全 文 ：#研究论文#
银杏单细胞克隆研究
戴均贵 o朱蔚华 o吴蕴祺 o胡 秋 o张大勇
k中国医学科学院 中国协和医科大学 药物研究所 北京 tsssxsl
≈摘要 目的 }利用银杏单细胞克隆系 o探索银杏内酯生产的稳定性与细胞均一性之间的关系 ∀方法 }利用植
物细胞平板技术培养 ∀结果 }2谷氨酰胺能大大促进银杏细胞的植板率 ~植板率在 s qx ∗ x qs ≅ tsw ¦¨¯¯# °¯ p t随密度
的增加而升高 ∀获得的 w{个克隆株系中 2uu株系银杏内酯
k
l含量高达 s qs|| h o且大部分克隆株系在继
代培养过程中能保持相对稳定 ∀结论 }在银杏组织培养过程中 o利用单细胞克隆技术可在一定程度上解决银杏内
酯生产不稳定性的问题 ∀
≈关键词 银杏 ~单细胞克隆 ~银杏内酯
≈中图分类号 xyz qt n | ≈文献标识码
≈文章编号 tsst2xvsukussslts2sx|v2sx
植物组织或细胞培养物由许多不均一的细胞组
成 o这些细胞在大小 !结构 !遗传 !生理生化生特征上
各不相同 o其代谢状态和合成次生代谢物的能力也
有很大的差别 ∀组织或细胞培养物中细胞的这种杂
和性也是造成培养物在连续培养过程中生长和次生
代谢产物合成不稳定的因素之一 ∀因此 o筛选生长
速度快 !次生代谢产物合成能力高且稳定的细胞系
是非常必要的 ∀
银杏植物体内所含的萜内酯主要有银杏内酯
kª¬±®ª²¯¬§¨¶o¶l o
o≤ oo 和白果内酯k¥¬¯²2
¥¤¯¬§¨ o
l o均为银杏植物所特有 ∀ 是天然的血
小板活化因子k°ƒl受体特异拮抗剂 o对治疗哮喘 !
内毒素休克 !器官移植排斥反应 !心脑血管疾病及多
种炎症均有较好的效果 o其中
的效果最好 ∀目
前 o银杏萜内酯来源于银杏树叶 o人们还试图通过其
他途径来生产银杏内酯 o如化学合成 o植物组织与细
胞培养技术 ∀从长远来看 o通过组织与细胞培养技
术生产银杏内酯是一条较好的途径 ∀在以前银杏组
织培养的研究中≈t ∗ v o细胞系的筛选都是停留在愈
伤组织的水平上进行的 o其实这样获得的/细胞系0
严格地说只能称作组织系 o其均匀性 !高产性 !稳定
性是有一定限度的 o远不能满足银杏细胞大规模培
养的需要 o而通过细胞克隆技术来筛选可以解决这
一问题 o如罗建平等≈w 利用这一技术得到了高产
人参寡糖素细胞克隆系 o生长速度为原始株系的
≈收稿日期 usss2st2sz
t qv|倍 o寡糖素含量为原始株系的 t qyx倍 ∀毕世
荣等≈x 应用这一技术获得了高含量的薯蓣皂素植株
的细胞系 ~邱德有等≈y 应用这一技术也得到了大量
均匀 !速生 !稳定的东北红豆杉细胞系 ∀本试验拟通
过单细胞克隆技术筛选出高产银杏内酯细胞系 o并
探索培养物生产银杏内酯的不稳定性和细胞均一性
之间的关系 o为银杏细胞培养早日达到工业化奠定
基础 ∀
1 材料与方法
1 q1 材料
银杏 ≥2悬浮细胞系 ∀
1 q2 平板培养方法
取其对数生长期k| ∗ t{ §l的细胞悬浮培养物 o
用 zy Λ°kuss目l的不锈钢细胞筛过滤 o滤掉大细胞
团的培养物经低速离心后 o用平板培养的培养基k不
加琼脂l悬浮 o血球计数板计数 o定量取这种细胞悬
浮物加入定量的约 vx ε 琼脂培养基混匀 o倒入直径
y ¦°的培养皿中 o用 °¤µ¤©¬¯°封口 o黑暗培养 o培养
温度kux ? ul ε ∀所用培养基为 ≥ n s qx °ª#p t
y2
n s qx °ª#pt n s qu °ª#ptu ow2⁄~2谷
氨酰胺通过过滤灭菌加入 ∀
1 q3 银杏内酯的测定
各克隆系培养物均于培养 vu §后收获 oxs ε 下
烘干至恒重 o银杏内酯提取及测定依文献≈v 的方法
进行 ∀
1 q4 显微摄影
#v|x#
第 ux卷第 ts期
usss年 ts月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ qux o²qts
¦·qousss
取出培养皿 o每隔 v §进行显微观察 o并摄下各
个时期细胞生长 !分裂 !增殖的动态变化 o所用微镜
为 ¼¯°³∏¶2 倒置显微镜 ∀
1 q5 统计方法
植板率k°∞oh l以平板培养 vs §的可见克隆数
