全 文 :¦²³¯¤¶°¤³±¨ ∏°²±¬¤¨ q Μετηοδ : µ¤·°²§¨¯²© °¼¦²³¯¤¶°¤¯ ³±¨ ∏°²±¬¤k°l º¤¶§¨√¨¯²³¨ §¬± µ¨³¨ ¤·¨§¬±·µ¤±¤¶¤¯ ¬±©¨¦·¬²∏¶µ²∏·¨¶¤±§·«¨ ±
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©∏±¦·¬²± √¬¤³µ¨√ ±¨·¬±ª¥²·«¦¨¯¯∏¯¤µ¤±§«∏°²µ¤¯ ¬°°∏±¬·¼©µ²° §¨³µ¨¶¶¬²±¬±·«¨ µ¤·¶º¬·« ° q
[ Κεψ ωορδσ] ≤«¬±¨ ¶¨ ·µ¤§¬·¬²±¤¯ «¨µ¥¶~°¼¦²³¯¤¶°¤³±¨ ∏°²±¬¤¨ ~¦¨¯¯∏¯¤µ¬°°∏±¬·¼~«∏°²µ¤¯ ¬°°∏±¬·¼
≈责任编辑 方文贤
≈收稿日期 ussw2sw2tx
≈通讯作者 3 绪广林 oר¯ }ksuxl{vx|{|u{ o∞2°¤¬¯}¬∏§∏±¯²³
tuy1¦²°
西红花苷对大鼠实验性高脂血症的
影响及其机制研究
绪广林 3 o余书勤 o龚祝南 o张双全
k南京师范大学 生命科学院 新药研究中心 o江苏 南京 utss|zl
≈摘要 目的 }观察西红花苷对实验性高脂血症的影响并探讨其作用机制 ∀方法 }采用高胆固醇饮食饲养 ≥⁄
大鼠 u个月 o造成高脂血症模型 o观察西红花苷对大鼠血脂质的影响 ∀此外体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞
k≥≤l o以加高脂血清和加西红花苷等不同培养基分组培养 o用四甲基偶氮唑盐微量酶反应k××l法检测平滑肌细
胞活性 o以 • ¶¨·¨µ±杂交检测 ³v{ °磷酸化 ∀结果 }西红花苷能明显降低血胆固醇 o甘油三酯 !⁄含量 o升高
⁄及其亚型含量 ∀西红花苷可明显抑制高脂血清培养下 ≥≤的增殖 o其吸光度低于造模组 ∀高脂血清组磷酸化
³v{ °的表达有所增加 o加入西红花苷后可显著降低 ³v{°的活化 o并能逆转高脂血清诱导的 ≥≤ 增殖 ∀结
论 }西红花苷可有效地调整脂蛋白代谢 o抑制 ≥≤增殖 o并通过抑制 ³v{ °而使平滑肌细胞增殖减少 o从而防治
高脂血症 !阻止动脉粥样硬化发生发展 ∀
≈关键词 西红花苷 ~血管平滑肌细胞 ~³v{蛋白激酶
≈中图分类号 u{x1x ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussxlsx2svy|2sw
中药西红花又名番红花 !藏红花 o是鸢尾科植物
番红花 Χροχυσσατιϖυσ Λ1 的干燥柱头≈t o它在欧洲和
亚洲等地已经作为药用 o用于胃病 !麻疹 !黄疸 !肝脾
肿大 !中风瘫痪 !口眼歪斜 !骨节疼痛 !头眩发热等的
治疗 ∀ 5本草纲目6记载/西红花甘 !平 !无毒 o主治心
忧郁积 o气闷不散 o久食令人心喜 o又治惊悸0 ∀近年
流行病学研究表明 o西班牙人的心血管疾病的发病
率低可能与该地区长期服用西红花为佐料的食物有
关 ∀现已对西红花的化学成分进行了广泛而深入的
