全 文 ：中国生态农业学报 2015年 2月 第 23卷 第 2期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Feb. 2015, 23(2): 225−232


* 国家自然科学基金项目(31160104)资助
** 通讯作者: 刘萍, 主要从事种质资源遗传多样性研究。E-mail: liupnxdx@126.com
秦越, 主要从事遗传多样性研究。E-mail: qy890521@126.com
收稿日期: 2014−06−24 接受日期: 2014−11−27
http://www.ecoagri.ac.cn
DOI: 10.13930/j.cnki.cjea.140755
马铃薯连作栽培对土壤微生物多样性的影响*
秦 越 马 琨 刘 萍**
(宁夏大学农学院 银川 750021)
摘 要 马铃薯是宁夏回族自治区南部山区重要的粮菜兼用作物, 随栽培面积持续扩大, 轮作倒茬困难, 由
此带来的连作障碍问题日渐突出。为探明马铃薯连作障碍机制, 分别采集马铃薯正茬、连作 1 年、6 年和 10
年的根际土壤样本, 利用末端标记限制性片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism,
T-RFLP)技术研究连作栽培对根际土壤微生物多样性的影响, 以期揭示马铃薯根际土壤主要菌群动态变化规
律及连作障碍的可能原因。结果表明: 连作栽培后马铃薯土壤细菌和真菌 DNA仍具有较高的 T-RFLP多态性,
但不同连作年限根际土壤中优势 T-RFs片段发生变化, 多年连作使某些 T-RFs消失; 随连作年限增加, 根际土
细菌 Shannon-Wienen指数、Simpson指数和 Sorenson指数下降, 而真菌 Shannon-Wienen指数和 Simpson指数上
升。菌群分析发现, 土壤细菌中以厚壁菌门(Firmicutes)芽孢杆菌纲(Bacilli)和梭菌纲(Clostridia)所占比例最大。连
作使细菌和真菌菌群发生变化, 芽孢杆菌纲、鞘氨醇纲(Sphingobacteria)等比例下降甚至消失, β-变形菌纲(Beta
proteobacteria)和异常球菌纲(Deinococci)比例上升; 土壤真菌中座囊菌纲(Dothideomycetes)煤炱目(Capnodiales)
随连作年限增加比例下降, 粪壳菌纲(Sordariomycetes)肉座菌目(Hypocreales)随连作年限增加比例上升。马铃
薯连作使根际土壤中芽孢杆菌属(Bacillus)等有益菌属的细菌减少, 罗尔斯通菌属(Ralstonia)等致病菌属的细
菌增加。连作导致马铃薯根际土壤细菌多样性水平降低, 真菌多样性水平升高, 根际土壤微生物多样性存在明
显差异, 连作破坏了根际土壤微生物群落的平衡, 使其根际土壤微生态环境恶化。连作障碍可能是多因素综合
互作用的结果, 持续的研究有利于做出较合理的解释。
关键词 马铃薯 连作栽培 根际土壤 T-RFLP 遗传多样性 微生物群落 细菌 真菌
中图分类号: S154.36; Q938 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2015)02-0225-08
Effect of potato continuous cropping on genetic diversity of soil microorganisms
QIN Yue, MA Kun, LIU Ping
(College of Agronomy, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)
Abstract Because of its high nutritive value and extensive use, potato has become a critical crop in the southern mountain areas of
Ningxia, China. However, the expansion of cultivated land areas under potato has made not only crop rotation difficult, but as has
also worsened the obstacles of potato continuous cropping in recent years. In order to alleviate and eventually resolve the obstacles of
potato continuous cropping, rhizosphere soils were sampled under the following potato treatments after 2 years, 7 years and 11 years
of continuous cropping in the southern mountain areas of Ningxia, China. Terminal restriction fragment length polymorphism
(T-RFLP) was used to study the genetic diversity of soil microorganisms, to explore the dynamics of main soil microbial groups in
rhizosphere soils and to find the possible reasons for the obstacles of potato continuous cropping in the region. The results showed
that some specific T-RFs fragments changed or disappeared in rhizosphere soil samples under different periods of continuous
cropping, though higher polymorphism of T-RFLP of bacteria and fungi in rhizosphere soils of continuously cropped potato was
observed. While the Shannon-Wienen, Simpson and Sorenson indexes of bacterial dropped, those of fungus increased with increasing
years of continuous cropping. Analysis of soil microorganism biota revealed that Firmicute, Bacilli and Clostridia were the highest
proportion of total bacteria communities in potato rhizosphere soils. Continuous cropping significantly changed structures of soil
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bacteria and fungi communities. While the proportions of Bacilli and Sphingobacteria decreased or even disappeared with increasing
cropping years, β-proteobacteria and Deinococci proportions increased. The proportion of Dothideomycete and Capnodiales of fungi
community in rhizosphere soils dropped whereas that of Sordariomycete and Hypocreales grew. The results suggested that potato
continuous cropping limited the population of beneficial microbes such as Bacillus, while boosting that of pathogenic bacteria such
as Ralstonia in the rhizosphere soils. In conclusion, soil microbial diversity in rhizosphere soils under different periods of continuous
cropping was obviously influenced. The fall of the diversity of bacteria community gave way to the rise of fungi community under
continuous cropping, causing imbalance in microbial community and soil micro-ecological/environmental deterioration. The obstacle
of continuous cropping possibly resulted from complex interaction of multiple soil factors in rhizosphere soils. There was therefore
the need for continuous field research to help comprehensively determine the mechanism of continuous cropping obstacle.
