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Tissue culture of Swertia bimaculata

獐牙菜的组织培养



全 文 :统育苗大田当归茎节 5 月下旬开始伸长相比 ,茎节
始伸长期推迟约 70 d ;抽薹高峰期在 9 月下旬 ,与传
统育苗大田当归早抽薹高峰期 6 月上旬相比 ,抽薹
高峰期推迟约 100 d。因此 ,试验所有发生早抽薹均
属“秋薹”,多数早抽薹植株只抽生花茎 ,未能形成花
序。在总计 15 个处理中 ,6 个处理的早抽薹植株
100 %未能成花 ,另 8 个处理 50 %以上未能成花 ,另
1 个处理 3819 %的未能成花。抽样测定未能形成花
的“秋薹”当归醇溶性浸出物的量为 45193 % ,达到
《中国药典》规定的质量指标。
冬季育苗的播种期能显著影响当归醇溶性浸出
物的量 ,播种越晚 ,可溶性浸出物的量越低。育苗基
质主要通过影响当归苗的质量最终影响当归产品的
商品特性。种子类型对产量和醇溶性浸出物的量的
影响不显著。
综合分析认为 11 月底为当归冬季育苗的最佳
播种期 ;育苗基质应兼顾营养全面与疏松透气特性 ,
同时要便于管理 ,降低成本 ;育苗用种子应选择 3 年
生当归产乳熟侧穗籽 ,避免使用早薹籽。试验在低
海拔地区育苗 ,在高海拔地区定植 ,证明了山地育苗
并不是当归育苗唯一的选择 ,同时否定了低海拔区
不能育苗的传统观念。
参考文献 :
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獐牙菜的组织培养
龙  华1 ,胡雪峰2 ,黄衡宇1 3
(1. 植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室 ,湖南 吉首  416000 ; 2. 湖南保靖县民族中学 ,湖南 保靖  416500)
摘  要 :目的  针对獐牙菜野生资源受到严重破坏的情况 ,系统地探讨了通过组织培养为手段进行人工繁殖的方
法。方法  将种子接种于诱导培养基上 ,待其长成小苗后分别取其不带芽茎段、叶和带芽茎段作为外植体 ,在 MS
培养基上添加不同的激素配比 ,改变培养方式。结果  在所有的实验方案中 ,不带芽茎段是理想的外植体材料。
较适宜的初代培养基为 MS + BA 015 mg/ L + 蔗糖 310 % ,增殖培养基为 MS + BA 015 mg/ L + IBA 011 mg/ L + 蔗
糖 310 % ,而根的诱导则是在 1/ 2MS + NAA 015 mg/ L + 115 %蔗糖的培养基上进行。结论  采用组织培养方式可
进行獐牙菜的快速繁殖 ,为确保这一珍稀药用植物资源的保护和可持续利用提供有效途径。
关键词 :獐牙菜 ;愈伤组织 ;不定芽 ;生根 ;组织培养
中图分类号 :R28611    文献标识码 :A    文章编号 :025322670 (2009) 0320462205
Tissue culture of Swertia bimaculat a
LON G Hua1 , HU Xue2feng2 , HUAN G Heng2yu1
(1. Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Utilization of Hunan Province , J ishou 416000 , China ;
2. Baojing National Middle School of Hunan Province , Baojing 416500 , China)
Abstract : Objective  In order to p rotect t he nat ural resources of S w erti a bi m acul at a which has been
dest royed seriously , t he met hod of artificial p ropagation by way of tissue cult ure have been systematically
st udied. Methods  The stems , leaves , and stems wit h buds which were f rom t he seedlings germinated
f rom t he seeds on t he initial medium were taken as explant s. These explant s were cultured on MS cult ure
media by adding different portions of hormones at various cult ural conditions. Results  The stems were t he
best material in speeding propagation among the t hree explant s. The proper initial medium for t he stems
·264· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs  第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月
3 收稿日期 :2008205225   
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30360009)
作者简介 :龙 华 (1972 —) ,男 ,苗族 ,湖南凤凰人 ,在读硕士研究生 ,研究方向为植物生态学。
Tel :13787938186  E2mail : jsulongh @163. com3 通讯作者 黄衡宇 E2mail : hhyhhy96 @163. com
was MS + BA 015 mg/ L + saccharose 310 % , t he optimum medium for p roliferation was MS + BA 015 mg/
L + IBA 011 mg/ L + saccharose 310 % , and t he best medium for rooting was 1/ 2MS + NAA 015 mg/ L +
saccharose 115 %. Conclusion  Tissue cult ure of S . bim acul ata could make it s p ropagation rapid , it s
resources p reserved , and it s utilization last .
