报 ousss ovwkyl }v|y1
≈y  王 翔 o吴泽志 o宋关斌 1‹÷’ 体系对红细胞膜蛋白巯基修饰
及膜粘弹性的影响 1生物物理学报 ot||{ otwkul }vyz1
Στυδψ ον τηε εφφεχτσ οφ τωο κινδσ οφ χαχτυσ πολψσαχχηαριδε ον
ερψτηροχψτε µεµ βρανε προτειν ανδ φλυιδιτψ οφ τηελιπιδ ιν Σt{s µιχε
Œ ≠∏2¥¬±oŒ ≤«¨ ±2©¨ ±ªo’˜ ÷¬¤±ªoŠ„’ ≥«¬2¼²±ª
( Ποστδοχταλ Ρεσεαρχη οφ τηε Ινστιτυτε οφ Ματερια Μεδιχα , Ηαρβιν Υνιϖερσιτψ οφ Χοµ µερχε , Ηαρβιν txsszy , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¶·∏§¼·«¨ ©¨©¨¦·¶²©·º²®¬±§¶²©¦¤¦·∏¶³²¯¼¶¤¦¦«¤µ¬§¨ ²± …¤±§v ³µ²·¨¬±o¦µ²¶¶2¯¬±®¬±ª³µ²·¨¬±¤±§ ¬¯³¬§©¯∏2
¬§¬·¼ ²© µ¨¼·«µ²¦¼·¨ ° °¨¥µ¤±¨ ¬± ≥t{s °¬¦¨1 Μετηοδ : ׫¨ ° °¨¥µ¤±¨ ³µ²·¨¬±¦²±·¨±·º¤¶¤±¤¯¼¶¨§¥¼ ≥⁄≥2°„Š∞1 ¬³¬§©¯∏¬§¬·¼ º¤¶° ¤¨¶∏µ¨§
¥¼ ≥®¬±¬·½®¼ ° ·¨«²§1 Ρεσυλτ : ׫¨ ·º² ®¬±§¶²©¦¤¦·∏¶³²¯¼¶¤¦¦«¤µ¬§¨ ¬±¦µ¨¤¶¨§·«¨ ¦²±·¨±·²© …¤±§v ³µ²·¨¬± ¤±§ §¨¦µ¨¤¶¨§·«¨ ¦²±·¨±·²©
¦µ²¶¶2¯¬±®¬±ª³µ²·¨¬±oµ¤¬¶¨§·«¨ ¬¯³¬§©¯∏¬§¬·¼1 • «¬¯¨ ·«¨ ©¨©¨¦·²© ° §¨¬¤± §²¶¨ ªµ²∏³²© ° §¨¬¦¤¯ ¦¤¦·∏¶³²¯¼¶¤¦¦«¤µ¬§¨ ¬¶√ µ¨¼ µ¨°¤µ®¤¥¯ k¨ Π
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° °¨¥µ¤±¨ ©∏±¦·¬²± ²©·∏°²µ2°¬¦¨ o·«¨ ¼ ±¨«¤±¦¨§·«¨ ¬°°∏±¨ ©∏±¦·¬²±oº«¬¦« °¤¼ ¥¨ ²±¨ ²©¤±·¬2·∏°²µ° ¦¨«¤±¬¶°¶1
[ Κεψ ωορδσ] ¦¤¦·∏¶~³²¯¼¶¤¦¦«¤µ¬§¨ ~¥¤±§v ³µ²·¨¬±~¦µ²¶¶2¯¬±®¬±ª³µ²·¨¬±~ ¬¯³¬§©¯∏¬§¬·¼
≈责任编辑 方文贤 
川芎嗪逆转 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞多药耐药性的体外研究
梅 英 o石毓君 o左国庆 o龚建平 3 o刘长安 o李旭宏 o任孟军
k重庆医科大学 附属第二医院胆肝外科 o重庆 wssstsl
≈摘要  目的 }研究川芎嗪对人肝癌多药耐药细胞系 ‹ ³¨Šur„⁄ 多药耐药性的逆转效应及对 °2ª³tzs表达的
影响 o深入探讨川芎嗪逆转肿瘤细胞多药耐药的机理 ∀方法 }应用细胞培养 !细胞毒实验 !• ×2°≤• !流式细胞仪等方
法 o观察川芎嗪对体外培养 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞的逆转作用 ∀结果 }川芎嗪可以使细胞膜表面的 °2ª³tzs表达减弱 o增
加阿霉素对 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞的毒性 ~• ×2°≤• 结果表明川芎嗪可以使 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞的 °§µt基因表达减弱 ~流式