Keywords Potato; Continuous cropping; Rhizosphere soil; T-RFLP; Genetic diversity; Microorganism community; Bacteria;
Fungi
(Received Jun. 24, 2014; accepted Nov. 27, 2014)
马铃薯(Solanum tuberosum)是茄科茄属一年生
草本植物, 是世界上仅次于水稻、小麦、玉米的第 4
大粮食作物, 同时又是重要的蔬菜作物之一[1]。近年
来, 马铃薯已成为宁夏回族自治区(以下简称宁夏)
第 1 大粮菜兼用作物, 播种面积达到 27 万 hm2, 占
全国马铃薯种植面积的 5%, 约占宁夏粮食作物播种
面积的 25%, 马铃薯生产对稳定宁夏南部山区乃至
宁夏粮食安全有着举足轻重的作用。然而由于土地资
源的限制, 宁夏马铃薯连作栽培现象非常普遍。与番
茄(Lycopersicon esculentum)、枸杞(Lycium barbarum)、
辣椒(Capsicum annuum)等茄科植物一样, 连作会造
成马铃薯病虫害增多, 产量与品质下降[2−4], 并产生严
重的连作障碍。
连作障碍是根际土壤系统内部诸多因素综合作
用的外在表现, 导致其发生的因素包括土壤理化性
状劣变、土壤传染性病害和根际分泌物引起的自毒
作用等[5−6]。一些学者认为, 根系分泌物对土壤微生
物, 特别是病原微生物的选择性促进及由此导致土
壤微生态系统失衡, 是引发连作障碍的主要因素。
陈冬梅等[7]研究发现白肋烟连作使根际鞘氨醇单胞
菌属 (Sphingomonas)和链霉菌属 (Streptomyces)等益
生菌属数量减少, 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)等
潜在致病菌增加, 破坏了烟草根际土壤微生物群落
的平衡 , 使其微生态环境恶化; 沈宝云等 [8]和李金
花等[9]发现连作栽培促使土壤中出现了诱发马铃薯
枯萎病和黑痣病的病原菌; Rowe等[10]发现马铃薯连
作栽培易引起早疫病; Emmond 等[11]研究发现马铃
薯轮作与连作相比, 枯萎病的发生率降低。还有一
些学者认为 , 连作致使土壤微生物区系发生变化 ,
土壤从细菌型向真菌型转化。孟品品等[12]研究发现
马铃薯连作使根际土壤中真菌优势种群的个体数明
显增多, 真菌多样性水平升高, 根际土壤土传病害
病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和茄病镰刀
菌(Fusarium solani)的数量明显增加。马琨等[13]研究
发现马铃薯连作后土壤细菌 /真菌的比例与对照土
壤相比有不同程度的减少。可见, 对于连作障碍形
成原因不同学者有着不同的观点。宁夏南部山区隶
属于黄土丘陵区, 连续多年的马铃薯大量种植, 势
必会改变当地的农田生态系统, 加速土壤肥力的消
耗, 马铃薯块茎的主要生长环境是土壤, 土壤微生
态环境的变化与马铃薯的生长关系密切。然而, 马
铃薯连作对根际土壤微生物多样性变化的影响仍少
见系统报道。为此, 本文从根际微生物微生态角度
出发, 采用 T-RFLP 技术研究马铃薯不同连作年限
根际土壤微生物群落动态变化, 揭示马铃薯连作障
碍可能的发生机理, 为其综合防控提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验地概况和供试土样
土壤样品采自宁夏固原市张易镇马场村, 该区
域位于东经 106.5°~106.6°, 北纬 35.54°~35.55°, 海
拔 2 133~2 276 m, 是宁夏南部山区黄土高原和六
盘山阴湿区的过渡区域。土壤为黄土母质上形成的
典型地带性土壤 , 以黑垆土为主。土壤有机质
29.01~45.92 g·kg−1, 全氮 1.31~1.94 g·kg−1, 全磷
0.72~1.12 g·kg−1, 速效钾 170.60~735.37 mg·kg−1, 速