Key words : S w erti a bi m acul at a (Sieb. et Zucc. ) Hook. f . et Thoms. ex C. B. Clarke ; callus ; adventi2
tious bud ; rooting ; tissue cult ure
  獐牙菜 S w erti a bi m acul at a Sieb. et Zucc. ,又
名大苦草、黑节苦草、黑药黄、走胆草、紫花青叶胆、
蓑衣草、双点獐牙菜 ,为龙胆科 ( Gentianaceae ) 獐牙
菜属多枝组 ( Sect . O p hel i a) 腺斑系 ( S er. M acul t ae
T. N. Ho et S. W. Liu) 植物 ,其性寒、味苦 ,有清
热解毒、利胆健胃及杀虫的功效 ,是我国的一种传统
药材 ,主要分布于湖南、云南、贵州、西藏、湖北、四川
等地[ 1 ] 。据调查 ,本属植物 ,很多种类在中国、日本、
印度及尼泊尔等国己有较长用药历史 ,是当地著名
的民族、民间传统药物 ;全草入药 ,主要用于治疗肝、
胆、胃等消化系统疾病。近年来发现本属一些种类
在抗病毒、降血糖、缓解胃溃疡、治疗肝炎及脱发等
方面显示出较强的生物活性 ,其药用价值日益受到
人们的重视[2 ] 。獐牙菜在湖南民间被广泛用于治疗
黄疸型肝炎、肺炎、扁桃体炎及妇科炎症等。然而 ,
由于滥采过度 ,加之生境破坏 ,其野生资源剧减。因
此 ,对獐牙菜进行人工繁殖及栽培研究是解决保护
和利用之间矛盾的一个关键。
1  材料和方法
111  材料 :供试材料为野生的獐牙菜种子 (凭证标
本 :龙华 177 ,存于吉首大学资源与环境科学学院生
物系标本室 ;标本鉴定人 :吉首大学生物资源与环境
科学学院张代贵) ,于 2005 年 10 月采收于湖南省湘
西自治州龙山县大安乡万宝山林场〔E : 109°38′,N :
29°46′,At : (1 39612 ±11) m〕,将采集的野生成熟
种子经无菌处理 ,然后接种于诱导培养基上 ,待其长
成小苗后分别取其不带芽茎段、叶和带芽茎段作为
外植体。
112  方法 :将野生的獐牙菜种子按下列程序进行消
毒 ,种子装入一小纱布袋中 →5 %洗衣粉水溶液漂洗
5 min →自来水冲洗 3 min →011 %升汞溶液中消毒
2 min →无菌水冲洗 4~6 次 ,然后在无菌工作台中
将种子接种于诱导培养基上 ,待其长成小苗 (图 12
1、2)后分别取其不带芽茎段、叶和带芽茎段作为外
植体 ,接种于初代培养基上 ,将培养出来的愈伤组织
切成小块 ,接种于增殖培养基上 ;最后将形成不定芽
的块段移至生根培养基上 ,以培养出完整的小植株。
以 7 d 为一周期。记录不同处理的生长状况。
整个实验设 3 次重复 ,时间从 2005 年 10 月至翌年
6 月结束。
113  培养基 :基本培养基为 MS ,附加不同浓度的
2 , 42D (2 ,42二氯苯氧乙酸) 、BA (62苄基腺嘌呤) 、
IBA (吲哚丁酸 ) 。蔗糖 3 % , 琼脂 016 % , 用 011
mol/ L NaO H 和 011 mol/ L HCl 调节 p H 值为
518~610 ,在高压灭菌锅中 (121 ℃)灭菌 20 min。
114  培养条件及统计方法 :培养室温度控制在
(22 士 l) ℃,光照度 27~36μmol/ (m2 ·s) ,光照时
间 12 h/ d。
每隔 10 d 记录不同处理的生长状况。
出愈率 = 产生愈伤组织的外植体数/ 外植体总数 ×
100 %
不定芽的分化率 = 分化不定芽的外植体数/ 接种外植体
总数 ×100 %
根的分化率 = 分化不定根的材料数/ 接种材料总数 ×
100 %
2  结果与分析
211  外植体及诱导培养基选择 :獐牙菜的 3 种外植
体 ,叶、不带芽茎段和带芽茎段形成愈伤组织的能力
不一样。经多种植物激素组合试验结果表明 :诱导
愈伤组织的外植体以不带芽茎段为最好 ,带芽茎段
次之 ,而叶形成愈伤组织的能力最差 ,虽经改变多种
激素组合来调节叶愈伤组织的出愈率 ,仍只有少数