细胞仪检测结果表明川芎嗪可以使 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞内罗丹明2tuv的浓度增加 o从而增加阿霉素对 ‹ ³¨Šur„⁄ 细
胞的毒性 ∀结论 }川芎嗪具有在体外逆转 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞多药耐药的效应 o具有临床应用前景 ∀
≈关键词  川芎嗪 ~逆转 ~多药耐药性
≈中图分类号  • u{x1x ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukusswlts2s|zs2sw
≈收稿日期  ussw2st2tx
≈基金项目  重庆市卫生局中医药课题k渝中医1ussu22v|l
≈通讯作者  3龚建平 oר¯ }ksuvlyv{w{{wu oƒ¤¬}ksuvlyvzsyxu{ o
∞2°¤¬¯}ª²±ª­¬¤±³¬±ªtt ƒ «²·°¤¬¯1¦²°
化学治疗是治疗人体恶性肿瘤的重要手段之
一 o然而肿瘤细胞对化疗药物产生的多药耐药k°∏¯2
·¬§µ∏ªµ¨¶¬¶·¤±¦¨ o⁄• l是肿瘤化疗失败的主要原因 ∀
所谓肿瘤多药耐药是指肿瘤细胞接触了一种药物
后 o不仅对该药物产生耐受性 o且对其他结构和作用
机制不同的药物也产生耐受 ∀现国内外≈t 许多研究
证实了肿瘤多药耐药是由 °糖蛋白k°2ª³tzsl介导 o
°2ª³tzs为细胞膜表面的一种分子量约 tzs Ž⁄的糖
蛋白 o钙离子拮抗剂通过与抗肿瘤药物竞争结合 °2
ª³tzs的药物结合位点 o竞争性抑制 °2ª³tzs外排药
物而逆转耐药 ∀自 ׶∏µ±²¤等报道异搏定 k ∂ µ¨¤2
³¤°¬¯l具有逆转肿瘤细胞耐药性以来 o相继发现了
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第 u|卷第 ts期
ussw年 ts月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1u| oŒ¶¶∏¨ ts
’¦·²¥¨µoussw
环胞霉素 !三氟拉嗪等多种化学增敏剂 o由于这些药
物具有严重的心 !肾毒性 o使其临床应用受到限制 ∀
川芎嗪k¯¬ª∏¶·µ¤½¬±¨ l又名川芎嗪 t号碱 o化学名
为 u ov ox oy2四甲基吡嗪 o简称四甲基吡嗪k·¨·µ¤°2
·¨«¼¯³¼µ¤½¬±¨ oא°l o为中药川芎的有效成分之一 o具
有钙通道阻滞活性≈u ov  ∀本实验旨在探讨中药钙离
子通道拮抗剂川芎嗪对多药耐药细胞系 ‹ ³¨Šur
„⁄ 的 ⁄• 逆转作用 ∀
1 材料和方法
111 材料和仪器 实验用肝癌细胞株 ‹ ³¨Šu o
‹ ³¨Šur„⁄k阿霉素耐药株l由本实验室保存 ∀ • °2
Œ2tyws购自 ŠŒ…≤’公司 o胎牛血清购自 ‹¼¦¯²±¨ 公
司 o阿霉素k„⁄l o塞唑蓝k××l购于 ≥¬ª°¤公司 o川
芎嗪由上海第一制药厂出品 o°2ª³tzs 单抗购于
≤«¨ °¬¦²±公司 o°§µt2¦⁄‘„ 扩增引物 }上游 }xχ2„׊
≤׊ Š×Š ××× ŠŠ„ Š„2vχ ~下游 }xχ2„Š≤ ≤„Š „„≤
„×× ≤≤× ≤≤2vχ ~内参 Β2„¦·¬±扩增引物序列 o上游 }
xχ2„≤≤ „≤„ Š≤× „Š„ ŠŠŠ „„„ ×≤Š2vχ ~下游 }xχ2
„Š„ ŠŠ× ≤×× ×„≤ ŠŠ„ ×Š× ≤„„ ≤Š×2vχ o引物由上
海生工合成 ∀
≤’u培养箱 }‘˜„¬µ¨k美国l ~°≤• 仪 }×2³¨µ¶²±¤¯
k德国l ~凝胶成像系统 }…Œ’2• „⁄k美国l o流式细胞
仪 }ƒ„≤„2¦¤±k美国l ~电泳仪 }…Œ’2• „⁄k美国l o酶标