效磷 16.02~94.86 mg·kg−1, pH 8.19~8.61。
试验选择马铃薯正茬(A, 连作 5年的冬小麦地),
连作 1 年(B)、6 年(C)、10 年(D)马铃薯栽培地, 分
别采集马铃薯播种前(1)和成熟期(2)2 个时期的根际
土壤。播种前按对角线五点法采集土样, 每个样点
取 15~20 cm 土层, 分别将各点土样按四分法混匀;
成熟期土样采样时随机将 5 个样点的马铃薯连根取
出, 抖掉根周围松散的土壤, 剩下黏附在根表面的
土壤即为根际土, 充分混匀后装入灭菌的样品袋。
所有土样均冰盒保存带回实验室, 过 2 mm 筛后贴
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好标签, 存于−70 ℃冰箱中备用。
1.2 土壤微生物总 DNA提取
土壤微生物总 DNA采用土壤 DNA提取试剂盒
(OMEGA公司)提取, 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3 细菌 16S rDNA的扩增和酶切
用带 FAM 荧光标记的细菌通用引物 8F-FAM
(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 926R (5′-
CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3′)扩增土壤细菌 16S
rDNA片段[14]。反应体系(20 μL)为: 10×buffer 2.0 μL,
Mg2+(50 mmol·L−1)1.2 μL, 引物(10 μmol·L−1)1.6 μL,
模板 (10 ng·μL−1)1.0 μL, Taq 酶 (5 U·μL−1)0.2 μL,
dNTPs(10 mmol·L−1)0.2 μL, ddH2O补足 20 μL。扩增
程序为: 92 ℃预变性 3 min, 94 ℃变性 1 min, 58 ℃退
火 1 min, 72 ℃延伸 2 min, 共 30个循环, 72 ℃延伸
8 min。
取 5 μL 扩增产物用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检
测, 其余产物电泳后经 SanPrep 柱式 DNA 胶回收试
剂盒割胶纯化, 纯化后的 PCR产物用 HaeⅢ和MspⅠ
分别酶切。酶切体系 10 μL包括: 酶 1 μL, 酶缓冲液
1 μL, ddH2O 2 μL, PCR产物 6 μL; 37 ℃温浴 5 h后,
4 ℃避光保存备用。
1.4 真菌 ITS区的扩增和酶切
用带 HEX 荧光标记的真菌通用引物 ITS1-HEX
(5′-CTTGGTCATTTAGAAGAAGTAA-3′)和 ITS4(5′-
TCCTC CGCTTATTGATATGC-3′)扩增土壤真菌 ITS
区约 750 bp的目的片段[15]。反应体系为: 10×buffer
2 μL, Mg2+(50 mmol·L−1)1.0 μL, 引物(10 μmol·L−1)
1.1 μL, 模板(10 ng·μL−1)1.0 μL, Taq 酶(5 U·μL−1)
0.2 μL, dNTPs(10 mmol·L−1)0.2 μL, ddH2O补足 20 μL。
扩增程序为: 94 ℃预变性 3 min, 94 ℃变性 45 s, 55 ℃
退火 1 min, 72 ℃延伸 1 min; 共 35个循环, 72 ℃延
伸 10 min。
扩增产物纯化后分别用 HaeⅢ和 MspⅠ酶切。
酶切产物 4 ℃避光保存备用。
1.5 毛细管电泳
酶切产物避光低温下送生工生物工程(上海)股份
有限公司, 在 ABI自动测序分析仪上进行毛细管电泳。
1.6 数据分析
原始数据首先计算出每个 T-RF 的丰度百分比
(Ap); 用 BIO-DAP 软件[16]计算 Shannon-Wienen 指
数、Simpson 指数和 Sorenson 相似性指数[17]。同时
将原始数据导入MiCA3网站(http://mica.ibest.uidaho.
