全 文 ：中国生态农业学报 2015年 4月 第 23卷 第 4期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Apr. 2015, 23(4): 432−440


* 农业部公益性行业科研专项(201103004)资助
** 通讯作者: 褚贵新, 主要研究方向为植物营养与土壤微生物分子生态。E-mail: chuguixinshzu@163.com
李锐, 主要研究方向为土壤微生物分子生态。E-mail: ruiliedu@126.com
收稿日期: 2014−09−24 接受日期: 2015−01−20
http://www.ecoagri.ac.cn
DOI: 10.13930/j.cnki.cjea.141113
棉花连作对北疆土壤酶活性、致病菌及
拮抗菌多样性的影响*
李 锐 刘 瑜 褚贵新** 高 慧
(新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点试验室/石河子大学农学院 石河子 832003)
摘 要 本文通过测定土壤酶活性与微生物 PCR-DGGE 指纹图谱研究了北疆棉区 5 年棉花连作(CtN5)、10
年棉花连作(CtN10)及 15 年棉花连作(CtN15)对土壤过氧化氢酶、蔗糖酶、芳基硫酸酯酶、脱氢酶和蛋白酶酶
活性的影响, 分析了土壤细菌、真菌、镰刀菌和枯草芽孢杆菌群落结构多样性对北疆棉田长期连作的响应。
结果表明: 过氧化氢酶、蔗糖酶、脱氢酶活性随棉花连作年限延长而下降。CtN15处理的过氧化氢酶、蔗糖酶
和脱氢酶活性分别比 CtN10处理下降 15.0%、6.4%和 12.0%, 比 CtN5处理下降 16.8%、58.6%和 49.5%(P<0.05);
芳基硫酸酯酶与蛋白酶活性随连作年限的增加呈先下降后升高的特点。土壤细菌、真菌多样性指数随连作年
限的增加明显下降。CtN15 的细菌条带数比 CtN10 下降 7.41%, CtN10 比 CtN5 降低 1.72%。CtN15 真菌条带
数和 Shannon-Wiener多样性指数分别为 78和 3.22, 比 CtN5处理低 17.02%和 5.29%。土壤镰刀菌和枯草芽孢
杆菌的条带数、多样性指数均表现为先下降后升高。CtN15枯草芽孢杆菌 Shannon-Wiener和 Simpson指数分
别比 CtN10 处理高 54.8%和 14.5%。北疆长期连作棉田的土壤酶活性和土壤微生物群落多样性总体呈下降趋
势, 长期连作对棉田土壤生物性状有明显负面影响。
关键词 棉花 连作 土壤酶活性 土壤微生物 群落结构 物种多样性 PCR-DGGE
中图分类号: S154.36 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2015)04-0432-09
Response of soil enzyme activity and microbial community structure,
diversity to continuous cotton cropping in northern Xinjiang
LI Rui, LIU Yu, CHU Guixin, GAO Hui
(Xinjiang Production and Construction Group Key Laboratory of Oasis Ecological Agriculture / College of Agronomy, Shihezi
University, Shihezi 832003, China)
Abstract As a major cash crop, cotton has been widely cultivated for several decades in Xinjiang Uygur Autonomous Region
(referred to as Xinjiang). Due to continuous cotton cropping over a long period, soil-borne diseases (e.g., Fusarium sp. and
Verticillium dahlia) have worsened in cotton fields in recent years, resulting in substantial yield declines. The objective of this study
was to determine the effects of long-term cultivation of cotton on soil biological activity, soil microbial community structure,
microbial genetic diversity (e.g., total bacterial and total fungi) and specific soil microbe (e.g., fusarium and bacillus). Three cotton
treatments [continuous mono-cropping for 5 consecutive years (CtN5), for 10 consecutive years (CtN10) and for 15 consecutive
years (CtN15)] were set up in an oasis farmland in northern Xinjiang. Then soil peroxidase, invertase, arylsulfatase, dehydrogenase,
and protease activities were measured, while soil microbial community structure diversities of total bacteria, total fungi, fusarium
soil-borne pathogenic bacteria and bacillus soil antagonistic bacteria were determined using PCR-DGGE fingerprint approach. There
was a significantly decreasing tendency in soil catalase, invertase and dehydrogenase activities with increasing years of continuous
cropping. For instance, compared with CtN10, CtN15 treatment decreased activities by 15.0% for catalase and by 6.4% for invertase.