仪 }…Œ’≤∞2suk中国l ~超净工作台 }≥• 2≤k中国l ~
倒置显微镜 }’¯ ¼°³∏¶°‹2u型k日本l
112 细胞培养及 °2ª³tzs的检测 将 ‹ ³¨Šu细胞
置于含 ts h 胎牛血清的 • °Œ2tyws 培养基中 o在
x h ≤’u的培养箱内培养 ~‹ ³¨Šur„⁄ 细胞培养在
含终浓度阿霉素为 w1s Λª#°pt培养基中 o其余条件
与 ‹ ³¨Šu细胞相同 ∀ °2ª³tzs的检测按照北方同正
≥°显色试剂盒说明书进行 }细胞贴片 o待生长至对
数生长期 o终止培养 o{s h丙酮固定 x °¬±o按 ≥°显
色试剂盒说明书逐步进行 ∀细胞膜表面有红色或棕
色标记的为阳性细胞 o无该标记的为阴性细胞 ∀
113 体外细胞毒实验 参照 ≥¦«¨ ·¯¨°¤≈w 的 ××
法 o并作修改 ∀取对数生长期的 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞 o
以v ≅ tsv 细胞r孔的量接种于 |y 孔板中 ovz ε o
tss h湿度 !含 x h ≤’u 和 |x h空气用培养瓶在培养
箱内培养 uw «∀将细胞分为实验组和对照组 ∀实验
组 t加不同浓度的川芎嗪氯化钠溶液 o实验组 u加
入终浓度为 w1s Λª#°pt的阿霉素 o实验组 v为同时
加入不同浓度的川芎嗪氯化钠溶液和终浓度为 w1s
Λª#°pt的阿霉素 o对照组为不加任何药物的阴性
对照 ∀各组加样后继续培养 zu «o再加入 ××培养
w «吸弃 o加 ≥⁄≥显色 o在酶标仪上测出各孔 Αxws o用
下式计算细胞存活率 !死亡率及逆转倍数 o实验重复
v次 ∀细胞存活率k h l € k剂量组 Αxws平均值2空白
组 Αxws平均值lrk阴性对照组 Αxws平均值2空白组
Αxws平均值l ≅ tss h ~细胞死亡率k h l € t p细胞存
活率 ~逆转倍数 €逆转剂加抗癌药物组细胞死亡率r
抗癌药物组细胞死亡率 ∀
114 川芎嗪k א°l对 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞内 °§µt的
影响 各浓度 א° n w1s Λª# °pt阿霉素处理
‹ ³¨Šur„⁄ 细胞 zu «后 o计数 o取 t ≅ tsy个细胞以
·µ¬½²¯ o氯仿提取总 • ‘„ o以随机引物进行逆转录反
应 o取 ¦⁄‘„进行 °≤• 扩增k扩增条件 }|w ε u °¬±~
|w ε wx¶~xw ε t °¬±~zu ε t °¬±~ws ¦¼¦¯¨ ¶~最后 zu
ε 延伸 ts °¬±l o°≤• 产物以 t1x h 琼脂糖凝胶电
泳 o紫外灯下观察并成像 ∀阳性标本可在 xts ¥³处
出现明显条带 o实验重复 v次 ∀
115 流式细胞仪分析kƒ≤lא°对 ‹ ³¨Šur„⁄ 细
胞内 „⁄ 浓度的影响 各浓度 א° n w1s Λª#°pt
阿霉素处理 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞 zu «后 os1ux h 的胰
酶消化 o离心 o°…≥清洗 u次 o加入 t{s ±ª#°pt罗丹
明2tuv继续培养 ys °¬±o上机检测 ∀
116 统计学处理 均数比较用 τ检验 ∀
2 结果
211 从图 t可见 o‹ ³¨Šur„⁄ 细胞的膜表面均可
见棕红色标记出现 o表达 °2ª³tzs极强 o‹ ³¨Šur„⁄
细胞具有多药耐药性 ∀从图 u可见 ‹ ³¨Šur„⁄ 细
胞在含有 ty Λª#°pt的 א°和 w1s Λª#°pt阿霉素
培养基培养 zu «后 o‹ ³¨Šur„⁄ 细胞膜表面隐约可
见棕色标记 o表达 °2ª³tzs 的强度明显减弱 o提示
א°可以减少 °2ª³tzs的表达 ∀
