全 文 ：芍药苷在Caco-2 细胞模型中吸收机制的研究
宋　丽, 张　宁Ξ , 徐德生
(上海中医药大学, 上海 201203)
摘　要: 目的　研究芍药苷在Caco22 细胞模型中的吸收机制。方法　用Caco22 细胞单层模型研究芍药苷的双向转
运, 考察时间、药物质量浓度对芍药苷吸收的影响。采用高效液相色谱法检测芍药苷质量浓度, 计算其表观渗透系
数 (P app )。结果　芍药苷在Caco22 细胞模型中, 从单层细胞层顶端到基底端的转运与基底端到顶端的转运大致相
同; 随着芍药苷质量浓度的增加, 顶端到基底端方向的吸收量近似线性增加, 基底端到顶端方向的分泌量近似线性
增加。结论　芍药苷在Caco22 细胞模型中吸收主要是被动转运。
关键词: 芍药苷; Caco22 细胞模型; 吸收; 转运
中图分类号: R 28611　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 025322670 (2008) 0120041204
Absorption m echan ism of paeon if lor in across Caco-2 m onolayer m odel
SON G L i, ZHAN G N ing, XU D e2sheng
(ShanghaiU niversity of T radit ional Ch inese M edicine, Shanghai 201203, Ch ina)
Abstract: Objective　To research the ab so rp t ion m echan ism of paeon if lo rin acro ss Caco22 mono layer
model1 M ethods　D epending on the Caco22 cell mono layers drug tran spo rt model to study the doub le
t ran spo rt m echan ism of paeon if lo rin1 To exp lo re the effect of paeon if lo rin ab so rp t ion by t im e and drug
concen tra t ion, the drug concen tra t ion w as determ ined th rough the u se of H PL C in strum en t and the P app
w as calca la tad1 Results　 In the Caco22 mono layer model, the tran spo rt of paeon if lo rin fo rm A p ical (A P)
to Baso la tera l (BL ) is sim ilar to the tran spo rt fo rm BL to A P1 Conclusion　T he m ain m echan ism of the
paeon if lo rin in test ina l ab so rp t ion in the Caco22 mono layer model is passive tran sference1
Key words: paeon if lo rin; Caco22 cell model; in test ina l ab so rp t ion; t ran spo rt
　　白芍为毛茛科植物芍药的干燥根, 具有益气、养
血、止痹、通络的作用。芍药苷是白芍中的主要成分,
在临床上用于治疗类风湿性关节炎、肝炎、老年性疾
病等[1 ]。目前药物肠吸收的研究方法被广泛采用的有
3 种: 大鼠原位单次灌注、大鼠外翻肠囊法和体外人
结肠腺癌 (hum an co lon carcinom a cell line, Caco2
2) 细胞系[2 ] , 其中Caco22 细胞系更适合高通量筛
选, 并已经成为一种预测药物在人体小肠吸收以及
药物转运机制研究的标准体外筛选工具[3 ]。Caco22
来源于人类结肠癌细胞, Caco22 细胞模型由于具有
体内肠上皮的许多形态和功能上的性质, 可作为研
究小肠表皮细胞药物转运和代谢的体外模型, 广泛
用于药物的吸收、分布、代谢、排泄以及毒性研
究[3, 4 ]。本实验建立Caco22 细胞模型用于研究芍药
苷在小肠中的转运机制, 通过H PL C 法测定转运前
后的药物吸收情况以阐述芍药苷的吸收机制, 以期
为含有芍药苷的中药复方吸收机制研究提供参考。
1　仪器及试剂
　　A gilien t 1100 系列高效液相色谱仪, H F safe
1500 生物安全柜 (上海力申科学仪器有限公司) , 跨
膜电阻仪和M illcellTM 膜 (M illipo re Co rpo ra t ion ) ,
B io2R ad M odel 550 酶标仪。
　　Caco22 细胞购于中国医学科学院基础医学细
胞中心; 芍药苷购于中国药品生物制品检定所 (批
号: 1107362200320, 定量测定用)。
　　DM EM 培养基 (D u lbecco’s M odified Eagle’s
m edium ) , Gibco cat1NO 128002058 lo t1NO 1313804