激素组合诱导出愈伤组织。
将獐牙菜的不带芽茎段外植体接种在含有不同
激素及其质量浓度的培养基上 ,30 d 后均能诱导出
愈伤组织 ,但愈伤组织的诱导率和生长量却有较大
差异 (表 1) 。从表 1 可以看出 ,适中浓度的BA 对愈
伤组织的诱导较为适宜。
  从表 1 中可以看出 ,在不附加任何激素的 MS
基本培养基上 (空白对照) 难以诱导出愈伤组织 ,而
在附加了 IBA、2 ,42D 及BA 各种配比的 MS 培养基
中均可产生愈伤组织 ,但差异显著。在附加 IBA 或
2 ,42D 各种配比的 MS 培养基上 ,愈伤组织的诱导
效果均不理想 ;而在附加 BA 的 MS 培养基上 ,愈伤
组织的诱导效果则十分理想 ,其中质量浓度为 015
·364·中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs  第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月
 表 1  不同植物激素及质量浓度对不带芽茎段培养的影响1)
Table 1  Effect of different phytohormones and its
concentration on culture of tender stems
植物激素ρ/ (mg·L - 1) 培养数 愈伤组织数 出愈率/ % 生长量2)
空白试验 - 21 0 0 -
IBA 0. 1 15 2 13. 33 +
0. 5 17 3 17. 65 +
1. 0 20 4 20. 00 +
1. 5 19 1 5. 26 -
2. 0 16 0 0. 00 -
2 ,42D 0. 1 14 3 21. 43 +
0. 5 17 3 17. 65 +
1. 0 13 2 15. 38 +
1. 5 16 1 6. 25 -
2. 0 15 1 6. 67
BA 0. 1 16 13 81. 25 + +
0. 5 17 16 94. 12 + +
1. 0 17 14 82. 35 + +
2. 0 16 11 68. 75 +
3. 0 14 9 64. 29 +
  1)污染数除外 ,下表同  2) - 无 ; + 生长量小 ,生长势不明显 ,
+ + 生长量较大 ,生长势明显
1) excepting numbers of pollution ; 2) - nonexistence ; + a few
and growt h potential is not obvious , + + many and growt h potential
is obvious
mg/ L 效果最好 ,诱导率高达 94112 % ,在此培养基
上培养 10 d 后其基部切面膨大 ,13 d 后可见白色及
浅绿色的愈伤组织 ,20 d 后产生的愈伤组织不仅密
度大而致密 ,且有大量绿色芽点产生 (图 123) ;30 d
后已有明显的不定芽产生 ,其生长量和生长势均较
好 (图 124) ,45 d 后不定芽继续生长 ,叶片展开 ,显
示出良好的生长势 (图 125) ,这十分有利于下一步
的增殖培养。
从表 1 中 ,还可看出不同培养基上的死亡数相
差不大 ,说明培养基中激素质量浓度的差异对外植
体死亡率的影响不大 ,死亡的材料可能是由于消毒
过度或取材时操作不当造成的。
212  不定芽的增殖 :将外植体诱导出的愈伤组织接
种于不同激素配比的 MS 培养基上培养 ,接种后置
于 (25 士 1) ℃散射光下培养 ,30 d 后统计不定芽及
不定根的诱导率 ,结果见表 2。
  从表 2 中可以看出 ,不同激素质量浓度配比对
不定芽增殖的影响较大。在仅附加 BA 的培养基
上 ,不定芽的增殖系数低 ,表明仅有细胞分裂素 BA
对獐牙菜不定芽的增殖培养是不够的 ;在 BA 和
IBA 各种不同质量浓度的组合中 ,当 BA 一定 (015
  表 2  不同激素组合对愈伤组织幼苗分化的影响
Table 2  Effect of different phytohormone compositions
on seedling of callus