占接种细胞总数的百分比表示 }
植板率k°∞oh l 可见克隆数接种细胞数 ≅ tss h
2 试验结果
2 q1 2谷氨酰胺对细胞植板率的影响
以 ≥ n s qx °ª#pt n s qx °ª#pty2
n s qu °ª#p tu ow2⁄为基本培养基 o起始细胞密度
为 t qs ≅ tsw ¦¨¯¯# °¯ p t o另外在培养基中附加 xss °ª
#p t的 2谷氨酰胺 o观察了 2谷氨酰胺对银杏细胞
植板率的影响 o结果当 2谷氨酰胺浓度为 s oxss °ª
#pt时 o细胞植板率分别为 x qu h out qx h ∀此结果
表明 o2谷氨酰胺能较大地促进银杏细胞的植板率 o
为对照的 w qt倍 ∀接种 v §后 o可观察到单细胞的
第 t次分裂 otx §就能观察到细小的细胞团 ovs §后
就可以将细胞团挑选出来分别培养形成愈伤组织
k图 t o ∗ ƒl ∀愈伤组织继代培养基为 ≥ n s qx
°ª#pt n s qx °ª#p ty2
n s qu °ª#ptu ow2
⁄∀
图 t 银杏单细胞克隆
∗
1 单细胞k ≅ ywsl ≤1 细胞分裂k ≅ w{sl ⁄∗ ∞1 细胞增殖 ƒ1 培养 t个月后的细胞团
2 q2 不同细胞密度对细胞植板率的影响
以不同的起始细胞密度来进行银杏单细胞克隆
培养研究 o发现不同的细胞密度对植板率的影响较
大k表 tl o当细胞密度低于 s qt ≅ tsw ¦¨¯¯# °¯ p t时 o得
#w|x#
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ qux o²qts
¦·qousss
表 t 细胞密度对单细胞克隆植板率的影响
细胞密度r ≅ tsw ¦¨¯¯# °¯ p t 植板率r h
s qt s
s qx v qw
t qs t| qy
u qs uw qt
x qs vu qx
ts qs )
注 }基本培养基为 ≥ n s qx °ª#p t n s qx °ª#p ty2
n
s qu °ª#p tu ow2⁄n xss °ª#p t2谷氨酰胺
不到细胞克隆系 ~细胞密度 s qx ≅ tsw ∗ x qs ≅ tsw ¦¨¯¯
# °¯ p t时 o随着细胞密度的增加 o植板率也在增加 o且
细胞团之间界限分明 o即能够挑选单个的克隆系 ~细
胞密度在 ts qs ≅ tsw ¦¨¯¯# °¯ p t时 o培养皿中长出了许
多界限不清的小细胞团 o无法挑出单个的克隆系 ∀
2 q3 单细胞克隆系的生长及
合成能力的研究
通过上述平板培养法获得了 w{个单细胞团 o进
一步培养后 o对其生长和
的合成能力进行了研
究 o结果k表 ul表明 w{个细胞系之间细胞生长的速
度和
的合成能力存在着差异 o生长最快的是编
号为 2ws的细胞系 o在 t个生长周期中增长指数愈
伤组织增长指数≈k干重l k收获愈伤组织干重 p接
种愈伤组织干重lr接种愈伤组织干重 达到 v q{y o生
长最慢的为细胞系 2u{ o在 t个周期中增长指数仅
为 s q{{倍 o各个细胞系在
的含量上也存在着
差异 o最高的为细胞系 2uu o含量高达干重的
s qs|| h o但 2tz o2vy o2wy o2wz w个细胞系中则
检测不到
的存在 o这在一定程度上说明了愈伤
组织在继代过程中次生代谢产物不稳定的原因 ∀
2 q4 单细胞克隆系的稳定性研究
细胞的不均一性是造成组织细胞培养物次生代
谢产物生产能力不稳定的因素之一 o单细胞克隆系
由来源相同的细胞产生 o其稳定性应该比杂合细胞
要强 ∀在继续培养几代次后 o对部分克隆株系ku{
个l进一步考察 o结果k表 v oul表明 o这 u{个株系的
生长速率在继代培养时并没有发生显著性变化 o大
部分克隆株系也都保持了原有
生成的能力 o只
有 2tu o2vx o2wt o2wv 个株系的
生成能力
发生了极为显著性的变化 o其可能原因是 }≠这几个
克隆系不纯 o即不是来源于单个细胞 o因为在平板培
养过程中观察到在制备单细胞时混入了少量小细胞
团 o这些小细胞团可能并非相同来源 ~在培养中发
生了变异 ∀
表 u 单细胞克隆株系的生长及
的含量
单细胞克隆株系
编号
增长指数tl
