全 文 ：氢钾、乙腈21 %磷酸、乙腈20102 mol/ L 磷酸二氢钾
作为流动相进行试验 ,结果表明以乙腈20102 mol/ L
磷酸二氢钾线性梯度洗脱为最佳 ,谱图上各色谱峰
(230 nm) 分离度较好 ,保留时间适中 ,峰形好。因
此选此洗脱系统作为痛安注射液的 HPL C 指纹图
谱检测的流动相。
312 　检测波长的选择 :按照前述色谱条件 ,精密吸
取供试品溶液进样 ,得 200～400 nm 波长 DAD 扫
描图谱 ,结果在 230 nm 测定的信息量多 ,特征最为
明显 ,图谱中的各指纹峰信号强 ,分离效果较好。因
此选用该波长作为检测波长。
313 　色谱柱的选择 : 选用大连依利特 Hypersil
ODS2 色谱柱 (250 mm ×416 mm , 5μm) 、兰州化物
所 ODS 色谱柱 (250 mm ×416 mm , 5μm) 、Dikma
公司 Diamonsil C18柱 (250 mm ×416 mm , 5μm)进
行试验筛选 ,比较分离度和柱效 ,结果 Dikma 公司
Diamonsil C18较为合适。
本实验采用 HPL C 法所建立的痛安注射液指
纹图谱可以在一个色谱条件下 ,同时实现整体定性、
多指标成分定量的功能 ,为复方中药的质量控制及
稳定性评价提供了新的方法模式。
改良 SDS 法快速提取赤芍干叶片 D NA的研究
徐 　芳1 ,2 ,王丽萍3 ,陈 　波1 3 ,姚守拙1
(1. 湖南师范大学 化学生物学及中药分析省部共建教育部重点实验室 ,湖南 长沙 　410081 ; 2. 长沙医学院 ,
湖南 长沙 　410219 ; 3. 湖南省分析测试中心 ,湖南 长沙 　410007)
摘 　要 :目的 　从富含多糖和小分子杂质的赤芍干叶片中快速分离出适用于各生物技术分析的高质量基因组
DNA ,为赤芍的鉴定研究提供实验基础。方法 　以常规的 SDS 法为基础 ,进一步优化 DNA 提取各步骤 ,获得了一
种快速可行的提取高质量赤芍干叶片 DNA 的方法。结果 　使用该方法从 4 个不同产地的赤芍干叶片中分离的
DNA A 260/ A280分别为 1190、1188、1191、1193 ,所需时间均小于 215 h ,所得 DNA 分别直接用于 PCR 分析 ,结果满
意。结论 　该方法用于提取赤芍干叶片 DNA 快速可行 ,可有效地从富含多糖和小分子杂质的组织中分离出高质
量 DNA ,方法简便、快速 ,成本低。
关键词 :赤芍 ;DNA 提取 ;改良 SDS 法 ; PCR
中图分类号 :R284. 2 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0420571203
　　中药现代化生产的基本要求是中药材来源纯
正、地道 ,快速、准确地鉴别中药原植物及药材是中
药生产标准化的关键。随着分子生物学技术运用于
中药材鉴定研究的发展 ,DNA 分子标记技术已成为
中药材鉴定中极其重要的鉴定方法之一[1 ,2 ] 。袁菊
红等[ 3 ] 采用 RA PD 分析法分别对不同采集地的 37
份石蒜属植物的基因组 DNA 的遗传多样性进行检
测 ;张杰等[ 4 ]对半夏栽培品遗传差异进行 A FL P 分
析 ;陈大霞等[5 ] 对黄连药材 DNA 进行提取并对
RA PD 反应体系的优化。高质量植物组织 DNA 的
提取是整个鉴定实验成功的基本保证。植物 DNA
的提取研究中 ,多采用新鲜或冷冻的材料 ,但对于野
外 ,特别是远距离采样时受条件限制 ,植物材料只能
以干燥方式保存 ,其 DNA 提取方法虽然与新鲜材
料相近 ,但提取的条件差别较大 ,因此本实验寻找一
种从干燥植物药材中快速提取完整、高质量 DNA
的方法具有重要意义。
赤芍为毛茛科植物芍药 Paeoni a l acti f lora