研究 o发现西红花苷是其中有效成分之一≈u ∀有研
究表明≈v o西红花苷能够抑制鹌鹑实验性动脉粥样
硬化的发生 o但对其作用机制缺乏深入的探讨 ∀鉴
于平滑肌细胞在动脉粥样硬化发生中的重要性 o作
者利用大鼠主动脉平滑肌细胞来研究西红花苷抗动
脉粥样硬化的作用机制 ∀
1 材料和方法
111 材料
11111 药品和试剂 西红花苷k西红花酸龙胆二糖
基l由本实验室自制 o用注射用生理盐水溶解后备
用 ∀胆固醇k南京生化制药厂l ~总胆固醇测定药盒 o
甘油酸酯测定药盒 o高密度脂蛋白胆固醇测定药盒
和低密度脂蛋白胆固醇测定药盒k南京建成生物工
程研究所l ~ °tyws 培养基 !胰蛋白酶ktΒuxsl
k¬¥¦²公司l o四氮唑蓝k××lk上海华美生物工程
公司l o高脂血清k自备 o测胆固醇 {ss h !甘油三酯
tss h l o小牛血清k杭州四季青生物工程有限公司l ~
吉非罗齐k无锡第七制药厂l o用 s1x h ≤≤2¤配成
浓度为 x °ª#°pt备用 ~磷酸化和非磷酸化的 ³v{
#|yv#
第 vs卷第 x期
ussx年 v月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vs o¶¶∏¨ x
¤µ¦«oussx
°多克隆抗体k≤¨¯¯≥¬ª±¤¯¬±ª× ¦¨«±²¯²ª¼l o×
显
色底物k°µ²°¨ ª¤l o׺¨ ±¨ us o甘氨酸k°µ¨¶¦²l o丙烯
酰胺k²√¤分装l o双丙烯酰胺k日本三菱株式会
社l o°∂⁄ƒ膜k²¦«¨ l o辣根过氧化物酶偶联羊抗兔
二抗 !°°裂解液k上海申能博彩公司l o其他试剂
均为分析纯 ∀
11112 仪器 ≥¨ µ¬¨¶xwss ≤u培养箱k美国 °≤
公司产品l ~倒置相差显微镜k重庆光学仪器厂l ~≥•
p ≤p 净化工作台k苏净集团苏州安泰空气技术
有限公司l ~⁄ p vsuu型酶联免疫检测仪k国营华
东电子管厂l ~台式高速离心机k∞³³¨ ±§²µ© ¦¨±·µ¬©∏ª¨
xwtz l ∀
112 方法
11211 动物及分组 健康 ≥⁄大鼠 xs只 o雄性 o体
重 txs ∗ t{s ªo购自东南大学丁家桥校区实验动物
中心 o随机分为 x 组 ∀普食对照组 !高脂组 !西红
花苷高剂量组kuss °ª#®ªptl !西红花苷低剂量组
ktss °ª#®ªptl !吉非罗齐组kxs °ª#®ªptl ∀普食
组喂以基础饲料 o其余 w组给予高脂饲料 ∀高脂组
按文献所述给药≈w ∀治疗组每天灌胃给药 o其间
每隔 u周称重 t次 o以调整给药剂量 ∀以上动物均
自由进水 o于 ys §结束实验取血按试剂盒说明书
进行检测 ∀
11212 大鼠主动脉平滑肌细胞培养 无菌条件下
迅速取出大鼠胸主动脉 o在含高双抗k青霉素和链霉
素l¤±®. ¶溶液中冲洗数次 o洗掉残余血污 ∀仔细
剥离外膜和内膜 o然后将所剩中膜以干净 ¤±®. ¶液
冲洗数次 o用眼科剪将平滑肌剪成 t °°v小块 o用玻
管将组织块送入培养瓶内 o加入含 ts h小牛血清的
°tyws培养液 o塞紧瓶塞 o翻转培养瓶 o使组织块
位于培养瓶上方 o置 vz ε x h ≤u培养箱内使组织