Invit rogen co rpo ra t ion; 非 必 需 氨 基 酸: ca t1NO
111402050 lo t NO 1316287; 胎牛血清 (FBS) ; 胰蛋
白酶: 1523B 70 Am resco; 甲醇为色谱纯 , 其他试剂
均由国药集团化学试剂有限公司提供。
2　方法与结果
211　Caco22 细胞模型的建立: Caco22 细胞在 37
℃, 含5% CO 2, 相对湿度为90% 培养箱中培养。采用
·14·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 1 期 2008 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2007205223
基金项目: 上海市教委资助项目 (T 0301)
作者简介: 宋　丽 (1981—) , 女, 硕士研究生, 研究方向为中药新技术及新剂型。T el: (021) 513223883 通讯作者　张　宁　T el: (021) 51322392　E2m ail: n ingzh18@ 1261com
DM EM 培养基, 培养基中含 10% FBS、1% 非必需氨
基酸、1% 丙酮酸钠、1% 谷氨酰胺和 1% 青2链霉素。
将细胞按 50 000 个öcm 2 接种到 24 孔板上, 培养 21
d [3 ]。经过验证, 细胞形成紧密的单层后即可用于实
验[5 ]。
212　细胞样品中芍药苷的H PL C 法测定
21211　色谱条件: 色谱柱为T hermo H ypersil2Key2
stone OD S C 18 (250 mm ×416 mm , 5 Λm ) ; 流动相:
甲醇2水 (30∶70) ; 体积流量: 1 mL öm in; 检测波长:
230 nm ; 柱温: 室温。
21212　线性关系的考察: 精密称取芍药苷对照品适
量, 用空白HBSS 溶液制成质量浓度分别为 01545、
1109、5145、2712、5415、109、218 ΛgömL 对照品溶
液, 分别精密吸取10 ΛL , 进样, 测定峰面积。以质量浓
度(X )对峰面积(Y )用加权最小二乘法进行回归计算,
得直线回归方程Y = 131195 87 X + 11156 508, R 2=
01999 9, 线性范围为01545～ 218 ΛgömL。
21213　检测限和定量限的测定: 按3 倍基线噪音计
算, 测得芍药苷检测限为015 ng。按10 倍极限噪音
计算, 测得芍药苷定量限为115 ng。
21214　方法专属性试验: 考察空白HBSS 对芍药苷
的检测是否有干扰。结果表明, 本色谱条件下, 空白
HBSS 对芍药苷的测定无干扰, 专属性良好。
21215　精密度试验: 取芍药苷对照品贮备液, 用空
白HBSS 配制成质量浓度为1109、2712、218 ΛgömL
的稀释液各 5 份, 于 1 d 内连续进行测定, 根据标准
曲线方程计算样品中芍药苷的质量浓度, 计算R SD
分别为2158%、0180%、0133%。连续4 d 取芍药苷对
照品贮备液用空白HBSS 配制成质量浓度为 1109、
2712、218 ΛgömL 稀释液各 5 份, 进行测定, 根据标
准曲线方程计算样品中芍药苷的质量浓度, 计算
R SD 分别为2126%、1117%、1149% (n= 20)。
21216　方法回收率试验: 配制芍药苷的低、中、高质
量浓度的HBSS 溶液, 分别进样测定峰面积, 计算药
物质量浓度, 以测得的质量浓度与实际质量浓度相
比较, 求得方法回收率, 见表1。
表 1　方法回收率试验 (n= 5)
Table 1　Test of recovery (n= 5)Θö(Λg·mL - 1) 回收率ö% RSD ö%
1109 99103±2155 2158
27125 104157±0183 0180
218 102169±0134 0133
213　芍药苷细胞毒性的研究
21311　溶液的配制: 精密称取芍药苷对照品适量,
用空白HBSS 溶液制成质量浓度分别为 0125、215、
25、250、2 500 ΛgömL 对照品溶液。精密称取M T T
用PBS 缓冲液配成质量浓度为 5 m gömL M T T 溶
液, 用时配制, 避光保存。
21312　M T T 法测定芍药苷的细胞毒活性: 于96 孔
板中每孔加入 100 ΛL 细胞悬液 (调细胞浓度至1×
106ömL ) , 置于 37 ℃, 5% CO 2 培养箱中培养24 h后
加芍药苷对照品溶液 50 ΛL , 每个实验组设 3 个复
孔, 空白 (无细胞, 不加药) 与阴性 (只有细胞, 不加
药)各3～ 5 孔。37 ℃, 5% CO 2 培养箱中培养48 h, 结
束培养前 4～ 5 h 每孔加入M T T 20 ΛL。培养结束
时, 加入溶解液DM SO (二甲基亚砜) 150 ΛL , 放置 6
～ 7 h, 用酶标仪于570 nm 处测定吸光度 (A )值。通
过对A 值的观察与分析来判断芍药苷对Caco22 细
胞的毒性, 结果见表2。可以看出, 芍药苷在0125～ 2
500 ΛgömL 时, A 值无突然下降的现象, 所以在此
质量浓度范围内给药, 对Caco22 细胞没有毒性。此
范围作为试验中给药质量浓度的参考范围。
表 2　芍药苷溶液的M TT 测定结果 (n= 3)