k干重l
含量
ulr干重 h
2t t q|| ? s qtz s qsx|t ? s qssx
2u t q|t ? s qs| s qsts{ ? s qsst
2v u qs| ? s qtv s qswz| ? s qssv
2w v qsu ? s qvy s qsw{z ? s qsst
2x u qsv ? s quz s qswux ? s qssx
2y u qvw ? s qtu s qstv| ? s qsst
2z u qtw ? s qs| s qsyws ? s qssv
2{ t q|w ? s qt| s qss|t ? s qsssv
2| u qv| ? s qus s qsw|x ? s qss{
2ts u qwu ? s qu| s qswxz ? s qsst
2tt u qu{ ? s qtu s qsyxy ? s qss|
2tu t qzx ? s qtt s qstvu ? s qssv
2tv u qvu ? s qsz s qsyxu ? s qsty
2tw u qxy ? s qtu s qsuyt ? s qssx
2tx u qwv ? s qty s qst|w ? s qssz
2ty u qw{ ? s qtv s qsw|z ? s qssu
2tz u qtu ? s qt| )
2t{ u qv{ ? s qut s qswtu ? s qssx
2t| u qtv ? s qtx s qstsv ? s qssu
2us u qtz ? s quu s qss{ ? s qsst
2ut u qys ? s qut s qswus ? s qsst
2uu u qus ? s qvu s qs|| ? s qsst
2uv u q{u ? s qvw s qsszt ? s qssv
2uw u qwy ? s quu s qsvxy ? s qss|
2ux u qw{ ? s qty s qssxy ? s qsssv
2uy u qs{ ? s qsz s qstyz ? s qssu
2uz u qvz ? s qvt s qsusw ? s qsst
2u{ s q{{ ? s qtu s qsttu ? s qssu
2u| u qx{ ? s qtx s qsu{u ? s qssz
2vs u qvs ? s qu{ s qsyw| ? s qsst
2vt u qxx ? s qty s qswwx ? s qssx
2vu u qxu ? s qvx s qsvvw ? s qsst
2vv u qv| ? s quy s qstzz ? s qssv
2vw u qtz ? s qvz s qstsv ? s qsst
2vx u qys ? s quv s qsuww ? s qssv
2vy u quy ? s qut )
2vz u qww ? s qs{ s qsuuv ? s qssw
2v{ u qv| ? s qty s qss{{ ? s qsst
2v| v qut ? s qvx s qsts{ ? s qssu
2ws v q{y ? s qvt s qstzw ? s qssu
2wt u qw| ? s quu s qsvx| ? s qssu
2wu u qvw ? s qts s qsvv{ ? s qssy
2wv u qvs ? s quu s qsuwu ? s qssy
2ww u qsv ? s qvy s qsuwz ? s qssx
2wx u| qt ? s qvw s qstzt ? s qsst
2wy u qxt ? s qut )
2wz u qy{ ? s quw )
2w{ u qvx ? s qv{ s qsvvu ? s qssu
注 }培养物于第 vu §收获 ξ ? σ t) ν v u) ν yk表 v同l
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表 v 单细胞克隆株系生长及
形成的稳定性
单细胞克隆株系
编号
增长指数tl
k干重l
含量
ulr干重 h
2t u qtu ? s quw s qsxy ? s qssy