However, arylsulfatase and protease activities decreased from continuous cotton cropping of 5 years (CtN5) to 10 years (CtN10)
第 4期 李 锐等: 棉花连作对北疆土壤酶活性、致病菌及拮抗菌多样性的影响 433


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followed by an increasing tendency from continuous cotton cropping of 10 years (CtN10) to 15 years (CtN15). The Shannon-Wiener
and Simpson indices of soil total bacteria and total fungi declined markedly with increasing years of continuous cotton cropping.
Compared with CtN10, the quantity of soil total bacteria gene band (DGGE fingerprint) decreased by 7.41% under CtN15. It
decreased by 1.72% from CtN5 treatment to CtN10 treatment. The values of soil total fungal gene band and Shannon-Wiener
diversity index were 78 and 3.22 under CtN15 treatment, suggesting respectively 17.02% and 5.29% decreases under CtN15
compared with CtN5. Compared with CtN10 treatment, the Shannon-Wiener and Simpson indices of soil bacillus community
increased respectively by 54.8% and 14.5% under CtN15 treatment. Moreover, the amount of fusarium gene and bacillus gene bands
as well as the related diversity indices decreased from CtN5 to CtN10 treatment, but then increased from CtN10 to CtN15. In
conclusion therefore, soil enzyme activity and microbial community structure and diversity decreased with increasing years of
continuous cotton cropping. Long-term, continuous cultivation of cotton had an adverse effect on soil biological characteristics in
northern Xinjiang.
Keywords Cotton; Continuous cropping; Soil enzyme activity; Soil microbial; Community structure; Species diversity;
PCR-DGGE
(Received Sep. 24, 2014; accepted Jan. 20, 2015)
连作障碍是指在同一块田地连续种植同一种
(科)作物导致产量降低、品质变劣、土壤物质生产性
能变差的现象[1−2]。早在公元前 300年, 人们就已经
发现了连作障碍, 但由于传统农业的轮作倒茬与精
耕细作, 因此并未造成严重损失[3]。进入现代农业,
长期连作引发的作物大面积减产、土传病害发生等
在全国各地普遍存在。如黑龙江东北部大豆(Glycine
max)重迎茬面积已达 70%以上[4], 与正茬相比引起
的减产幅度可达 10%~40%[5]。水稻(Oryza sative)、
辣椒(Capsicum annuum)、西瓜(Citrullus vulgaris)等
长期种植也会引发土传病害加剧, 导致作物产量显
著下降[6−8]。连作障碍是土壤−植物−微生物等诸因素
综合作用的结果, 与土壤微生物区系失衡、植物营
养吸收差异性及根系次生代谢化感物质等密切相
关[9−11]。谷岩等[12]研究发现大豆长期连作的土壤脲
酶和转化酶活性降低, 真菌和细菌磷脂脂肪酸分析
(PLFAs)比例显著增加。马铃薯(Solanum tuberosum)