图 t ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞的膜表面均可见棕红色标记出现
212 א°逆转 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞对 „⁄ 的耐药性
作用 结果见表 t ∀ א°在 u ∗ ty Λª#°pt的剂量
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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图 u ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞与 ty Λª#°pt的 א°共同培养
后 o‹ ³¨Šur„⁄ 细胞膜表面隐约可见棕色标记减弱
内对细胞无毒性 o细胞的死亡率为 s ~w1s Λª#°pt的
„⁄ 可致 tu h细胞死亡 o说明 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞对
具有耐药性不同浓度的 א°与含有 w1s Λª#°pt的
„⁄ 共同加入培养基 o‹ ³¨Šur„⁄ 细胞死亡率均
比相同条件下只有 w1s Λª# °pt的 „⁄ 作用于
‹ ³¨Šur„⁄ 细胞时增加 o且此作用随着 א°浓度
增大而增大 o由kut ? t1yvl h上升到k{| ? v1uvl h o
逆转倍数由 t1zx上升到 w1wu o统计学结果提示这两
组比较均有显著性差异k Π s1stl o提示 א°有逆
转 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞多药耐药的作用 ∀
213 א°对 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞 °§µt2°• ‘„ 表达的
影响 由图 v可见 o在 א°的浓度为 u Λª#°pt时 o
‹ ³¨Šur„⁄ 细胞的 °§µt2°• ‘„ 表达较强 o但其表
达可为 א°的作用所抑制 o且随 א°作用浓度的逐
渐提高 o°§µt2°• ‘„ 的表达渐弱 o至 ty Λª#°pt时
只能见微弱的 xts ¥³条带出现 ∀
214 א°对 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞内 „⁄ 的影响 从
图 w ∗ 图 {可见 o未经 א°处理和经 u Λª#°pt的
א°处理的 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞内罗丹明2tuv的含量
较低 o且随着 א°处理浓度的增加 o‹ ³¨Šur„⁄ 细
胞内罗丹明2tuv的含量也增加 ∀
3 讨论
本实验结果发现 א°能提高 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞
内阿霉素的浓度 o增加细胞对阿霉素的敏感性 o且
א°还对 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞膜表面的 °2ª³tzs量有
影响 o当 א°的浓度达到 ty Λª#°pt时 o可以下调
°§µt基因的表达 o使细胞膜表面的 °2ª³tzs量减少 o
从而达到部分逆转 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞多药耐药的作
用 o其逆转倍数可达到 w1wu倍 ∀
表 t א°对 ‹ ³¨Šur„⁄ 细胞耐 „⁄ 的逆转作用
分组
א°的浓度
u Λª#°pt
致死率r h 逆转率r h
w Λª#°pt
致死率r h 逆转率r h
{ Λª#°pt
致死率r h 逆转率r h
ty Λª#°pt