块略行干燥 o约 w «后翻转培养瓶 o使组织块浸入培
养液中 o静置 x §后观察及换液 ∀此时可见多角形
细胞从组织块边缘长出 o并逐渐形成生长晕 o细胞在
光镜下呈典型的峰2谷状 ∀实验用生长良好的第 w ∗
ts代 ∀
11213 细胞分组 将生长融合后的细胞用胰酶消
化 o制成 t1s ≅ tsw#°pt混悬液 o接种于 |y孔培养
板 o待其生长贴壁后 o再以含 s1x h小牛血清的 °2
tyws培养液培养 uw «o使其同步化 o然后换用不
同培养液继续进行培养 ∀实验分组如下 ∀正常培养
组 }依然采用正常培养基 ~高脂血清组 }换用高脂血
清培养基 ~加药组 }换用含不同药物浓度的高脂血清
培养基 o西红花苷终浓度分别为 t1s ≅ tsp z ot1s ≅
tsp y ot1s ≅ tsp x °²¯#pt ∀
11214 平滑肌细胞增殖能力的测定 ×× 比色
法≈x }细胞与药物作用到指定时间后 o每孔加入 ××
溶液kx ª#ptlus Λovz ε 继续培养 w «∀终止培养
后吸去上清液 o每孔加入 txs Λ⁄≥ o震荡混匀 ∀
然后在酶联免疫检测仪上选用 xzs ±°波长测定各
孔吸光度 o结果以 Α值表示 ∀增殖抑制率按下式表
示 }
增殖抑制率k h l 高脂血清组 Αxzs p加药组 Αxzs加药组 Αxzs ≅ tss h
11215 • ¶¨·¨µ±2
¯²·杂交检测 ³v{°磷酸化
将细胞按 t ≅ tsy#°pt密度接种于 y孔板 o{s h融
合后换无血清同步化 uw «o加入高脂血清或含不同
浓度药物的培养液进行处理 ∀然后 °
≥洗细胞 u
次 o将各组细胞悬浮于 °° 裂解液 k含 ×µ¬·²±÷2
tss o去氧胆酸钠 o°2ws o偏钒酸钠 o∞⁄× o∞× o
³µ²·¬±¨ o°≥ƒ等l中 o冰上裂解 vs °¬± ow ε tu sss
µ#°¬±pt离心 x °¬±后取上清 o考马斯亮蓝蛋白测定
试剂盒定量后 o加入上样缓冲液 o|x ε 加热 x °¬± o
每孔 {s Λª总蛋白上样 o用 ts h ≥⁄≥ °∞分离 o电
转移到 °∂⁄ƒ膜上 o用含 x h脱脂奶粉的 ×
≥× kt ≅
×
≥ os1t h ׺¨ ±¨ usl封闭 ∀分别与磷酸化和非磷
酸化的 ³v{ °多克隆抗体 w ε 过夜 o与辣根过
氧化物酶偶联的二抗室温 t «o×
底物显色并扫
描结果 ∀
113 统计学处理
所有数据均以 cξ ? σ表示 oτ检验进行显著性检
验 ∀
2 结果
211 血清胆固醇含量的变化
实验结束时取血测定血清胆固醇 ∀结果表明造
模组大鼠血清胆固醇 !甘油三酯 !⁄含量明显高于
普食对照组k Π s1stl ∀西红花苷治疗组 !吉非罗
齐组的血清胆固醇 !甘油三酯 !⁄含量明显低于造
模组k Π s1stl o两西红花苷治疗组之间无明显差
别 ∀说明西红花苷可明显降低血清胆固醇 !甘油三
酯 !⁄含量 o对高脂血症具有显著治疗意义k表
tl ∀
212 血中 ⁄及其亚型的变化
结果表明 o高脂组 ⁄o⁄2u o⁄2v含量明显
#szv#