edu/runpat.php), 选择在线分析中 T-RFLP Analysis
程序, 把土壤细菌 2 个酶切产生的 T-RFs 片段与
RDP 16S Bacterial rRNA核糖体数据库进行序列比
对, 土壤真菌 2 个酶切产生的 T-RFs 片段与 SILVA
SSU Parc 核糖体数据库进行序列比对, 分别找出各
酶切片段对应菌属。所有数值均为 2 个内切酶的平
均值。
丰度百分比(Ap)= ni/N×100% (1)
式中: ni 是 T-RFLP 图谱中第 i 个峰峰面积, N 是
T-RFLP图谱中峰的总面积。
2 结果与分析
2.1 马铃薯不同连作年限土壤细菌和真菌 T-RFLP
多态性分析
采用T-RFLP技术对 4个连作年限成熟期根际土
样细菌和真菌 DNA的 HaeⅢ和MspⅠ图谱进行分析,
土壤细菌分别检测到 35~618 bp、63~541 bp的峰 99
个和 103 个, 土壤真菌分别检测到 73~704 bp、48~
688 bp的峰 76个和 79个。将 4份土样 DNA酶切图
谱中丰度百分比(Ap)大于 2%的视为优势 T-RFs 片
段。由图 1 可知, 4份土样 DNA细菌优势 T-RFs片
段共有 19 个, 其中连作 1 年的优势 T-RFs 片段 12
个, 正茬和连作 10 年的优势 T-RFs 片段均为 15 个,
连作 6 年的优势 T-RFs 片段 14 个; 与正茬相比, 连
作 1年、6年及 10年均出现 T-RF410, 而 T-RF35消
失(图 1A)。4 份土样 DNA 真菌优势 T-RFs 片段共有
20个, 具体为: 正茬 10个, 连作 1年 8个, 连作 6年
11个, 连作 10年 12个; 与正茬相比, 连作 1年、6年
及 10年均出现 T-RF133, 而 T-RF161和 T-RF683却消
失了, 在连作 10年的土样 DNA中出现了 T-RF129、
T-RF653和 T-RF688的特有片段(图 1B)。
2.2 马铃薯不同连作年限土壤微生物的多样性变化
由表 1 可知, 随连作年限的增加, 土壤细菌的
Shannon-Wienen指数和 Simpson指数在播种前与成熟
期 2 个生育时期均呈下降趋势, 土壤真菌的 Shannon-
Wienen指数和 Simpson指数在这 2个生育时期表现
为上升。表明马铃薯连作栽培致使土壤细菌多样性
水平下降, 土壤真菌多样性水平升高, 土壤微生物
从细菌型向真菌型转化。同一连作年限, 成熟期与
播种前相比, 细菌和真菌多样性水平都有一定程度
的降低。
研究表明, 连作可使土壤细菌和真菌的菌群逐
渐发生变化, 8份土样中细菌 Sorenson相似指数范围
为 0.476~0.623, 真菌的 Sorenson相似指数为 0.279~
0.517, 连作使土壤细菌 Sorenson相似指数逐年下降,
其中以成熟期正茬和连作 10 年之间土壤细菌的相
似指数最小; 不同连作年限土壤真菌 Sorenson 相似
指数随连作年限的改变而变化, 但无规律可循。
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图 1 不同连作年限马铃薯成熟期根际土细菌(A)和真菌(B)群落 HaeⅢ酶切的 T-RFLP多态性分析
Fig. 1 T-RFLP analysis of rhizosphere soil bacteria (A) and fungi (B) at mature period of potato continuously planted for different years
图中仅显示丰度百分比大于 2%的T-RF片段。Only the T-RF fragments with the abundance percentage more than 2% were shown in the figure.