激素组合/ ( mg ·L - 1)
BA IBA
不定芽的分化率
/ %
不定根的分化率
/ %
0. 5 0. 0 61. 2 0. 0
0. 5 0. 1 95. 5 0. 0
0. 5 0. 5 84. 6 6. 4
0. 5 1. 0 71. 9 22. 3
0. 5 2. 0 34. 3 21. 6
0. 1 0. 1 71. 6 1. 7
0. 5 0. 1 93. 8 1. 2
1. 0 0. 1 75. 6 6. 5
2. 0 0. 1 60. 9 9. 8
mg/ L)时 ,不定芽的分化率随着 IBA 质量浓度的升
高而降低 ,当 IBA 质量浓度超过 015 mg/ L 时 ,不定
根的分化就比较明显 ;当 IBA 质量浓度较低时 (011
mg/ L) ,在一定范围内 ,不定芽的分化率随着 BA 质
量浓度的升高而升高。对獐牙菜不定芽的增殖来
说 ,较适宜的激素组合为 BA 015 mg/ L + IBA 011
mg/ L ,将诱导培养基中诱导出的不定芽接种在此组
合的培养基上培养 ,30 d 后可以看出不定芽生长量
和增殖率均较大 ,而较少产生不定根 (图 126) ,这时
将不定芽切分成单芽后继续培养 ,可使试管苗在短
期内快速增殖 ,从而获得大量的獐牙菜组培苗。从
表 2 中可以看出 ,对于獐牙菜不定芽诱导的最佳激
素组合为 BA 015 mg/ L + IBA 011 mg/ L ,在这种
组合的培养基中 ,生长量和增殖率均大 ,而较少产生
不定根 ,这十分有利于继代培养。
213  生根培养和移栽 :将诱导发生的不定芽接种于
不同 NAA 质量浓度的 1/ 2MS 培养基上 ,得到了较
适宜的生根培养基配方 :1/ 2MS + NAA 015 mg/ L
(表 3) 。生根苗生长情况见图 1 (图 127) 。
表 3  不同 NAA质量浓度对根系分化的影响
Table 3  Effect of different NAA concentration
on differentiation of rooting
NAA/ (mg·L - 1) 培养数 根系分化 生根率/ % 生长量
0. 1 20 15 75. 00 + +
0. 5 19 18 94. 74 + + +
1. 0 19 16 84. 21 + + +
1. 5 20 14 70. 00 + +
2. 0 18 11 61. 11 +
  当不定芽长够一定量时 ,将长至 3~4 cm 的丛
芽切成单芽转至生根培养基中。25~30 d 后 ,苗壮
根粗时 ,将瓶盖打开 ,置于自然光下 24 h ,然后取出
·464· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs  第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月
生根苗 ,小心洗尽残余培养基后移栽到经 011 %甲
醛消毒的细河沙中 ,保温保湿培养 25 d (温度 20~
25 ℃,湿度 70 %左右) ,再移入沙土中培养 (图 128) ,
待小苗长出 4~5 片新叶便可移栽至大田。
12MS 培养基上生长的种子苗 22种子苗进一步长大 32不带芽茎段培养 20 d 后 ,诱导的愈伤组织 4230 d 后由愈伤组织分化出的不定芽
5245 d 后不定芽的生长情况 62增殖培养 30 d 后的生长情况 72生根苗的生长情况 82过渡苗
12growt h of seedling on MS  22grown seedling  32calli f rom stem wit hout buds after 20 d  42adventitious buds differentiated f rom calli after 30 d
52growt h of adventitious buds after 45 d  62growt h of multiplication culture after 30 days  72growt h of rooting shoot s  82t ransition shoot
图 1  獐芽菜的组织培养