连作则增加了镰刀菌(Fusarium spp.)和大丽轮枝菌
(Verticillium dahliae)的种群或个体数量 , 这些真菌
是导致马铃薯土传病害的主要致病菌类型(试验结
果未发表)。王志刚等[13]研究表明, 根际土壤过氧化
氢酶与多酚氧化酶活性随韭菜(Allium tuberosum)连
作年限的增加而降低。可见, 长期连作明显影响了
土壤微生物种群数量与群落结构, 导致病原微生物
扩增并造成病害型连作障碍。保持农田土壤微生物
群落多样性对提高土壤生物活性、减轻土传病害具
有重要意义。
作为农业支柱产业, 棉花(Gossypium hirsutum)
种植面积占新疆作物总面积的 50%~70%, 有些地区
甚至达到 90%[14]。多年连作导致棉花枯、黄萎病加
剧, 严重威胁新疆棉花可持续生产。前人对新疆棉
花枯萎病(Fusarium oxysporium spp.)、黄萎病病菌
(Verticillium dahliae)的研究主要集中在致病菌的分
离鉴定、可培养菌系的数量动态变化等方面, 从农
田土壤致病菌与拮抗菌多样性角度, 研究长期连作
对滴灌棉田土壤镰刀菌和枯草芽孢杆菌群落结构的
影响鲜有报道。
本试验在北疆石河子莫索湾垦区选取 5 年、10
年和 15年连作棉田典型样地, 通过酶学和微生物分
子生态学技术对长期连作棉田土壤酶活性、致病菌
与拮抗菌群落结构多样性进行了研究, 试图揭示土
壤酶活性与致病菌、拮抗菌群落多样性对北疆棉区
棉花长期连作的响应, 为构建健康土壤微生物区系
及棉田土传病害防治提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验设置
试验区基本情况 : 新疆第八师莫索湾垦区147
团(44°54′~44°69′N, 85°98′~86°13′E), 位于天山北麓
准葛尔盆地南缘玛纳斯河中游冲积平原, 属绿洲灌
溉农业区。年均≥10 ℃积温为3 600~3 750 , ℃ 年降
水量为158.5~172.4 mm, 无霜期155~178 d。供试土
壤属灌耕灰漠土(灌淤旱耕人为土, calcaric fluvisals),
pH 8.03, 有机质10.42 g·kg−1, 土壤矿质氮57.63 mg·kg−1,
有效磷10.27 mg·kg−1, 有效钾379 mg·kg−1。试验选
取不同种植年限的棉田 (147团21连 ), 分别为5年
棉花连作(CtN5), 样地面积0.5 hm2; 10年棉花连作
(CtN10), 样地面积1 hm2; 15年棉花连作(CtN15), 样
地面积3 hm2。
1.2 样品采集
采用多点混合法以“S”型路线在样地上采集0~
20 cm耕层土壤, 在样点附近取12钻为1个混合样, 共
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3个混合样。土样采集后, 一部分存放在4 ℃冰箱, 用
于测定酶活性; 另一部分存放在−80 ℃冰箱, 用于土
壤DNA提取和后续PCR-DGGE分子生物学指标测定。
1.3 土壤酶活性测定
土壤过氧化氢酶活性采用微量滴定法测定(5 g
土, 0.5 h), 结果以1 g土壤在30 min消耗的高锰酸钾
的毫升数表示[15]。蔗糖酶采用二硝基水杨酸比色法
(5 g土, 37 , 24 h), ℃ 显色强度在分光光度计508 nm
波长测定 , 酶活性用24 h后1 g土壤中葡萄糖的毫
克数表示 [15]。芳基硫酸酯酶采用对硝基苯硫酸钾
比色法(5 g土 , 37 , l h), ℃ 显色强度通过分光光度
计410 nm波长测定, 结果以每小时1 g土壤中释放
出的对硝基苯酚微克数表示[16]。脱氢酶采用TTC比
色法(6 g土, 37 , 24 h), ℃ 显色强度通过分光光度计
485 nm波长测定, 结果以每小时1 g土壤中释放出三
苯基甲臜(TPF)的微克数表示[17]。蛋白酶采用以酪蛋
白做底物的方法(2.5 g土, 50 , 2 h), ℃ 显色强度通过
分光光度计700 nm波长测定, 结果以2 h后1 g土壤
中酪氨酸的微克数表示[17]。
1.4 土壤 DNA及微生物群落结构与多样性测定
土壤总 DNA 的提取采用 PowerSoilTM DNA
Isolation Kit(MO BIO Laboratories Inc.USA)。试验所
用引物和 Taq酶试剂盒均由大连宝生公司生产。
1.4.1 细菌 16S rDNA V6区 PCR扩增及变性梯度
凝胶电泳(DGGE)
细菌 16S rDNA V6区 PCR扩增采用通用引物对
F968-R1401, 引物序列见表 1。PCR 扩增条件为 :
94 ℃变性 5 min, 接着 20个循环(94 ℃变性 1 min,
67 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 每个循环退火温度
降 0.5 ), ℃ 然后 15个循环(94 ℃变性 1 min, 57 ℃退