表 1 马铃薯不同连作年限土壤微生物多样性比较
Table 1 Diversity of soil microorganism under different continuous cropping years of potato
细菌 Bacteria 真菌 Fungi 取样时期
Sampling time
连作年限
Continuous cropping
years (a)
Shannon-Wiener指数
Shannon-Wiener index
Simpson指数
Simpson index
Shannon-Wiener指数
Shannon-Wiener index
Simpson指数
Simpson index
0 4.00 32.79 3.39 21.74
1 3.69 25.00 3.42 21.88
6 3.59 18.18 3.59 26.32
播种前
Before sowing
10 3.43 21.28 3.66 24.39
0 3.69 28.99 3.13 14.93
1 3.52 25.00 3.27 15.15
6 3.57 27.26 3.51 18.18
成熟期
Mature period
10 3.50 25.00 3.39 16.12

2.3 马铃薯不同连作年限土壤微生物菌群分析
对马铃薯 4 个连作年限 2 个生育时期根际土细
菌 T-RFLP数据进行细菌菌群分析表明: 8份根际土
样中共检测到 13个门, 19个纲的细菌(表 2), 以厚壁
菌门芽孢杆菌纲所占比例最大。连作年限不同, 各
纲细菌所占比例有较大变化, 芽孢杆菌纲和鞘氨醇
菌纲的比例随马铃薯连作年限增加逐渐下降, β-变
形菌纲比例上升, 说明细菌菌群发生改变。不同连
作年限土样中出现了特有的细菌菌群, 具体表现如
下: 播种前连作 1 年土样中出现了螺旋体纲和绿菌
纲 2个特有纲的细菌, 成熟期连作 1年、6年和 10年
土样中出现了 δ-变形菌纲和异常球菌纲的细菌, 丝
状杆菌纲的细菌只出现在对照正茬的土样中, 鞘氨
醇菌纲的细菌在成熟期连作 10年的土样中消失。
分析 8份土样的真菌菌群发现: 4个连作年限 2
个生育时期的根际土样中共检测到真菌的 4个门, 7
个纲, 11个目; 以座囊菌纲(Dothideomycetes)煤炱目
(Capnodiales)所占比例最大, 且随连作年限增加其
比例下降; 其次是肉座菌目(Hypocreales), 其比例随
连作年限增加表现上升; 同时马铃薯连作后根际土壤
中还检测到酵母目(Saccharomycetales)、担孢酵母目
(Erythrobasidiales)和接合菌纲(Zygomycetes)的真菌。
2.4 马铃薯正茬和连作 10 年的土壤细菌 T-RFs 片
段定性分析
鉴于马铃薯正茬和连作 10 年成熟期根际土壤细
菌 Sorenson相似性指数最小, 对这 2份根际土样进行
T-RFs片段的定性分析。2份土样中相同的 T-RFs片段
有 27个, 分属于 6个门的 9个纲(表 3), 芽孢杆菌纲
细菌丰度百分比从正茬的 9.11%降低到连作 10年的
5.79%, 以长度为 232 bp、233 bp和 270 bp的 T-RFs
片段下降幅度最大; 梭菌纲细菌的丰度百分比从正茬
的 4.75%上升到连作 10年的 5.04%, 以长度为 258 bp
和 301 bp的 T-RF片段上升幅度最大; 放线菌亚纲细
菌丰度百分比从正茬的 6.06%上升到连作 10 年的
12.77%, 以长度为 64 bp和 410 bp的 T-RFs片段上
升幅度最大。
第 2期 秦 越等: 马铃薯连作栽培对土壤微生物多样性的影响 229


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表 2 马铃薯不同连作年限播种前和成熟期土壤细菌菌群分析
Table 2 Analysis of soil bacterial flora before sowing and at mature period of potato continuously cropped for different years %
比例 Proportion (%)
播种前 Before sowing 成熟期 Mature period 门
Phylum
纲
Class
A1 B1 C1 D1 A2 B2 C2 D2
α-变形菌纲 α-proteobacteria 14.3 13.9 16.9 18.0 17.9 16.5 17.3 17.2
β-变形菌纲 β- proteobacteria 2.2 7.4 4.2 4.9 6.0 6.3 7.4 11.5
γ-变形菌纲 γ-proteobacteria 2.2 4.6 4.2 3.3 1.2 3.8 1.2 3.5
变形菌门 Proteobacteri
δ-变形菌纲 δ-proteobacteria 2.2 0.9 1.4 1.6 0 1.3 1.2 3.5
芽孢杆菌纲 Bacilli 25.3 19.4 25.4 19.7 26.2 26.6 23.5 19.5 厚壁菌门 Firmicutes