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ussx年 v月
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∂²¯1vs o¶¶∏¨ x
¤µ¦«oussx
表 t 西红花苷对大鼠血清胆固醇
含量的影响kcξ ? σ, ν tsl °°²¯#pt
组 别 甘油三酯 胆固醇 ⁄
普食对照组 vs qt ? w qv ys qu ? z qt uu qt ? v qv
高脂组 xs qt ? { qstl |w qu ? { qxtl xz q{ ? y qvtl
西红花苷高剂量组 vs qu ? v qwvl ys qz ? { quvl u| qz ? w q{vl
西红花苷低剂量组 vw q| ? x qxvl yv qz ? z q{vl vx qs ? x qtvl
吉非罗齐组 vt qu ? w qzvl ys qx ? | qxvl vt q| ? z qwvl
注 }与普食对照组比较tl Π s qst ~与高脂组比较ul Π s qsx o
vl Π s qst k表 u同l
低于普食对照组k Π s1stl o西红花苷给药组可明
显升高 ⁄o⁄2u o⁄2vk Π s1st或 Π s1sxl o
吉非罗齐组也有类似的作用k Π s1stlk表 ul ∀
表 u 西红花苷对大鼠血清中 ⁄o⁄2u o
⁄2v含量的影响kcξ ? σ, ν tsl °°²¯#pt
组 别 ⁄ ⁄2u ⁄2v
普食对照组 vy qt ? w qx uy qv ? v qu { qt ? s qz
高脂组 t{ qu ? v qwtl tu qt ? t q|tl w qz ? s qxtl
西红花苷高剂量组 u{ qw ? v q|vl ux qv ? u q|vl y qu ? t qtvl
西红花苷低剂量组 uu qu ? w q|ul ux qt ? v qsvl x qv ? s qzul
吉非罗齐组 uz qv ? w q{vl uu qy ? w qzvl x q| ? s q{vl
213 西红花苷对平滑肌细胞增殖的影响
高脂血清培养组平滑肌细胞 xzs ±°处的吸光
度明显高于普食对照组k Π s1stl o说明高脂血清
能明显促进平滑肌细胞的增殖 ∀西红花苷可明显抑
制由高脂血清所致的平滑肌细胞增殖 o且呈剂量依
赖性 ov 种浓度西红花苷的抑制率分别为 ts h o
tx h ovs h o而中高剂量组具统计学差异( Π s1stl ∀
以上结果提示西红花苷对于高血脂刺激造成的细胞
增殖具有显著治疗意义k表 vl ∀
表 v 西红花苷对高脂血清所致平滑肌细胞增殖的影响
组 别 Αxzs 抑制率r h
正常组 s qvuu ? s qsvs p
高脂血清组 s qwux ? s qst|tl p
西红花苷低剂量组 s qv{t ? s qstx ts
西红花苷中剂量组 s qvyv ? s qst{ul tx
西红花苷高剂量组 s qu|z ? s qsv{ul vs
注 }与正常组比较tl Π s qst ~与高脂血清组比较ul Π s qst
214 西红花苷对 ³v{°磷酸化的影响