火 1 min, 72 ℃延伸 1 min, 每个循环退火温度降 0.5 )℃ ,
最后再 72 ℃延伸 10 min。产物片段长度 450 bp。土壤
中总细菌(16S rDNA)PCR产物进行 DGGE分离时, 使
用 7%的胶, 变性浓度 45%~55%, 缓冲液为 1×TAE溶
液, 电泳条件: 电压 110 V, 温度 60 , ℃ 时间 17 h。
1.4.2 真菌 ITS 18S rDNA PCR扩增及变性梯度凝
胶电泳(DGGE)
真菌 ITS 18S rDNA PCR扩增采用通用引物对
ITS1F-ITS2, 引物序列见表 1。PCR 扩增条件为 :
94 ℃变性 5 min, 接着 36个循环(94 ℃变性 30 s, 56 ℃
退火 1 min, 72 ℃延伸 1 min), 最后再 72 ℃延伸
10 min。产物片段长度300 bp。土壤中真菌(ITS区)PCR
产物进行 DGGE 分离时, 使用 8%的胶, 变性浓度
30%~50%, 缓冲液为 1×TAE 溶液, 电泳条件: 电压
110 V, 温度 60 , ℃ 时间 17 h。
1.4.3 镰刀菌 Nest PCR 扩增及变性梯度凝胶电泳
(DGGE)
Fusarium Nest rDNA PCR扩增采用通用引物对
EF 1−EF 2和Alfie1F-GC−Alfie2R, 引物序列见表 1。
第 1轮反应中, 每 25 μL反应体系含有 1 μL 10 mmol·L−1
EF 1溶液, 1 μL 10 mmol·L−1 EF 2溶液, 2 μL 2.5 mmol·L−1
each dNTPs, 2.5 μL 10×PCR Buffer, 0.2 μL Taq Plus
DNA Polymerase(上述所有药品均购自大连宝生公
司), 3 μL土壤总 DNA溶液, 再加无菌去离子水至
25 μL。PCR扩增条件为: 94 ℃变性 5 min, 接着 43个
循环(95 ℃变性 45 s, 50 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸 45 s),
最后再72 ℃延伸10 min。第1轮产物片段长度1 000 bp,
此处并非只有 1 条很显著的特异性条带, 而是有很
多条非特异性条带, 并不影响第 2 轮扩增。第 2 轮反
应中, 每 25 μL 反应体系中, 含有 1 μL 10 mmol·L−1
Alfie1F-GC 溶液 , 1 μL 10 mmol·L−1 Alfie2R 溶液 ,
2 μL 2.5 mmol·L−1 each dNTPs, 2.5 μL 10×PCR Buffer,
0.2 μL Taq Plus DNA Polymerase(上述所有药品均购
自大连宝生公司), 3 μL第 1轮 PCR产物后的 DNA
溶液, 再加无菌去离子水至 25 μL。PCR扩增条件为:
94 ℃变性 3 min, 接着 30个循环(92 ℃变性 30 s, 55 ℃
退火 1 min, 68 ℃延伸 45 s), 最后再 68 ℃延伸 15 min。
第 2轮产物片段长度 500 bp。进行 PCR-DGGE电泳
条件: 使用 6%的胶, 变性浓度 40%~60%, 缓冲液为
1×TAE溶液, 电压 110 V, 温度 60 , ℃ 时间 17 h。
1.4.4 枯草芽孢杆菌 Nest PCR 扩增及变性梯度凝
胶电泳(DGGE)
Bacillus Nest rDNA PCR 扩增采用通用引物对
BACF−R1378 和 F968−R1378, 引物序列见表 1。第 1
轮反应中, 每 25 μL反应体系含有 1.5 μL 10 mmol·L−1
BACF 溶液 , 1.5 μL 10 mmol·L−1 R1378 溶液 , 2 μL
2.5 mmol·L−1 each dNTPs, 2.5 μL 10×PCR Buffer,
0.25 μL Taq Plus DNA Polymerase(上述所有药品均
购自大连宝生公司), 2 μL土壤总 DNA溶液, 再加无
菌去离子水至 25 μL。PCR扩增条件为: 94 ℃变性
5 min, 接着 2个循环(94 ℃变性 1 min, 63 ℃退火
1 min, 68 ℃延伸 2 min), 然后再 2个循环(94 ℃变性
1 min, 61 ℃退火 1 min, 68 ℃延伸 2 min), 随后再 2
个循环(94 ℃变性 1 min, 59 ℃退火 1 min, 68 ℃延伸
2 min), 紧接着再 2个循环(94 ℃变性 1 min, 57 ℃退
火 1 min, 68 ℃延伸 2 min), 之后再 22个循环(94 ℃
变性 1 min, 55 ℃退火 1 min, 68 ℃延伸 2 min), 最
后再 68 ℃延伸 15 min。产物片段长度 1 300 bp。
第 2轮反应中, 每 25 μL反应体系中, 含有 1.25 μL
10 mmol·L−1 F968-GC 溶液, 1.25 μL 10 mmol·L−1