梭菌纲 Clostridia 19.8 18.5 16.9 18.0 16.7 13.9 16.1 18.4
放线菌亚纲 Actinobacteridae 14.3 19.4 14.1 14.8 13.1 15.2 11.1 11.5 放线菌门 Actinobacteria
红蝽菌亚纲 Coriobacteridae 2.2 1.9 0 1.6 2.4 1.3 0 2.3
黄杆菌纲 Flavobacteria 5.5 2.8 7.0 8.2 3.6 5.1 7.4 3.5 拟杆菌门 Bacteroidetes
鞘氨醇菌纲 Sphingobacteria 2.2 1.9 0 1.6 2.4 1.3 2.5 0
蓝细菌门 Cyanobacteria 蓝细菌纲 Cyanobacteria 4.4 2.8 2.8 1.6 2.4 2.5 2.5 3.5
螺旋体门 Spirochaetes 螺旋体纲 Spirochaetes 0 0.9 0 0 0 1.3 1.4 0
绿菌门 Chlorobi 绿菌纲 Chlorobia 0 0.9 0 0 0 1.3 1.2 0
绿屈挠菌门 Chloroflexi 绿屈挠菌纲 Chloroflexi 1.1 0.9 0 1.6 1.2 1.3 1.2 1.2
柔膜菌门 Tenericutes 柔膜菌纲 Mollicutes 1.1 1.9 1.4 0 2.4 0 3.7 2.3
丝状杆菌门 Fibrobacteres 丝状杆菌纲 Fibrobacteres 1.1 0 0 0 1.2 0 0 0
梭杆菌门 Fusobacteria 梭杆菌纲 Fusobacteria 0 0 0 0 1.2 0 1.2 0
泉古生菌门 Crenarchaeota 热变形菌纲 Thermoprotei 1.1 0.9 2.8 1.6 2.4 1.3 0 0
异常栖热菌门
DeinococcusThermus
异常球菌纲 Deinococci 1.1 0.9 2.8 3.3 0 1.3 1.2 2.3
总纲数 Total class number 16 17 12 14 15 16 16 13
A: 正茬; B: 连作 1 a; C: 连作 6 a; D: 连作 10 a; 1: 播种前; 2: 成熟期; 下同。A: first-planting treatment; B: continuous cropping for 1 year;
C: continuous cropping for 6 years; D: continuous cropping for 10 years; 1: before sowing; 2: mature period. The same below.
表 3 马铃薯正茬和连作 10年成熟期根际土细菌的共有 T-RFs片段
Table 3 T-RFs fragments co-existing in rhizosphere soils of potato first-planted and continuously cropped for 10 years
丰度百分比
Abundance percentage (%)
对应分类 Classification 片段长度
Fragment
length (bp) A2 D2 门 Phylum 纲 Class 属 Genus
61 1.23 2.35 变形菌门 Proteobacteria α-变形菌纲 α-proteobacteria 鲁杰氏菌属 Ruegeria
291 7.68 8.66 变形菌门 Proteobacteria α-变形菌纲 α-proteobacteria 中慢生根瘤菌属 Mesorhizobium
296 4.20 4.43 变形菌门 Proteobacteria α-变形菌纲 α-proteobacteria 巴尔通氏体属 Bartonella
217 3.16 4.27 变形菌门 Proteobacteria β-变形菌纲 β-proteobacteria 硫单胞菌属 Thiomonas
37 11.41 12.78 变形菌门 Proteobacteria γ-变形菌纲 γ-proteobacteria 寡养单胞菌属 Stenotrophomonas
194 0.62 0.46 厚壁菌门 Firmicutes 芽孢杆菌纲 Bacilli 指环酸芽孢杆菌属 Alicyclobacillus
209 0.69 0.66 厚壁菌门 Firmicutes 芽孢杆菌纲 Bacilli 泥土芽孢杆菌属 Geobacillus
219 0.63 0.59 厚壁菌门 Firmicutes 芽孢杆菌纲 Bacilli 短小芽孢杆菌属 Brevibacillus
232 1.28 0.38 厚壁菌门 Firmicutes 芽孢杆菌纲 Bacilli 利斯塔氏菌属 Listeria
233 2.11 1.11 厚壁菌门 Firmicutes 芽孢杆菌纲 Bacilli 芽孢杆菌属 Bacillus
270 1.41 0.53 厚壁菌门 Firmicutes 芽孢杆菌纲 Bacilli 链球菌属 Streptococcus