致死率r h 逆转率r h
阴性对照 s s s s
川芎嗪 s s s s
阿霉素 tu ? s1vt tu ? s1vt tu ? s1vt tu ? s1vt
川芎嗪 n阿霉素 ut ? t1yv t1zx wy ? v1zx u1{v y{ ? w1uv v1yz {| ? v1uv w1wu
图 v • ×2°≤• 凝胶电泳图
1°¤µ®¨µ~t1u Λª#°ptא° ~u1 w Λª#°ptא° ~
v1{ Λª#°ptא° ~w1ty Λª#°ptא°
目前 o已经认识到肿瘤细胞产生耐药主要涉及
到以下 v个方面≈x  }≠ °§µt基因诱导 °2ª³tzs过度
表达 o多药耐药相关蛋白k • °l及肺耐药相关蛋白
k• °l的异常表达也受到重视 ~ 酶系统异常 o包括
Š≥‹ oŠ≥× o⁄‘„2拓扑异构酶kג°2ul和 °2ª³tzs磷酸
化相关酶 °Ž≤活性改变 ~≈ ¥¦¯2u基因高表达是抑制
肿瘤细胞凋亡 !导致肿瘤耐药的重要因素 ∀其中 °2
ª³tzs过度表达在 ⁄• 的发生中起了很重要的作
用 o经研究证明 °2ª³tzs是一种能量依赖型的外流
泵 o把细胞内的药物通过主动运输的方式泵到细胞
外 o使细胞内的药物浓度降到有效杀伤浓度以下 o从
而产生了耐药性 ∀
图 w 未经 א°处理的 ‹ ³¨Šur„⁄
细胞内罗丹明2tuv的含量
本实验表明 א°可不同程度的作用于 ⁄• 的
产生机制 o其增加阿霉素的细胞毒作用是通过钙拮
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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抗作用及降低谷胱甘肽2≥转移酶活性有关≈y  ~虽然
本实验只是部分下调 °2ª³tzs表达 o推测 א°还可
能影响 °§µt表达和 °2ª³tzs功能≈z  o需要实验进一
步证实 o但作者发现其逆转 ⁄• 作用却是肯定的 ∀
图 x 经 u Λª#°pt的 א°处理的 ‹ ³¨Šur„⁄
细胞内罗丹明2tuv的含量
图 y 经 w Λª#°pt的 א°处理的 ‹ ³¨Šur„⁄
细胞内罗丹明2tuv的含量
图 z 经 { Λª#°pt的 א°处理的 ‹ ³¨Šur„⁄
细胞内罗丹明2tuv的含量

图 { 经 ty Λª#°pt的 א°处理的 ‹ ³¨Šur„⁄
细胞内罗丹明2tuv的含量
总之 o川芎嗪具有逆转 ⁄• 的作用 ∀以往 ׶∏2
µ∏²等报道临床应用异搏定等钙通道拮抗剂逆转肿
瘤细胞 ⁄• 时 o有较大的毒副作用 o因而使其应用
受到限制 ∀而中药川芎嗪作用缓和 o毒副作用比较
小 o在逆转肿瘤细胞 ⁄• 方面有临床应用前景 ∀
≈参考文献 
≈t  ¬∏…o≥·¤µ¨± ∞ ⁄oŒº¤°∏µ¤ × o ετ αλ1  ¦¨«¤±¬¶°¶²©·¤¬²·¨µ¨2µ¨ ¤¯·¨§
§µ∏ªµ¨¶¬¶·¤±¦¨ ¬±³¤±¦µ¨¤·¬¦¦¤µ¦¬±²°¤1 ϑ Συργ Ρεσousst o||kul }tz|1
≈u  戴 辉 o罗绍凯 o尹爱华 o等 1 环孢菌素 ⁄衍生物 °≥≤{vv逆转
Žxyur„’u细胞多药耐药的研究 1 中华血液学杂志 oussu ouv
ktl }uv1
≈v  ²¶®¤·¨¯² ⁄o…¨ ±­¤® „ o¤®¨·¤∂ oετ αλ1≤¼·²·²¬¬¦ ©¨©¨¦·¶²©§¬¤½¨ ±¨ ¶²±
·∏°²µ¦¨¯¯¶¬± √¬·µ²1 Χηεµοτηεραπψoussu ow{ktl }vy1
≈w  ≥¦«¨ ·¯¨°¤  o•²°¬­± ≤ o≥·¨ ±¨¥µ∏ªª¨ Š oετ αλ1Œ±«¬¥¬·¬²± ²©¤³²³2
·²·¬¦ ³µ²·¨¬±¶ ¦¤∏¶¨¶ °∏¯·¬§µ∏ª µ¨¶¬¶·¤±¦¨ ¬± µ¨±¤¯ ¦¤µ¦¬±²°¤