Fig. 1  Tissue culture of S. bimaculata
3  讨论
选择外植体对植物组织培养十分重要。不同基
因型、不同年龄、不同生理状态的外植体对培养的反
应不同 ,这或多或少地会影响到实验结果。试验中
采用种子苗的带芽茎段、不带芽茎段、叶片作为外植
体 ,有效地减少了因不同基因型、不同年龄及不同生
理状态的外植体对培养的反应不同。再者 ,控制污
染是组织培养的首要技术。影响污染的因素主要有
两方面 :一是外植体自身带菌。另一方面是组培工
艺过程中的各个环节操作不适宜或不严格的带菌 ,
在理论上 ,这类污染可以通过严格的操作而控制在
可以接受的范围内 ,而对第一种类型的污染 ,往往是
通过对外植体的前处理、选取及表面灭菌。本试验
中采用獐牙菜种子萌发的幼苗作为外植体的来源 ,
由于所采獐牙菜种子被其果皮包裹 ,因而有效地避
免了因大气、雨水、飞尘中种种污染源造成的外植体
带菌。
植物内源激素是植物体内天然存在的有机化合
物 ,虽然量很低 ,但它们与植物生长发育密切相关 ,
影响植物生命活动的整个过程。在植物愈伤组织培
养中 ,外源激素起着传递遗传物质的脱分化、再分化
等发育信号的作用 ,而外源激素的作用效果与外植
体以及愈伤组织本身内源激素的种类和水平有密切
关系 ,外源激素必须通过内源激素才能发挥其作
用[3 ] 。只有将各种外源激素合理使用 ,才能适应外
植体对激素的特定要求 ,充分发挥激素的调节作用 ,
诱导愈伤组织的产生并达到分化。本试验研究结果
表明 ,愈伤组织的诱导不仅在于外植体的来源 ,而且
培养基中植物生长调节剂的成分及质量浓度也极为
重要。在受试的 3 种外植体中不带芽茎段的出愈率
最高 ,而带芽茎段及叶片的诱导效果均不理想 ,这与
大多数龙胆科植物组织培养所采用的外植体不
同[4~7 ] ,推测是由于所采用外植体的来源不同所致。
在所用的不同种类激素及配比的 MS 培养基中 ,较
适宜的初代培养基为 MS + BA 015 mg/ L + 310 %
蔗糖。
植物愈伤组织的诱导、增殖及形态建成主要受
外植体本身、培养基和培养环境 3 大因素的调控[8 ] 。
植物生长调节剂对愈伤组织的诱导及分化具有十分
复杂而重要的影响 ,在植物形态建成过程中 ,起主要
作用的是培养基中生长调节剂组合的配比[9 ] 。Sk2
oog 和 Miller [10 ] 提出了“激素平衡”学说 :较高浓度
的生长素有利于根的形成 ,而抑制芽的形成 ;较高浓
度的细胞分裂素促进芽的形成 ,而抑制根的形成。
本试验主要使用植物激素为细胞分裂素 BA ,生长
素 IBA ,在供试的各种组合中出不定芽的诱导率均
较高 ,而在 MS + BA 015mg/ L + IBA 011 mg/ L +
310 %蔗糖培养基上出愈率最高 ,同时不定根的分化
率很低。
大量的研究表明 ,NAA、BA 对植物组织培养
瓶苗生根均有一定的促进作用。在本实验中较高水
平的 NAA 对生根均有一定的抑制作用 ,幼苗生根
培养基以 1/ 2MS 添加 NAA015 mg/ L 较好 ,其原因
一方面可能是材料品种不同 ,另一方面可能是前期
培养阶段所用培养基的激素种类及水平不同 ,导致
培养产物的内源激素在质和量上有差异 ,从而表现
·564·中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs  第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月
出对生根的影响。
本研究为獐牙菜的无性繁殖提供了一种方法 ,
有助于短期内提供大量的试管苗 ,通过人工栽培扩
大资源 ,确保獐牙菜资源的保持和可持续利用。
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遮荫对南五味子光合特性的影响
钟泰林1 ,李根有2 3 ,石柏林1
(1. 浙江林学院植物园 ,浙江 临安  311300 ; 2. 浙江林学院林业与生物技术学院 ,浙江 临安  311300)
摘  要 :目的  研究南五味子 Kadsura j aponica 栽培中的耐荫能力。方法  对南五味子进行不同遮荫处理 ,利用