279 0.71 0.47 厚壁菌门 Firmicutes 芽孢杆菌纲 Bacilli 乳酸杆菌属 Lactobacillus
308 0.49 0.59 厚壁菌门 Firmicutes 芽孢杆菌纲 Bacilli 芽孢杆菌属 Bacillus
323 0.52 0.58 厚壁菌门 Firmicutes 芽孢杆菌纲 Bacilli 乳酸杆菌属 Lactobacillus
365 0.65 0.42 厚壁菌门 Firmicutes 芽孢杆菌纲 Bacilli 芽孢杆菌属 Bacillus
146 1.12 0.73 厚壁菌门 Firmicutes 梭菌纲 Clostridia Symbiobacterium
258 1.23 1.76 厚壁菌门 Firmicutes 梭菌纲 Clostridia 梭菌属 Clostridium
301 1.34 1.39 厚壁菌门 Firmicutes 梭菌纲 Clostridia 梭菌属 Clostridium
316 0.51 0.52 厚壁菌门 Firmicutes 梭菌纲 Clostridia Anaerococcus
329 0.55 0.64 厚壁菌门 Firmicutes 梭菌纲 Clostridia 脱亚硫酸菌属 Desulfitobacterium
64 1.16 4.51 放线菌门 Actinobacteria 放线菌亚纲 Actinobacteridae 粗食杆菌属 Modestobacter
197 0.54 1.18 放线菌门 Actinobacteria 放线菌亚纲 Actinobacteridae 诺卡氏菌属 Nocardioides
224 3.19 2.83 放线菌门 Actinobacteria 放线菌亚纲 Actinobacteridae 链霉菌属 Streptomyces
410 1.17 4.25 放线菌门 Actinobacteria 放线菌亚纲 Actinobacteridae 动弯杆菌属 Mobiluncus
138 0.67 0.74 蓝细菌门 Cyanobacteria 蓝细菌纲 Cyanobacteria 聚球藻属 Synechococcus
201 0.52 0.71 绿屈挠菌门 Chloroflexi 绿屈挠菌纲 Chloroflexi 绿弯菌属 Chloroflexus
38 2.44 2.13 拟杆菌门 Bacteroidetes 黄杆菌纲 Flavobacteria 黄褐二氧化碳嗜纤维菌属 Capnocytophaga
230 中国生态农业学报 2015 第 23卷


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表 4为马铃薯正茬与连作 10年成熟期根际土细
菌群落中特有 T-RFs片段。连作 10年马铃薯的成熟
期根际土特有细菌包括 4 个门 7 个纲, 分别为变形
菌门(α-变形菌纲、β-变形菌纲、δ-变形菌纲)、厚壁
菌门(芽孢杆菌纲、梭菌纲)、蓝细菌门(蓝细菌纲)和
异常球菌−栖热菌门(异常球菌纲)。土样中虽含有与
碳元素循环有关的聚球藻属 (T-RFs 长度为 128
bp)[18], 但同时存在大量潜在的致病菌包括奈瑟菌属
(T-RFs长度 206 bp)、梭菌属(T-RFs长度为 214 bp)、
罗尔斯通菌属[19](T-RFs长度为 200 bp)等。
表 4 连作 10年马铃薯根际土细菌特有的 T-RFs片段(与正茬对比)
Table 4 Special T-RFs fragments in rhizosphere soil of potato continuously cropped for 10 years compared with that of first
planted potato
对应分类 Classification 片段长度
Fragment length (bp) 门 Phylum 纲 Class 属 Genus
73 变形菌门 Proteobacteria α-变形菌纲 α-proteobacteria 醋杆菌属 Granulibacter
128 蓝细菌门 Cyanobacteria 蓝细菌纲 Cyanobacteria 聚球藻属 Synechococcus
132 异常栖热菌门 DeinococcusThermus 异常球菌纲 Deinococci 异常球菌属 Deinococcus
178 厚壁菌门 Firmicutes 芽孢杆菌纲 Bacilli 动性球菌属 Planococcus
193 变形菌门 Proteobacteria α-变形菌纲 α-proteobacteria 副球菌属 Paracoccus
200 变形菌门 Proteobacteria β-变形菌纲 β-proteobacteria 罗尔斯通菌属 Ralstonia
203 变形菌门 Proteobacteria δ-变形菌纲 δ-proteobacteria 粘球菌属 Myxococcus
205 厚壁菌门 Firmicutes 梭菌纲 Clostridia 月形单胞菌属 Selenomonas