¦¨¯¯¶1 Αντιχανχερ Ρεσousst outkxl }vtyt1
≈x  …µ¤§¯ ¼¨ Š o∏µ¤±®¤° ƒ o¬±ª ∂1  ¦¨«¤±¬¶° ²© °∏¯·¬§µ∏ªµ¨¶¬¶·¤±¦¨1 
…¬²¦«¬° Βιοπηψσ Αχτα ot||{ ow{ }{z1
≈y  ≥«¬¯²«  ≥ oƒµ¤±½¬¶®¤oŽ¤·«¬…oετ αλ1„¶¶¨¶¶°¨ ±·²© π2ª¯¼¦²³µ²·¨¬±o
ª¯∏¦·«¬±2²±¨ ¥¤¶¨§ §¨·²¬¬©¼¬±ª ±¨½¼° ¶¨¤±§ ²¤¯®¼¯ª∏¤±¬±¨ 2⁄‘„ ¤¯®¼¯2
·µ¤±¶©¨µ¤¶¨ ¤¶³²·¨±·¬¤¯ ¬±§¬¦¤·²µ¶²©¦²±¶·µ∏¦·¬√¨§µ∏ªµ¨¶¬¶·¤±¦¨ ¬± «∏2
°¤± ¦²¯²µ¨¦·¤¯ ·∏°²µ¶oϑ Χανχερ Ρεσot||t oxt }us|u1
≈z  梁 蓉 o杨平地 o陈协群 o等 1 川芎嗪和k或l环孢素 „对 ‹2ysr
‹×细胞耐药的逆转 1中华内科杂志 ot||| ov{kwl }uys1
Στυδψ ον λιγυστραζινειν ρεϖερσινγ µυλτιδρυγ ρεσιστανχε οφ ΗεπΓu/ Α∆Μχελλ ιν ϖιτρο
∞Œ ≠¬±ªo≥‹Œ ≠∏2­∏±o˜’ Š∏²2 ¬´±ªoŠ’‘Š ¬¤±2³¬±ªoŒ˜ ≤«¤±ª2¤±oŒ ÷∏2«²±ªo • ∞‘  ±¨ª2­∏±
( Τηε ∆επαρτµεντ οφ Ηεπατο2βιλιαρψ Συργερψ, Σεχονεδ Αφφιλιατεδ Ηοσπιταλ οφ Χηονγθινγ Μεδιχαλ Υνιϖερσιτψ, Χηονγθινγ wsssts , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¶·∏§¼·«¨ µ¨√ µ¨¶¨ ©¨©¨¦·²© ¬¯ª∏¶·µ¤½¬±¨ kא°l ²± ‹ ³¨Šur„⁄ o¤ «¨µ§²© «¨ ³¤·²¦¨¯¯∏¯¤µ¦¤µ¦¬±²°¤ ¦¨¯¯ o
°∏¯·¬§∏µªµ¨¶¬¶·¤±¦¨k⁄• l ¤±§·«¨ ¬±©¯∏¨ ±¦¨ ²©°2ª³tzs ¬¨³µ¨¶¶¬²±1 Μετηοδ : ׫¨ µ¨√ µ¨¶¨ ©¨©¨¦·²© ¬¯ª∏¶·µ¤½¬±¨ ²± ‹ ³¨Šur„⁄ ¦¨¯¯ º¤¶²¥2
¶¨µ√ §¨oº¬·«·«¨ ° ·¨«²§¶²©¦¨¯¯ ¦∏¯·∏µ¨ o××χ¶¤±¤¯¼½¨ o• ×2°≤• ¤±§ƒ¯ ²º ¦¼·²° ·¨µ¬¦o ·¨¦1 Ρεσυλτ : ¬ª∏¶·µ¤½¬±¨ ¦²∏¯§°¤®¨ ⁄• ²©¦¨¯¯ ¬¯±¨
²© ‹ ³¨Šur„⁄ µ¨§∏¦¨ ·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©°2ª³tzs o ±¨«¤±¦¨ ·«¨ §¨ ±¶¬·¼ ²©¤§µ¬¤°¼¦¬±¬± ¦¨¯¯ ¤±§¬±¦µ¨¤¶¨ ·«¨ ¤§µ¬¤°¼¦¬±χ¶¦¼·²·²¬¬¦¬·¼1 • ¬·«
·«¨ ƒ¯ ²º ¦¼·²° ·¨µ¬¦o·«¨ µ¨¶∏¯·¶²© • ×2°≤• ¶«²º §¨·«¨ ·µ¤±¶¦µ¬³·¬²±¤¯ ¤¦·¬√¬·¼ ²©·«¨ ⁄• t §¨¦µ¨¤¶¨§1 Χονχλυσιον :¬ª∏¶·µ¤½¬±¨ ¦¤± µ¨√ µ¨¶¨
⁄• ²© ‹≤≤ ¦¨¯¯ ¬¯±¨ ²© ‹ ³¨Šur„⁄ ¤±§«¤¶³µ²¶³¨¦·¬± ¦¯¬±¬¦¤¯ ∏¶¨1
[ Κεψ ωορδσ] ¬¯ª∏¶·µ¤½¬±¨ ~µ¨√ µ¨¶¤¯ ~ °∏¯·¬§∏µªµ¨¶¬¶·¤±¦¨ ≈责任编辑 方文贤 
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