R1378溶液, 2 μL 2.5 mmol·L−1 each dNTPs, 2.5 μL
第 4期 李 锐等: 棉花连作对北疆土壤酶活性、致病菌及拮抗菌多样性的影响 435


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表 1 供试的细菌、真菌、镰刀菌、枯草芽孢杆菌的引物
Table 1 Primers used for bacteria, fungi, fusarium, bacillus PCR
处理 Treatment 引物名 Primer name 序列 Sequences (5′-3′) 参考文献 Reference
F968-GC 5′-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3′ 细菌 Bacteria
R1401 5′-GCG TGT GTA CAA GAC CC-3′
[18]
ITS1F-GC 5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3′ 真菌 Fungi
ITS2 5′-TTY GCT GYG TTC TTC ATC G-3′
[19]
EF 1 5′-ATG GGT AAG GAR GAC AAG AC-3′
EF 2 5′-GGA RGT ACC AGT SAT CAT GTT-3′
Alfie1F-GC 5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GTC GTC ATC GGC CAC GTC GAC TC-3′
镰刀菌
Fusarium
Alfie2R 5′-CCT TAC CGA GCT CRG CGG CTT C-3′
[20]
BACF 5′-GGG AAA CCG GGG CTA ATA CCG GAT-3′
R1378 5′-CGG TGT GTA CAA GGC CCG GGA ACG-3′
F968-GC 5′-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3′
枯草芽孢杆菌
Bacillus
R1378 5′-CGG TGT GTA CAA GGC CCG GGA ACG-3′
[21]

10×PCR Buffer, 0.2 μL Taq Plus DNA Polymerase(上
述所有药品均购自大连宝生公司), 3 μL第 1轮 PCR
产物稀释 2万倍后的 DNA溶液, 再加无菌去离子水
至 25 μL。PCR扩增条件为: 94 ℃变性 3 min, 接着
30个循环(92 ℃变性 30 s, 55 ℃退火 1 min, 68 ℃延
伸 45 s), 最后再 68 ℃延伸 15 min。产物片段长度
410 bp。进行 PCR-DGGE 电泳条件: 使用 7%的胶,
变性浓度 50%~65%, 缓冲液为 1×TAE 溶液, 电压
110 V, 温度 60 , ℃ 时间 17 h。
以上 PCR 扩增片段均经 1.5%琼脂糖进行目标
基因检测, DGGE使用 SYBR® Gold nucleic acid gel
stain(USA)染色 20 min。
1.5 数据处理
DGGE指纹图谱分析借助于Photoshop7.0进行图
片调整, Gel-QuantTM 1.0软件(Multiplexed Biotechno-
logies Inc, USA)进行条带判读、迁移率、强度、面
积计算, 采用UPGMA(unweighted pair group method
using arithmetic average)方法进行聚类分析 , 再根
据 Primer 6.0软件 (Plymouth, United Kingdom)对
DGGE指纹图谱进行PCA分析。根据条带的相对位置
和相对强度计算Shannon-Wiener 指数(H)和Simpson
均匀度指数(E)来评价微生物的多样性[22]。
Shannon-Wiener指数: H=−
1
ln
s
i i
i
p p
=
∑ (1)
Simpson均匀度指数: E=1− 2
1
s
i
ip
=
∑ (2)
式中: Pi为第 i 个物种在全部样品中的比例(Pi=ni/N,
ni为第 i个物种的个体数, N表示每个样品中检测到
的条带数), S 表示 DGGE 检测到的每一泳道的条带
总数即种的数目。数据分析采用 Excel 2010 和 SPSS
17.0 统计分析软件进行处理, 处理间的差异显著性
采用 Duncan法进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 棉花连作对土壤酶活性的影响
过氧化氢酶、蔗糖酶、芳基硫酸酯酶、脱氢酶
及蛋白酶反映土壤生物活性与代谢功能[7,12]。由表 2
可知 , 长期连作对棉田土壤过氧化氢酶、蔗糖酶、
芳基硫酸酯酶、脱氢酶和蛋白酶活性均有明显影响。