206 变形菌门 Proteobacteria β-变形菌纲 β-proteobacteria 奈瑟菌属 Neisseria
208 异常栖热菌门 DeinococcusThermus 异常球菌纲 Deinococci 稍热菌属 Meiothermus
214 厚壁菌门 Firmicutes 梭菌纲 Clostridia 梭菌属 Clostridium
216 厚壁菌门 Firmicutes 梭菌纲 Clostridia 真杆菌属 Eubacterium
236 厚壁菌门 Firmicutes 梭菌纲 Clostridia 热厌氧杆菌属 Thermoanaerobacter
295 变形菌门 Proteobacteria α-变形菌纲 α-proteobacteria 巴尔通氏体属 Bartonella
307 厚壁菌门 Firmicutes 芽孢杆菌纲 Bacilli 链球菌属 Streptococcus
327 厚壁菌门 Firmicutes 芽孢杆菌纲 Bacilli 乳酸杆菌属 Lactobacillus
368 厚壁菌门 Firmicutes 梭菌纲 Clostridia Pelotomaculum
376 蓝细菌门 Cyanobacteria 蓝细菌纲 Cyanobacteria Geitlerinema
399 变形菌门 Proteobacteria α-变形菌纲 α-proteobacteria 埃立克体属 Ehrlichia

3 讨论与结论
3.1 马铃薯连作对土壤微生物菌群的影响
不同连作年限马铃薯播种前和成熟期根际土
壤微生物多样性存在明显差异 , 连作导致马铃薯
根际土壤细菌多样性水平降低 , 真菌多样性水平
升高 , 这与吴凤芝等 [20]对黄瓜连作和李春格等 [21]
对大豆连作的研究结果相一致。同一连作年限中 ,
成熟期马铃薯根际土壤中细菌和真菌多样性水平
都比播种前有一定程度的降低, 可能原因是马铃薯
植株生长过程中, 根系产生的分泌物改变了土壤微
生态环境, 不利于某些微生物的生长, 致使多样性
水平下降。
马铃薯连作后土壤细菌各纲所占比例发生较大
的变化, 芽孢杆菌纲中的有益菌群逐渐减少, 此纲
中枯草芽孢杆菌(B. subtilis)能降解酚酸类化合物,
类芽孢杆菌属(Paenibacillus)能降解多芳香族碳氢化
合物, 铫子短小芽孢杆菌(Brevibacillus invocatus)可
以分解酚, 解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)能
分解淀粉, 侧孢短芽孢杆菌(B. laterosporu)能抵抗有
害真菌, 球形芽孢杆菌(B. sphaericus)和某些枯草芽
孢杆菌还具有固氮作用等[18]。β-变形菌纲比例升高,
此纲中奈瑟菌属和罗尔斯通菌是马铃薯潜在的致病
菌群。此外, 马铃薯正茬和连作 10 年的土壤细菌
T-RFs 片段定性分析发现放线菌纲中链霉菌属[22]细
菌丰度百分比下降, 而潜在的致病菌梭菌纲中梭菌
属丰度百分比上升, 表明根际土壤细菌菌群中益生
菌在减少、潜在的病原菌在增加, 马铃薯根际细菌
菌群的功能受到破坏。
本研究中未捡出有关马铃薯致病的真菌, 可能
与 MiCA3 网站中真菌 T-RFLP 数据库不够完善, 反
馈出的结果太少有关。因此, 在今后的研究中应该
选择更能反映真菌遗传多样性的方法。
第 2期 秦 越等: 马铃薯连作栽培对土壤微生物多样性的影响 231


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3.2 马铃薯连作障碍的成因
马铃薯连作障碍产生的原因主要与土壤肥力、
自毒作用及土壤微环境的恶化有着密切的关系[2−4]。
研究试验地位于宁夏南部山区, 试验地土壤肥力较
高, 加之农民适宜的培肥措施, 因此尽管连续多年
种植马铃薯, 土壤肥力未受到明显影响[13]。本研究
中马铃薯正茬和连作土壤均具有较高的土壤有机质
和全氮, 且该研究区域气候冷凉, 有机质的矿化过
程缓慢, 连作栽培下土壤肥力的衰退很可能是一个
缓慢渐变的过程, 高的肥力水平保证了马铃薯正常
生长发育的需要。
本研究发现连作栽培可导致马铃薯土壤微生物
群落发生改变, 土壤中有益菌群比例下降乃至逐渐
消失, 一些潜在的致病菌群在连作栽培后的土壤中
出现, 导致马铃薯生长的微环境恶化。但田间试验
表明, 连作 1 年、6 年和 10 年的马铃薯生长状况并
未表现出和正茬马铃薯的明显差异。按照现在连作
障碍理论, 连作可增大作物对土壤微生物的选择压
力, 降低土壤微生物多样性, 长期连作可导致作物
生长状况越来越差, 然而这一理论并不能解释本试
验的结果。
马铃薯长期连作栽培后根际土壤中虽然出现了
一些潜在的致病菌群, 但马铃薯病害的发生却一直
较轻, 比较李春格等 [21]的研究结果, 分析认为马铃
薯连作障碍可能是土壤−微生物−植物−气候综合相
互作用的结果, 单一因素的研究很难对田间试验情
况作出较合理的解释。
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