7230 G分光光度计测定叶片的叶绿素量 ;利用 Li26400 光合测定仪测其气体交换数据 ;利用 PAM22100 脉冲调制荧
光仪测定叶片的叶绿素荧光参数。结果  随着遮荫强度的增加 ,叶绿素总量、光饱和点 (L S P) 、净光合速率 ( Pn) 迅
速上升而后又降低 ,在 70 %遮荫处理时达最大值 ,分别为 (21013 ±01263) mg/ dm2 , (749 ±10184) μ mol/ ( m2 ·
s) , (7126 ±0115) μ mol/ (m2 ·s) ;光补偿点 (L C P)表现为先降低后升高趋势 ,在 70 %遮荫处理时最小 ,为 (4192 ±
0120) μ mol/ (m2 ·s) 。开放系统 Ⅱ( PS Ⅱ)反应中心光化学效率 FV / Fm 总体变化不显著 ,光电子产额 ( Yiel d) 、电
子传递速率 ( E T R) 、叶绿素荧光的光化学猝灭 ( q P) 和叶绿素荧光的非光化学猝灭 ( qN) 则是先上升后降低 ,与 Pn
变化一致 ,均在 70 %遮荫处理时达峰值 ,分别为 01761 ±01027、(31583 ±01674) μ mol/ (m2 ·s) 、01990 ±01011、
01892 ±01030。结论  适度遮荫有利于南五味子生长 ,这主要是适度遮荫条件下更有利于各种酶活性的激发。
关键词 :南五味子 ;遮荫 ;光合作用 ;叶绿素荧光
中图分类号 :R28611    文献标识码 :A    文章编号 :025322670 (2009) 0320466204
  南五味子 Kadsura j a ponica (Linn. ) Dunal 又
名华东五味子 ,为木兰科 ( Magnoliaceae) 南五味子
属 ( Kadsura J uss. ) 常绿木质藤本 ,叶薄革质翠绿 ,
花淡黄色、芳香 ,聚合浆果在秋冬季呈现深红色至暗
紫色。分布于江苏、安徽等长江流域以南各省区 ,日
本、朝鲜等东南亚区域也有分布 ,生于海拔 200~
2 000 m 以下的丘陵、山地溪边林中或灌丛中。其
根、茎、叶、种子均可入药 ,在民间广泛用于疼痛诸
症。根祛风活血、散瘀止痛 ,主治风湿性关节炎、跌
打、胃痛、经痛、疝气等 ;茎又称风藤、紫金皮等 ,主要
用于活血止痛、祛风除湿等 ;叶可治刀伤和痈疽背
疮 ;种子为滋补强壮剂和镇咳药 ,可治疗神经衰弱、
肾虚腰痛、支气管炎等症 ;果实含有丰富的 VC、V E
及多种微量元素 ;因此南五味子是一种优良的中药
材 ,同时也是一种野生水果。然而 ,国内外学者却更
多地集中研究同科别属 ———五味子属 ( S chisand ra
Michx. )的五味子 S . chi nensis ( Turcz. ) Baill . 和
华中五味子 S . s p henant hera Rehd. et Wils. ,它们
作为一种重要的中药材 ,目前无论其药性还是栽培
繁殖均研究较深入[ 1 ] 。为充分开发利用野生药物资
源 ,20 世纪 80 年代以来 ,国内外学者对南五味子属
植物的化学成分和药理作用进行了系统分析研究 ,
取得了一定进展[ 2 ,3 ] 。南五味子化学成分主要有挥
发油、木脂素类、三萜类、多糖、有机酸等 ,其中南五
·664· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs  第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月
3 收稿日期 :2008205222   
基金项目 :浙江省重大科技攻关项目 (2006C1205922) ;浙江省教育厅科技项目 (20050189)
作者简介 :钟泰林 (1974 —) ,男 ,江西兴国人 ,硕士、工程师 ,主要从事植物资源应用研究 ,已发表论文 10 余篇。
Tel : (0571) 63740033  E2mail : tailin @zjfc. edu. cn3 通讯作者 李根有 E2mail : ligy1956 @163. com