2v u quu ? s qtx s qswu ? s qssx
2w t q{| ? s qty s qsxt ? s qsst
2y u qwx ? s qwu s qstz{ ? s qssv
2{ u qxt ? s qxt s qss{ ? s qsst
2tt u qt{ ? s quu s qsxx ? s qssu
2tu u qst ? s qut )
2tv u qwx ? s qvu s qsy{ ? s qssu
2tx u qv{ ? s qtv s qsuwu ? s qssw
2ty u qxw ? s qvx s qswwu ? s qssv
2t{ u qyx ? s qw{ s qsvz{ ? s qssz
2t| u quv ? s qus s qstyx ? s qssx
2ut u qzw ? s qwu s qsvx{ ? s qssu
2uu u qv{ ? s quv s qs|ws ? s qss{
2uy t q|| ? s qtw s qst{t ? s qssw
2uz u qwx ? s quy s qsuxx ? s qssw
2u| u qyw ? s qvx s qsu{| ? s qssu
2vs u quw ? s qt{ s qsyzs ? s qssx
2vt u qzx ? s qyv s qswxz ? s qssz
2vv u qxw ? s qwy s qst{s ? s qssv
2vw u qu{ ? s qtz s qstws ? s qssv
2vx u qyx ? s qvv s qss{t ? s qsst
2v| v qtu ? s qxw s qssyy ? s qsst
2ws v qy{ ? s qwx s qstwu ? s qssv
2wt u qvu ? s quv s qstu| ? s qssu
2wu u qwx ? s qut )
2wv u qs| ? s quv s qssxz ? s qsst
2wx v qsx ? s qwv s qst{| ? s qssu
3 讨论
单细胞克隆技术在植物细胞培养的研究中有重
要意义 o因为通过此技术可以获得高产 !稳产的细胞
株系 o从而提高植物次生代谢产物的产量 ∀平板培
养法是细胞克隆研究中常用的方法 o此法具有简便 !
能大量接种细胞 !容易观察细胞生长 !分裂情况等特
点 o其植板率受多种因素如植物种类 !原始细胞所处
的生理状态 !培养基成分 !培养条件等的影响 ∀本试
验采用在培养基中添加 2谷氨酰胺 o大大提高了细
胞的植板率 ∀毕世荣等≈x 在研究薯芋细胞克隆时也
发现 2谷氨酰胺能提高细胞的植板率 o原因可能是
2谷氨酰胺容易被植物细胞所吸收 o参与细胞中蛋
白质等的合成 o或作为能源物质提供细胞生命活动
所需要的能量 o使细胞活力增强 o从而提高细胞的植
板率 ∀严格地说 o细胞克隆株系是由 t个细胞通过
不断增殖而来 o是高度均一的 o因此在一定的时间内
其生长及次生代谢产物合成的能力应该是相对稳定
的 ∀本实验获得的高产银杏内酯
细胞系 o含量高
达 s qs|| h o高于现有的报道结果 o如何维持这些高
产细胞系的稳定性 o除不断地进行再筛选和控制培
养条件外 o还需要作更深入的研究 o使银杏细胞培养
早日走向工业化 ∀
≈参考文献
≈t ¤∏µ¤¬± ⁄o×µ¨ °²∏¬¯¯¤∏¬2∏¬¯¯ µ¨o≤«¨ ±¬¨∏¬ o¨·¤¯ q°µ²§∏¦·¬²± ²©
¬±®ª²¯¬§¨¶¤±§
¬¯²¥¤¯¬§¨ ¬± ×µ¤±¶©²µ° §¨¤±§¤° ·¨²³«¼·¨ ⁄¨ µ¬√ §¨
≤¨¯¯ ≤∏¯·∏µ¨¶²© Γινκγο βιλοβα .°«¼·²¦«¨ °¬¶·µ¼ ot||z owsktl }tuz q
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杏内酯的研究 1 生物工程学报 ot||| otxktl }xu q
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Στυδιεσ ον Σινγλε Χελλ Χλονινγ οφ Γινκγο βιλοβα Λ .