Pall . 的干燥根 ,具有清热凉血 ,活血散瘀的功能 ,还
具有镇静、镇痛、解痉、抗炎等作用[6 ] 。赤芍为野生 ,
但不同产地野生赤芍的成分存在很大差异 ,因此有
必要对赤芍野生资源品种进行分类、鉴定和良种选
择。本实验通过对 DNA 提取各步骤的优化 ,获得
了一种快速的赤芍干叶片完整、高质量 DNA 的提
取方法 ,并应用于 4 个产地赤芍 DNA 的比较 ,为毛
茛科植物 DNA 分子标记技术研究提供参考。
1 　材料
赤芍干叶片分别采自内蒙古自治区额尔古纳
·175·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
3 收稿日期 :2008206211　　　
基金项目 :国家 973 课题 (2006CB504701)
作者简介 :徐　芳 (1981 —) ,女 ,湖南常宁人 ,硕士研究生 ,研究方向 :现代色谱分离分析。E2mail : xufang6789 @163. com3 通讯作者　陈　波　Tel : (0731) 8865515 　E2mail :dr2chenpo @vip . sina. com
县、黑龙江省呼玛县、吉林省延吉县、山西省汾阳县 ,
由湖南师范大学生命科学院刘林翰教授鉴定为毛茛
科植物赤芍 P. l acti f lora Pall . ,经硅胶干燥后 ,室
温下保存 2～3 个月 ,洗净凉干直接用于提取 DNA。
SDS、PV P、β2巯基乙醇、Tris 购自长沙市天恒
科技有限公司 ; 5 U/μL Taq DNA 聚合酶、5
mmol/ L MgCl2 、10 × PCR Buffer、10 mmol/ L
dN TP 购自上海生工生物工程公司 ; D GL 2000
DNA Marker、DL 2000 PCR Marker、溴化乙锭
( EB ) 购自宝泰克生物科技有限公司 ; 琼脂糖
(agrose)购自 Gene 公司 ;其他试剂均为分析纯。
Hybrid 基因扩增仪 (英国 Hybrid 公司) , Gra2
dient Cycler P TC —200 基因扩增仪 (美国 M. J . Re2
search 公司) ,D YY—Ⅲ型电泳仪、电泳槽 (北京六
一仪器厂) 。
2 　方法与结果
211 　DNA 提取方法 :以常规 SDS 法为基础 ,经优
化各提取步骤 ,得到改良 SDS 法。(1) 在 50 mL 离
心管中 ,加入 15 mL 提取缓冲液 (100 mmol/ L Tris2
HCl , p H 810 ; 50 mmol/ L ED TA p H 810 ; 500
mmol/ L NaCl ; 2 % 巯基乙醇 ) 和 1 mL 0115 %
mg/ mL SDS ,混匀 ,于 65 ℃预热。(2) 称取去除中
脉的赤芍干叶片 1 g ,加入 0135 g PV P 干粉 ,置液氮
中迅速研磨成粉状。(3) 将冻粉迅速转入上述离心
管中 ,混匀 ,65 ℃保温 25 min ,其间摇动 2 次。(4) 4
℃条件下 ,10 000 r/ min 离心 3 min 后 ,将上部溶液
倒入另一离心管 ,向离心管中加入 5 mol/ L 乙酸钾
5 mL ,混匀 ,置冰浴中 20 min。( 5) 4 ℃条件下 ,
10 000 r/ min 离心 5 min ,上清液转入另一离心管
中 ,加入 5 mL 氯仿2异戊醇 ,轻轻颠倒离心管 ,混匀 ,
静置 10 min 分层。(6)取上清液重复加入 5 mL 氯
仿2异戊醇 ,轻轻颠倒离心管 ,混匀 ,静置 10 min 分
层。(7)取上清液 ,加入 2/ 3 上清液体积的预冷异丙
醇 ,轻轻颠倒离心管 ,混匀 ,静置 5 min 至出现絮状
物。(8)迅速用干净玻棒轻轻挑出沉淀 ,用 75 %乙