过氧化氢酶活性在 CtN5处理最高, CtN15处理最低。
蔗糖酶活性在各处理间表现为: CtN5>CtN10>CtN15。
CtN10和CtN15处理的脱氢酶活性较CtN5处理分别
降低 42.6%和 49.5%(P<0.05)。随着棉花连作年限
的增加 , CtN5 处理的过氧化氢酶、蔗糖酶、脱氢
酶活性分别比 CtN15处理高 20.2%、141.3%、97.9%
(P<0.05), CtN15处理的过氧化氢酶、蔗糖酶和脱氢
酶活性分别比CtN10处理下降 15.0%、6.4%和 12.0%,
比 CtN5处理下降 16.8%、58.6% 和 49.5% (P<0.05)。
芳基硫酸酯酶、蛋白酶在棉花连作 5~15年中先降低
后升高。总体上, 过氧化氢酶、蔗糖酶、脱氢酶活
性随连作年限而降低, 芳基硫酸酯酶与蛋白酶活性
变化呈先下降后升高的特点, 说明绿洲棉田长期连
作使部分土壤酶活性下降。
2.2 棉花连作对土壤微生物群落结构的影响
2.2.1 棉花连作对土壤细菌、真菌群落结构的影响
细菌和真菌是土壤中两类最主要的微生物类
群。聚类分析(UPGMA)结果表明, 在相似度为 75%
情况下, CtN15与 CtN5各自聚为一类, 而 CtN10与
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表 2 连作对棉田土壤酶活性的影响
Table 2 Influence of cotton continuous planting on soil enzyme activities
处理
Treatment
过氧化氢酶
Catalase (mL·g−1)
蔗糖酶
Invertase (mg·g−1·h −1)
芳基硫酸酯酶 Arylsulfatase
[μg(PNP)·g−1·h−1]
脱氢酶 Dehydrogenase
[μg(TPF)·g−1·24h−1]
蛋白酶 Protease
(μg·g−1·h−1)
CtN5 2.80±0.02a 9.12±0.75a 74.7±0.6b 13.10±0.10a 9.12±0.19a
CtN10 2.74±0.05a 4.04±1.11b 67.0±0.3c 7.52±0.10b 7.27±0.22b
CtN15 2.33±0.02b 3.78±0.61b 143.1±0.2a 6.62±0.05c 9.24±0.40a
CtN5: 5年棉花连作; CtN10: 10年棉花连作; CtN15: 15年棉花连作。表格中同列不同字母表示处理间差异达到显著性水平(P<0.05). 下同。
CtN5: continuous cotton mono-cropping for 5 years; CtN10: continuous cotton mono-cropping for 10 years; CtN15: continuous cotton mono-cropping
for 15 years. Different letters in the same column indicate significant difference among treatments at 0.05 level. The same below.

CtN5的细菌群落多样性相似度较为接近(图 1A)。主
成分分析(PCA)结果显示, 土壤细菌群落的 2个主成
分轴 PC1和 PC2分别代表总变量的 33.8%和 21.2%,
累计方差贡献率为 55.0%(图 1B)。在第 1 主成分轴
能把 CtN15与 CtN5、CtN10相区分, 而第 2主成分
轴区别不明显。说明绿洲棉田连作不同年限改变了
土壤细菌群落结构。真菌 DGGE指纹图谱聚类分析
(UPGMA)表明, 不同处理可聚为两类: CtN15 单独
聚为一类, CtN5 与 CtN10 聚为一类, 两类之间的相
似度为 70%(图 1C)。由图 1D PCA 分析可知, 土壤
真菌第 1 主成分(PC1)贡献率是 31.7%, 第 2 主成分
(PC2)贡献率是 21.2%, 累计方差贡献率为 52.9%。
在第 1主成分轴上, CtN15明显区别于其他 2个处理;
在第 2主成分轴上, CtN10有别于 CtN5与 CtN15。
聚类分析与 PCA分析结果均表明, 新疆绿洲地区棉
花长期连作对土壤真菌群落结构有明显影响。

图 1 连作棉田土壤细菌(A、B)、真菌(C、D)群落 DGGE指纹图谱聚类分析(A、C)与 PCA分析(B、D)
Fig. 1 Cluster (A, C) and PCA analysis (B, D) of soil microbial communities of bacteria (A, B) and fungi (C, D) under
continuous cotton mono-cropping
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2.2.2 棉花连作对土壤镰刀菌和枯草芽孢杆菌群落
结构的影响