⁄∏±2ª∏¬o • ¬¨2«∏¤o • ≠∏±2 ¬´o ±¬∏o ⁄¤2¼²±ª
k±¶·¬·∏·¨ ²© ¤·¨µ¬¤ §¨¬¦¤o≤«¬±¨ ¶¨ ¦¤§¨ °¼ ²© §¨¬¦¤¯ ≥¦¬¨±¦¨¶
i ° ®¨¬±ª ±¬²± §¨¬¦¤¯ ≤²¯¯¨ ª¨ o
¨ ¬¬±ª tsssxs o≤«¬±¤l
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε:ײ¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨ ·«¨ µ¨ ¤¯·¬²±¶²©·«¨ ³µ²§∏¦·¬√¬·¼ ¶·¤¥¬¯¬·¼ ²©·²·«¨ «²°²ª¨ ±¬½¤·¬²± ²©
Γινκγο βιλοβα ¦¨¯¯¶¥¼ ¶¬±ª¯¨¦¨¯¯ ¦¯²±¨ ¶qΜετηοδ : ¶¬±ª³¯¤±·¶¬±ª¯¨¦¨¯¯ ³¯¤·¨ ¦∏¯·∏µ¨ ·¨¦«±¬´∏¨ qΡεσυλτσ:§§¬±ª
xss °¯ #p t2ª¯∏·¤°¬±¨ ¬±·«¨ ° §¨¬∏° ¬±¦µ¨¤¶¨§ªµ¨¤·¯¼ ·«¨ ¦¨¯¯ ³¯¤·¬±ª ©¨©¬¦¬¨±¦¼ k°∞l o¤±§ º¬·«¬±·«¨ µ¤±ª¨
s qx ∗ x qs ≅ tsw ≤¨¯ #¯ °¯ p t ²©·«¨ ¬±¬·¬¤¯ ¦¨¯¯ §¨ ±¶¬·¼ o·«¨ °∞¬±¦µ¨¤¶¨§ º¬·«·«¨ ¬±¦µ¨ ° ±¨·²©·«¨ ¦¨¯¯ §¨ ±¶¬·¼ q©
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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·«¨ w{ ¦¨¯¯ ¦¯²±¨ ¶²¥·¤¬±¨ §o·«¨
¦²±·¨±·¬± 2uu ¦¯²±¨ µ¨¤¦«¨ §s qs|| h ~¤±§ °²¶·²©·«¨ ¦¯²±¨ ¶¦²∏¯§µ¨ °¤¬±
¶·¤¥¯¨¬± ªµ²º·«¤±§
³µ²§∏¦·¬²± §∏µ¬±ª¶∏¥¦∏¯·∏µ¨¶qΧονχλυσιον : ⁄∏µ¬±ª·«¨ ¦¨¯¯ ¤±§·¬¶¶∏¨ ¦∏¯·∏µ¨ ²© Γ .