高脂血清刺激平滑肌细胞后引起 ³v{ °的
磷酸化程度较正常组明显升高 o加入 s1t ≅ tsp y ∗ ts
≅ tsp y °²¯#pt的西红花苷后 o其磷酸化程度随西
红花苷浓度的增加而降低 o呈现出较好的剂量依赖
性 ot1s ≅ tsp x °²¯ #pt的西红花苷能使 ³v{ °
的磷酸化程度几乎降低至与对照组相当的水平k见
图 tl ∀
图 t 各浓度西红花苷对高脂血清诱导
³v{ °磷酸化程度的影响
3 讨论
自 t|s{年阿尼基柯夫用喂饲高脂 !高胆固醇复
制出动脉粥样硬化k¶l模型以来 o高脂血症已被大
家确认是 ¶发病的原因 ∀其中血浆总胆固醇 !甘油
三酯和 ⁄过高均为 ¶的主要危险因子 o而 ⁄
则因它能移除外周组织的胆固醇而非但不是 ≥的
危险因子 o相反有抑制 ¶发生发展的作用≈y ∀关于
¶的发生原因曾经提出过许多假设≈z o现在主要分
为两类 }其一是 ²¶¶于 t|{{年提出的与始动因子有
关的/损伤反应学说0 ∀其二是克隆假说 ∀不管是何
种学说均认为 o动脉血管膜内 ≥≤ 增殖是 ¶主要
特征 o在 ¶发病中起决定性作用 ∀西红花苷对实验
性动脉粥样硬化抑制作用的报道仅见于鹌鹑 o由于
鹌鹑的血管平滑肌细胞培养方法未见报道 o而大鼠
平滑肌细胞的培养方法已经较为成熟 o因此本实验
选用大鼠为实验对象 o不仅可以进一步验证西红花
苷的抗动脉粥样硬化作用 o而且可以利用培养的平
滑肌细胞对其作用机制作较深入地探讨 ∀
本实验发现 o西红花苷能明显抑制高脂饲料所
引起的血清胆固醇 !甘油三酯 !⁄含量的升高 o并
明显升高血清 ⁄的含量 o从而表现出对大鼠实验
性动脉粥样硬化良好的拮抗作用 o这一点与其他研
究相吻合 ∀有实验表明 o⁄能使 ≥≤ 增殖速度明
显加快 !而 ⁄则不引起 ≥≤ 增殖 o且高脂血清
⁄刺激 ≥≤ 增殖的作用要比正常血清 ⁄大得
多 ∀本实验结果显示 o高脂血清能够明显促进大鼠
平滑肌细胞的增殖 o其 ×× 吸光度显著增高 ~而加
入西红花苷后 o×× 吸光度与高脂血清组相比呈剂
量依赖性降低 o说明在体外培养条件下西红花苷能
够有效抑制高脂血清所致的平滑肌细胞增殖 ∀由上
可知 o西红花苷降血脂及对 ≥≤ 增殖的拮抗效应是
该药抗 ¶的机制之一 ∀
³v{°是存在于胞浆的蛋白质激酶 o在各种
细胞外刺激包括应激 !生长因子 !细胞因子和 蛋
#tzv#
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白偶联受体激活等作用下 o³v{°由于其三联区
的苏氨酸 !酪氨酸双磷酸化而激活 o导致细胞生长 !
增殖 !分化 ∀因此 o³v{°是细胞传递的交汇点
和共同通路≈{ o| o在细胞增殖中起着关键性的作用 ∀
研究发现 o±ª作为血管活性物质在刺激血管平滑
肌增殖肥大过程中 o是通过 ×t受体激活 °实
现的≈ts ∀作者用 • ¶¨·¨µ±2
¯²·杂交方法检测不同培
养条件下平滑肌细胞 ³v{°的表达水平 o结果显
示 o平滑肌细胞受到高脂血清刺激后 o磷酸化的
³v{°的表达显著增加 o而细胞活性检测显示该