镰刀菌是一类导致棉田发生病害的典型土传病
原微生物, 可引起棉花枯萎病。枯草芽孢杆菌能产
生多种微生物酶和抗菌物质, 常被用作生防菌, 对
土传病害具有显著的拮抗作用。图 2A、B分别为土
壤镰刀菌和枯草芽孢杆菌的 DGGE 指纹图谱。由
DGGE 指纹印迹可知, 不同泳道条带数越多说明微
生物群落多样性越丰富, 亮度越大密度越高, 说明
群落中某一种群的数量越多。对不同连作年限土壤
镰刀菌和枯草芽孢杆菌群落结构 DGGE 指纹图谱进
行主成分(PCA)分析, 结果表明在相似度为 37%情况
下, 土壤镰刀菌的主成分(PC1 20.2%与 PC2 18.3%)
可解释总方差变异的 38.5%; 在相似度为 58%情况
下, 土壤枯草芽孢杆菌的主成分(PC1 41.6%与 PC2
20.1%)可代表总方差变异的 61.7%。由图 2C 可知,
土壤镰刀菌 3 个处理主要分成两类, 在第 1 主成分
轴 CtN10显著区别于 CtN5和 CtN15, 在第 2主成分
轴上方差分异不明显。土壤枯草芽孢杆菌变化趋势
与镰刀菌相似, 但枯草芽孢杆菌对 3 种处理的响应
更为敏感(图 2D)。说明新疆绿洲棉田连作 5~15 年,
土壤中病原菌、拮抗菌群落结构均发生明显变化。

图 2 连作棉田土壤镰刀菌(A、C)、枯草芽孢杆菌(B、D)群落 DGGE指纹图谱(A、B)与 PCA分析(C、D)
Fig. 2 Finger-print (A, B) and PCA analysis (C, D) of soil microbial communities of fusarium (A, C) and bacillus subtilis (B, D)
under continuous cotton mono-cropping
2.3 棉花连作对土壤微生物群落结构多样性的影响
土壤微生物多样性指数反映了群落中物种的丰
富度及各种群间的均匀度分布状况, 多样性指数的
高低表征微生物群落的复杂度和稳定性大小。由表
3可知, 细菌与真菌的条带数、多样性指数(Shannon-
Wiener指数和 Simpson指数)均随连作年限的增加而
下降。15 年棉花连作真菌的条带数和 Shannon-
Wiener 多样性指数分别比 5 年棉花连作处理低
17.02%和 5.29%。土壤镰刀菌与枯草芽孢杆菌的条
带数、多样性指数随棉花连作年限的增加表现出先
下降后升高的特点。土壤枯草芽孢杆菌的条带数、
Shannon-Wiener 指数和 Simpson 指数表现为 CtN15
处理分别比 CtN10处理高 159.1%、54.8%、14.5%。
表明新疆绿洲棉田长期连作致使土壤主要微生物菌
群多样性发生变化。
3 讨论与结论
长期连作使土壤有益菌种群结构随连作年限降
低, 病原菌种群结构则随连作年限增加, 导致土壤
微生物群落结构多样性失衡。胡元森等[23]发现作为
拮抗菌的木霉(Trichoderma spp.)数量随黄瓜(Cucumis
sativus)连作急剧下降 , 成为劣势菌群 , 而镰孢菌
438 中国生态农业学报 2015 第 23卷


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表 3 连作对棉田土壤细菌、真菌、镰刀菌、枯草芽孢杆菌多样性指数的影响
Table 3 Influence of cotton continuous mono-cropping on soil microbial diversity indices of bacteria, fungi, fusarium and bacillus subtilis
细菌 Bacteria 真菌 Fungi 镰刀菌 Fusarium 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis
处理
Treat-
ment
条带数
Bands
Shannon-
Wiener指数
Shannon-
Wiener index
Simpson
指数
Simpson
index
条带数
Bands
Shannon-
Wiener指数
Shannon-
Wiener index
Simpson
指数
Simpson
index
条带数
Bands
Shannon-
Wiener指数
Shannon-
Wiener index
Simpson
指数
Simpson
index
条带数
Bands
Shannon-
Wiener指数
Shannon-
Wiener index
Simpson
指数
Simpson
index
CtN5 59 2.97 0.956 94 3.40 0.966 33 2.34 0.912 40 2.42 0.905
CtN10 58 2.87 0.954 88 3.34 0.965 26 2.12 0.891 22 1.77 0.813
CtN15 54 2.88 0.952 78 3.22 0.960 50 2.81 0.948 57 2.74 0.931