βιλοβα o·«¨ ¤³³¯¬¦¤·¬²± ²©³¯¤±·¶¬±ª¯¨¦¨¯¯ ¦¯²±¬±ª·¨¦«±¬´∏¨ «¨ ³¯¶·²¤¦¨µ·¤¬± ¬¨·¨±·¶²¯√¨·«¨ ³µ²¥¯¨° ²©³µ²§∏¦2
·¬√¬·¼¬±¶·¤¥¬¯¬·¼ ²©ª¬±®ª²¯¬§¨ q
[ Κεψ ωορδσ] Γινκγο βιλοβα ~¶¬±ª¯¨¦¨¯¯ ¦¯²±¬±ª~ª¬±®ª²¯¬§¨
≈责任编辑 王康正
三七黑斑病初侵染来源及传播途径研究
王朝梁t o崔秀明t o罗文富t o喻盛甫u
kt1 云南文山州三七研究所 o云南 文山 yyvsss ~
u1 云南农业大学 植物病理重点实验室 o云南 昆明 yxsustl
≈摘要 目的 }探索三七黑斑病的发生发展规律 o为病害的综合防治提供依据 ∀方法 }人工接种和盆栽试验 o
定期观察病菌的侵染及传播途径 ∀结果 }三七黑斑病的侵染源主要来自于病种子 !种苗 !病残体及土壤 o带菌种子 !
种苗是新七园的初次侵染源 o残存在七园内的病残体及土壤带菌是老七园三七黑斑病的主要侵染来源 ~三七黑斑
病主要由带病种子 !种苗 !病残体 !土壤和病菌孢子传播 ∀结论 }对三七黑斑病的防治 o应围绕防止病菌的侵染源与
传播而进行 o重点消灭病菌来源和封锁传播中心 ∀
≈关键词 三七黑斑病 ~初侵染来源 ~传播途径
≈中图分类号 ≥xyz quv n y ~≥wvu qw ≈文献标识码
≈文章编号 tsst2xvsukussslts2sx|z2sv
三七 Παναξ νοτογινσενγk
∏µ®qlƒ q q≤«¨ ±是
治疗心脑血管疾病的名贵中药材 o主产云南文山 o常
年种植面积 v sss公顷 o其产量和面积均占全国的
{x h以上 o栽培中易遭受黑斑病的为害 o常年发病在
us h ∗ vs h o严重时高达 |s h以上≈t ou o已成为三七
的毁灭性病害之一 ∀病菌产生的症状因地而异≈v o
最终导致病株早期落叶 o影响光合作用 o植株提前枯
萎 o不能结籽和块根腐烂 o严重影响三七的产量和品
质 ∀文献曾报道过三七黑斑病病原 !发病条件 !药剂
防治等方面的研究≈w ∗ y o为更好地摸清该病的侵染
源及传播途径 o特就其病原菌的侵染源和传播进行
了研究 ∀
1 材料和方法
1 q1 试验材料 ≠病残体 }采自未用农药防治的重
病田 ~病土 }采自重病田病残体多的表土 ~≈种苗 }
在防治好发病轻的地块中 o选取无病斑的种苗 o洗净
表面泥土 ~…盆土 }用森林腐植土 o经高压蒸气灭菌
备用 ∀
≈收稿日期 t|||2tt2t{
1 q2 试验方法 分别设土壤拌病残体 !种苗接种病
残体 !病土拌种 !种子带菌及对照 x个处理 ∀
2 结果与分析
2 q1 盆栽 用森林腐植土 o经高压蒸气灭菌备用 o
每处理 tx株 o并定期观察统计 ∀
盆栽试验结果表明 }不论用病残体或带菌土壤
接种 o其发病率均很高 o达 yy qzy h ∗ tss h o而对照
则不发病 o说明土壤带菌包括土中孢子和病残体中
的菌丝在侵染循环中起重要作用 ∀土壤带菌是病害
的主要传播途径 ∀三七在地时间越长 o病原菌积累
越多 o发病就越重 ∀通过接种和田间调查发现 o种
子 !种苗带菌 o不但可使本身感染发病外 o还可实现
远距离传播 ∀因此在移植前或冬季下棵后必须进行
种子 !种苗消毒处理和冬季管理 ∀
2 q2 田间试验 t||x ot||y年分别在砚山县城郊
的试验场进行 o均为未种过三七的地块 o每处理 uxs
株 o重复 u ¤o结果见表 t ∀
从表 t看出 o通过两年的田间小区试验 o进一步
明确了土壤 !种子 !种苗带菌是黑斑病传播的主要途
径 ∀
#z|x#
第 ux卷第 ts期
usss年 ts月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ qux o²qts
¦·qousss