醇洗沉淀物 3 次后 ,用氮气吹干。(9) 溶于适量的
TE 缓冲液中 ,4 ℃贮存备用。
212 　DNA 的鉴定方法
21211 　紫外检测 :将所提取 DNA 分别稀释 100
倍 ,测定 230、260、280 nm 处的吸光度 ( A 值) 。根
据 A 260 / A 280和 A 260 / A 230分别判断 DNA 的纯度。每
个样品测定 3 次 ,取其平均值。
21212 　电泳检测 :分别取 2μL DNA 于 018 %的琼
脂糖凝胶中 ,4 V/ cm 稳压电泳 2～215 h 后 , EB 染
色 40 min ,用水冲净后 ,用凝胶成像系统保存图像 ,
分别判别 DNA 分子的大小和纯度。
21213 　PCR 扩增 :25μL 反应体系组成为 215μL
10 ×PCR Buffer ,10 mmol/ L dN TP 015μL ,引物组
合 ( CSF : 5 ’ CGCCCCA GGT T T T T T TCT TCAA G
3’ ; CSR : 5’ T GCT GAAA TAA GAAA GGCCAA T2
GA 3’) (50 ng/μL ) 1μL , 25 mmol/ L MgCl2 115
μL , Taq DNA 聚合酶 1 单位 ,基因组 DNA 模板 1
μL (10～100 ng) ,加去离子水至 25μL 。上述反应
体系置于 Express Gradient PCR 仪上执行如下反
应程序 :94 ℃预变性 3 min ;94 ℃变性 30 s ;57 ℃退
火 30 s ,72 ℃延伸 30 s ,35 个循环 ; 72 ℃后延伸 5
min ;10 ℃保存产物。产物用 1 %琼脂糖凝胶电泳
检测 ,EB 染色后照相。
213 　结果与分析
21311 　不同产地的赤芍干叶片 DNA 提取结果比
较 :见表 1 和图 1。用本法所提取的 DNA ,不论是
哪个产地的材料 ,DNA 颜色、A 260 / A 280 和 A 260 / A 230
值都达到了要求 ( A 260 / A 280 值为 1175～1195 , A 260 /
A 230值应大于 210 [7 ] ) ,说明所提取的 DNA 杂质去
除较干净 ,且提取所需时间短 ( < 215 h) ,比其他方
法快速。电泳结果显示 :4 个产地的赤芍干叶片提
取的 DNA ,条带都较清晰 ,几乎没有降解 ,说明该方
法提取的 DNA 完整、无杂质污染。
表 1 　不同产地的赤芍干叶片 DNA提取比较结果
Table 1 　Comparison of DNA extracted from dry leaves of Radix
Paeoniae Rubra in four different habitats
编号 来源地 DNA 颜色 A 260/ A 280 A 260/ A 230 所需时间/ h
1 内蒙古额尔古纳县 浅黄色 1. 90 2. 14 < 2. 5
2 黑龙江呼玛县 浅黄色 1. 88 2. 07 < 2. 5
3 吉林延吉县 浅黄色 1. 91 2. 22 < 2. 5
4 山西汾阳县 浅黄色 1. 93 2. 19 < 2. 5
图 1 　4 个产地赤芍干叶片提取的总 DNA电泳结果
Fig. 1 　Electrophoretogram of total DNA extracted
from dry leaves of Radix Paeoniae Rubra
in four different habitats
21312 　不同产地赤芍干叶片提取 DNA 的 PCR 扩
增结果 :见图 2。可见不同产地赤芍干叶片用本研
·275· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
　图 2 　4 个产地赤芍干叶片提取 DNA的 PCR扩增电泳谱图