(Fusarium oxysporium)数量急剧上升为优势菌群。谷
岩等[12]报道大豆连作真菌和细菌 PLFAs比例显著增
加, 重迎茬使土壤活体微生物总量、土壤微生物量
碳含量显著降低, 说明大豆连作改变了土壤微生物
群落结构。在本试验中, 棉花连作 5~15年使土壤细
菌、真菌群落结构发生了明显变化, 多样性指数呈
下降趋势。究其原因可能是北疆棉花长期连作加之
秸秆还田, 棉花根系分泌的某些化感物质抑制了细
菌、真菌中某些种群的生物活性, 导致其多样性水
平降低。刘建国等[24]对棉花不同连作与秸秆还田年
限分析表明, 秸秆分解产生的化感物质所引起的自
毒作用影响了土壤微生物的区系变化, 这为本文的
推论提供了间接证据。
研究表明, 马铃薯根际镰刀菌数量随连作年限
呈上升趋势, 但不同菌种数量变化的趋势各异[25]。
Zhou等[26]研究发现, 长期连作黄瓜根际土壤尖孢镰
刀菌数量呈先降低后升高又降低的变化趋势。本研
究中棉田镰刀菌多样性先降低后升高, 之后并无再
次降低的变化, 棉花连作 15年镰刀菌和枯草芽孢杆
菌群落结构多样性上升到一个新的水平, 并未导致
棉田土壤微生物多样性的持续下降。Berendsen等[27]
认为土壤微生物在长期协同演化过程中, 致病菌占
优势的农田土壤能够自主富集一种或多种对致病菌
具有抑制作用的微生物, 长期连作不仅可为病原微
生物的增殖提供充分的时间, 又为病原菌与拮抗菌
提供协同演化的生活环境。联系到新疆绿洲长期连
作棉田, 可做如下推论, 即长期连作棉田的病原微
生物种群数量与多样性发展变化到一定程度后会引
起其他微生物群落(拮抗菌)能够自发调整其结构以
适应外部环境, 这是土壤微生态系统中微生物群落
结构的自组织和抗扰动作用的结果。Kinkel 等 [28]
也提出土传病害的病原菌与其他微生物及其土壤
环境之间存在密切的协同演化。生物对环境中能量
的获取和利用机制 , 尤其是针对不同物种 MEQ
(microbiological energy quantum)的确立, 是生物与
环境协同演化的结果[29]。从微生物生态学原理分析,
虽然土壤微生物种群数量及其多样性对外界各种扰
动具有自我调节能力, 但在自然条件下, 其调节的
水平与进程尚远未达到现代农业对作物低发病率和
高产优质的要求。因此, 通过合理轮作或施用生物
有机肥等是今后降低连作障碍, 构建“抑病型”健康
土壤微生物区系的有效途径。
土壤中各种酶是土壤微生物功能多样性的承担
者, 尤其是抗逆性酶与土壤拮抗(致病)菌数量存在
极为密切的关系。如食荚菜豆根腐病(Aphanomyces
euteiches)的抗病性与芳基硫酸酯酶活性呈正相关 ,
并且能够指示土壤真菌生物量[30]。邢会琴等[31]指出
苜蓿 (Medicago sativa)接种白粉病菌 (Sphaerotheca
fuliginea)后 , 叶片过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解
氨酶(PAL)活性均升高, 说明 POD 活性和 PAL 活性
与苜蓿对白粉病的抗性显著相关。苏世鸣等[8]运用
磷脂脂肪酸(PLFA)法分析土壤微生物多样性发现 ,
西瓜单作的根际土壤中真菌数量较多, 细菌数量较
少, 而且主要是革兰氏阳性菌; 单作西瓜的保护性
酶类如根系及叶片中的多酚氧化酶(PPO)、CAT、
POD和 PAL活性均较高。本文蛋白酶和芳基硫酸酯
酶活性变化与土壤中镰刀菌、枯草芽孢杆菌对棉花
长期连作的响应趋势一致。将土壤镰刀菌、枯草芽
孢杆菌的条带数与蛋白酶、芳基硫酸酯酶及过氧化
氢酶活性进行皮尔逊 (Pearson)相关性分析后发现 ,
镰刀菌的条带数与芳基硫酸酯酶活性呈显著正相关
(r=0.79, P<0.05); 与过氧化氢酶活性呈显著负相关
(r=−0.71, P<0.05)。枯草芽孢杆菌的条带数与芳基硫
酸酯酶活性、蛋白酶活性相关系数分别为 0.85、0.86,
表现出显著正相关(P<0.01); 与过氧化氢酶活性呈
显著负相关(r=−0.76, P<0.05)。说明北疆绿洲 15 年
棉花连作土壤致病菌、拮抗菌与土壤抗逆性酶活性
呈现出显著相关关系。
综上所述, 15 年棉花连作对北疆土壤酶活性和
土壤致病菌、拮抗菌群落结构多样性有明显影响。
土壤酶活性随连作年限增加而降低。细菌与真菌的
多样性指数(Shannon-Wiener 指数和 Simpson 指数)
第 4期 李 锐等: 棉花连作对北疆土壤酶活性、致病菌及拮抗菌多样性的影响 439


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在 5~15年连作中呈下降趋势, 土壤镰刀菌与枯草芽
孢杆菌的条带数、多样性指数表现出随棉花连作年
限的增加呈先下降后升高的特点。长期连作对棉田
土壤生物性状有明显负面影响。
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