组细胞增殖也随之增加 o两者呈正相关 ∀加入西红
花苷后 o可显著降低 ³v{°的活性 o同时细胞活
性检测显示该组细胞增殖也明显降低 o说明 ³v{
°的激活与平滑肌细胞增殖密切相关 ∀本实验
提示 ³v{°信号途径参与了血管平滑肌的增殖 o
对 ³v{°信号途径的干预可有效地阻止血管平
滑肌的增殖 o从而可能对平滑肌细胞增殖相关的疾
病起到一定的预防或治疗作用 o为今后治疗血管增
殖性疾病提供了新的思路 ∀
≈参考文献
≈t 徐国钧 q生药学 q北京 }人民卫生出版社 ot|{{ qwuu q
≈u 高文远 o朱大元 q番红花的化学及药理研究概况 q中草药 o
t||| ovskxl }v{| q
≈v 张陆勇 o季慧芳 o周素娣 o等 q西红花总苷对鹌鹑实验性动脉
粥样硬化的影响 q中国药科大学学报 ot||| ovskxl }v{v q
≈w 范英昌 o陆一竹 o张艳军 o等 q调肝导浊中药对大鼠实验性高
脂血症及主动脉平滑肌细胞增殖影响的实验研究 q中国老年
学杂志 oussu ouukvl }tuz q
≈x °¨ ¬2ƒ ±¨ª¬o ¤¬±¨ µ⁄¬¨·½o∏§¬ª¨µ√²± ¤µ¶§²µ©q ⁄¬©©¨µ¨±·¬¤¯ ©¨©¨¦·
²©«¼§µ²ª¨ ± ³¨µ²¬¬§¨ ¤±§¶∏³¨µ²¬¬§¨ ¤±¬²± ²± ¤³²³·²¶¬¶¤±§³µ²¯¬©¨µ¤2
·¬²± ²©√¤¶¦∏¯¤µ¶°²²·« °∏¶¦¯¨¦¨¯¯¶q Χιρχυλατιον ot||z o|y }vysu q
≈y 赵三妹 q动脉平滑肌细胞的培养方法及其应用 q中华病理学
杂志 ot|{z otykwl }uxs q
≈z 陈 宇 o王志武 q动脉粥样硬化发生相关因素研究现状及展
望 q国外医学#老年医学分册 ot||| ouskwl }twx q
≈{ ≠²²± ≤ o¤¼²∏±ªo≥¬²²±ªo ετ αλq°«²¶³«¤·¬§¼¯¬±²¶¬·²¯ v2®¬2
±¤¶¨ ¶·¬°∏¯¤·¨¶°∏¶¦¯¨§¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²± ¥¼ ¤¦·¬√¤·¬±ª³v{ °¬·²ª¨ ±2¤¦·¬2
√¤·¨§³µ²·¨¬± ®¬±¤¶¨ q Βιοχηεµ Βιοπηψσ Ρεσ Χοµ µυν ousss ouzykul }
xsu q
≈| ¤¬±ª¨¤∏§≥ o ∏³·¤≥ o ²ª¨µ¶ o ετ αλq°µ²2¬±©¯¤°°¤·²µ¼ ¦¼2
·²®¬±¨ ¶¤±§ ±¨√¬µ²±° ±¨·¤¯ ¶·µ¨¶¶¦¤∏¶¨ ³v{ °¬·²ª¨ ±2¤¦·¬√¤·¨§³µ²·¨¬±
®¬±¤¶¨ ¤¦·¬√¤·¬²±¥¼§∏¤¯ ³«²¶³«²µ¼¯¤·¬²±²±·¼µ²¶¬±¨ ¤±§·«µ¨²±¬±¨ q ϑ
Βιολ Χηεµ ot||x ouzs }zwus q
≈ts ≤«µ¬¶·¬¤± ∂ o ∂¥¤¯§² ≥ o ¬¨§¨ °¤µ¬¨ o ετ αλq ⁄¬©©¨µ¨±·¬¤¯ ¤¦·¬√¤·¬²±
²© °¬·²ª¨ ±2¤¦·¬√¤·¨§ ³µ²·¨¬± ®¬±¤¶¨ ¬± ¶°²²·« °∏¶¦¯¨ ¦¨¯¯¶ ¥¼ ¤±2