Fig. 2 　Electrophoretogram of DNA extracted from dry
leaves of Radix Paeoniae Rubra in four different
habitats by PCR amplif ication
究方法提取的 DNA 做 PCR 扩增时 ,结果都较清
晰 ,稳定效果好 ,说明该方法提取的 DNA 能用于
PCR 等生物技术 ,适用于毛茛科植物的遗传多样性
分析。
3 　讨论
高质量 DNA 的快速提取是决定分子生物学实
验成败的关键因素。由于不同植物所含化学成分差
异较大 ,因此对不同植物 DNA 提取应采取不同的
方法。有时受条件限制 ,植物材料只能以干燥方式
保存 ,其提取方法又应不同。由于要对不同产地的
赤芍作比较 ,赤芍叶片只能以干燥方式保存 ,且因其
含较多多糖、蛋白质和小分子杂质 ,常规方法不能很
好地将杂质去除干净 ,影响后续的分子生物学实验
结果。因此本研究在常规 SDS 法基础上 ,优化各提
取步骤 ,获得了一种快速提取赤芍干叶片 DNA 的
方法。用该方法所提取的 DNA 完全能够达到分子
生物学实验要求 ,应用于 PCR 分析 ,结果满意。说
明如果受野外采集条件限制 ,用硅胶干燥叶片保存
后带回实验室再提取也不失为一种补充手段 ,但硅
胶干燥叶片不宜久存 ,否则 DNA 得率会降低。本
方法的一大特点就是快速 ,因为提取时间越长 ,
DNA 越易受环境污染 ,快速有利于提高纯度。结果
表明 :该方法可快速地从富含多糖、蛋白质和小分子
杂质的毛茛科药用植物干叶片中分离出高质量的
DNA。
使用此方法时应注意 : PV P 以固体形式加入最
好 ,PV P 与样品在液氮环境中共研要迅速和充分 ,
磨碎后要尽快加入预热的提取缓冲液 ,以防止氧化 ;
高浓度 SDS 可去除多糖 ,改良方法中提高了 SDS 浓
度 ,多糖去除较干净 ;离心速度不宜太快 ,时间和次
数也要尽量减少 ,以保证 DNA 的完整性 ; 沉淀
DNA 不采用离心 ,而采用玻棒直接挑出也有利于提
高 DNA 纯度 ;沉淀时间也要尽量缩短以防小分子
盐共沉淀和 DNA 颜色变深而影响提取结果 ;用乙
醇反复沉淀 3 次减少了 RNA 的污染 ;纯化后的
DNA 用氮气吹干以减少乙醇污染。
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2004.
吴茱萸多糖的分离和组成研究
徐继华1 ,2 ,刘文英1 3 ,屠旦来1
(1. 中国药科大学 药物分析教研室 ,江苏 南京 　210009 ; 2. 江苏省南通市药品检验所 ,江苏 南通 　226006)
摘 　要 :目的 　对吴茱萸中多糖进行提取、分离和纯化 ,进一步研究吴茱萸多糖主要组分的单糖组成。方法 　采用
水提醇沉法提取粗多糖 , H2 O2 脱色、Sevag 法除蛋白、透析制备精制品 ,用 DEA E232 纤维素阴离子交换柱、
Sephacryl S2400 SF 型凝胶柱分离纯化多糖 ,经酸水解后 ,12苯基232甲基252吡唑啉酮 ( PMP)柱前衍生化 HPLC 法分
析单糖组成。结果 　从吴茱萸中分离纯化得两个主要多糖组分 ERPS2a、ERPS3 ,二者的单糖组成均为甘露糖、鼠
·375·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
3 收稿日期 :2008207204　　　
作者简介 :徐继华 (1978 —) ,男 ,江苏南通人 ,硕士研究生。Tel : 13912274510 　E2mail :xujihua45 @hot mail . com3 通讯作者　刘文英　Tel : (025) 83271251 　E2mail :lwcpu @126. com