ª¬²·¨±¶¬± q Αρτεριοσχλερ Τηροµβ ςασχ Βιολousss ous }|ws q
Στυδψ οφ τηε εφφεχτ οφ χροχιν ον ρατ εξπεριµενταλ
ηψπερλιπεµια ανδ τηε υνδερλψινγ µεχηανισµσ
÷ ∏¤±ª2¯¬±o ≠ ≥«∏2 ¬´± o «∏2±¤±o ≥«∏¤±2 ∏´¤±
( Χεντερφορ ∆ρυγ Ρεσεαρχη ανδ ∆εϖελοπµεντ , Χολλεγε οφ Λιφε Σχιενχε , Νανϕινγ Νορµαλ Υνιϖερσιτψ, Νανϕινγ utss|z , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ ¶·∏§¼ ·«¨ ©¨©¨¦·²©¦µ²¦¬± ²± µ¤· ¬¨³¨µ¬° ±¨·¤¯ «¼³¨µ¯¬³¨ °¬¤ ¤±§¬·¶ ° ¦¨«¤±¬¶°¶q Μετηοδ : ¼³¨ µ¯¬³¨ °¬¤
°²§¨¯ º¤¶ ¶¨·¤¥¯¬¶«¨ §¥¼ ©¨ §¨¬±ª«¨ ¤√¼ ¦«²¯ ¶¨·¨µ²¯ ©²µu °²±·«¶¤±§·«¨ ©¨©¨¦·²©¦µ²¦¬± ²± ¥¯²²§ ¬¯³¬§¬± ¬¨³¨µ¬° ±¨·¤¯ «¼³¨µ¯¬³¨ °¬¤µ¤·¶º¤¶
²¥¶¨µ√ §¨q ²µ·¬¦¶°²²·« °∏¶¦¯¨¦¨¯¯¶º µ¨¨ ¦∏¯·∏µ¨§¬± §¬©©¨µ¨±·¦∏¯·∏µ¨ ° §¨¬¤¤±§³µ²¯¬©¨µ¤·¬²± º¤¶° ¤¨¶∏µ¨§¥¼ ×× ¤¶¶¤¼q • ¶¨·¨µ± ¥¯²·¬±ª
º¤¶∏¶¨§·² §¨·¨¦··«¨ ©¨©¨¦·²©¦µ²¦¬± ²± ³«²¶³«²µ¼¯¤·¬²± ²©³v{ °qΡεσυλτ : ≤µ²¦¬± ±²·²±¯¼ §¨¦µ¨¤¶¨§ªµ¨¤·¯¼·«¨ ¦²±·¨±·²©¦«²¯ ¶¨·¨µ²¯ o
·µ¬ª¯¼¦¨µ¬§¨ ¤±§§¨ ±¶¬·¼ ¬¯³²³µ²·¨¬±¬± ¥¯²²§o¥∏·¤¯¶²¬±¦µ¨¤¶¨§·«¨ ¦²±·¨±·²©«¬ª«§¨±¶¬·¼ ¬¯³²³µ²·¨¬±q± ¤§§¬·¬²±o·«¨ ³µ²¯¬©¨µ¤·¬²± ²©¶°²²·«
°∏¶¦¯¨¦¨¯¯¶¤±§·«¨ ¤¦·¬√¤·¬²± ²©³v{ °º µ¨¨ ¬±«¬¥¬·¨§¥¼ ≤µ²¦¬±q Χονχλυσιον : ≤µ²¦¬± ³µ¨√ ±¨·¶¤·«¨µ²¶¦¯ µ¨²¶¬¶¬± «¼³¨µ¯¬³¨ °¬¤o º«¬¦«
°¤¼ ¥¨ ° §¨¬¤·¨§¥¼·«¨ ¬±«¬¥¬·¬²± ²©¥²·«³µ²¯¬©¨µ¤·¬²± ²©¶°²²·« °∏¶¦¯¨¦¨¯¯¶¤±§¤¦·¬√¤·¬²± ²©³v{ °q
[ Κεψ ωορδσ] ¦µ²¦¬±~¶°²²·«¨ °∏¶¦¯¨¦¨¯¯¶~³v{ °
≈责任编辑 方文贤
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