Table 2　Results of M TT for paeon if lor in solution (n= 3)Θö(Λg·mL - 1) A
芍药苷　0125 11254 0±01101 9
　　　　215 11138 2±01153 2
　　　　25 11254 2±01077 6
　　　　250 11271 2±01093 7
　　　　2 500 11299 1±01086 1
空白　　— 01239 2±01009 4
阴性　　— 01216 1±01004 2
214　芍药苷的转运试验
21411　芍药苷溶液的制备: 用HBSS 缓冲液配制25
～ 200 ΛgömL 芍药苷溶液, 经 0122 Λm 微孔滤膜滤
过除菌。
21412　试验装备的调试: 取符合转运条件且细胞生
长形态完好的M illicellTM 膜, 试验前用空白HBSS 等
渗溶液37 ℃培养20 m in, 培养结束后用HBSS 清洗3
遍, 洗去细胞单分子层表面的杂质。然后用跨膜电阻
仪测定跨膜电阻值, 以确定细胞单层的紧密性与完
整性。
21413　从A p ical (A P, 又称黏膜侧或肠腔侧) 侧到
Baso la tera l (BL , 又称浆膜侧或肠内壁侧)侧的转运:
将014 mL 芍药苷溶液加到A P 侧作为供给液, 同时
在BL 侧加入016 mL 空白HBSS 作为接收液。
21414　从BL 侧到A P 侧的转运: 将016 mL 芍药苷
溶液加到BL 侧作为供给液, 同时在A P 侧加入 014
mL 空白H ank s 平衡盐溶液作为接收液。
21415　试验结果: 将M illicellTM 膜置于 37 ℃、5%
CO 2 (相对湿度 90% ) 培养箱中, 分别在不同时间吸
·24· 中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 1 期 2008 年 1 月
取012 mL 接收液, 同时补加空白HBSS 012 mL。采
用H PL C 法测定样品中芍药苷的质量浓度, 计算表
观渗透系数 (P app ) 。
　　P app = (dQ öd t) ö(A ×C 0)
其中dQ öd t 为单位时间药物转运量 (Λgöm in) , A 为转运膜的
面积, 此时 A 为 1113 cm 2; C0 为芍药苷的初始质量浓度
(ΛgömL )
　　由于每次取样后都要补液, 对药物的通透产生
了稀释作用, 因而药物的累积吸收浓度 T R cum (Λgö
mL )进行公式校正。
　　T R cum = A n+ V S nV R ∑
n- 1
i= 0
A i
其中A n 为第 n 个样品通透量的测定值; V S n为第 n 个样品的
采样体积; V R 为接收池的体积。
　　芍药苷从A P 侧到BL 侧转运时芍药苷累积吸收
的结果见表3, 以芍药苷转运速率对质量浓度作图, 得
方程Y = 01366 6 X + 01989 0, R 2= 01999 0。
　　芍药苷从BL 侧到A P 侧转运时芍药苷累积吸
收结果见表 4, 以芍药苷转运速率与质量浓度作图,
得方程Y = 01363 6 X + 01475 3, R 2= 01999 3。P app
的计算结果和吸收率见表5。
表 3　AP 侧到BL 侧的累积吸收质量浓度 (n= 3)
Table 3　AP to BL cumulative tran sport concen tration
(n= 3)
芍药苷溶液ö(Λg·mL - 1) 2 h 内累积吸收ö(Λg·mL - 1)
25　 　　31497 4±01021 3
50　 81345 9±01275 2
100　 131968 7±01164 4
200　 281719 0±01218 6
表 4　BL 侧到AP 侧的累积吸收质量浓度 (n= 3)
Table 4　BL to AP cumulative tran sport concen tration
(n= 3)
芍药苷溶液ö(Λg·mL - 1) 2 h 内累积吸收ö(Λg·mL - 1)
25 41272 6±01099 6
50 91235 6±01140 3
100 171940 9±01032 3
200 381257 5±01059 6
　　可见芍药苷在25～ 200 ΛgömL A P→BL 的P app
在1×10- 6～ 1×10- 5 cm ös, 相当于人小肠中等吸收
表 5　芍药苷双向转运的Papp和吸收率 (n= 3)
Table 5　Papp and permeation of paeon if lor in at d ifferen t concen tration in Caco-2 cell by double d irection tran sport (n= 3)
芍药苷溶液ö
(Λg·mL - 1) P appö(1×10- 6cm·s- 1)A P→BL BL →A P 比率 A P→BL 吸收率ö% BL→A P 吸收率ö%
25 616±011 511±016 018 1312±013 1611±116
50 714±215 517±018 018 1510±411 1718±215
100 617±110 516±012 018 1315±212 1713±016
200 710±113 519±013 018 1318±310 1814±111
(20%～ 70% ) [6 ]。
　　在整个质量浓度范围内 (于漏槽条件下) , 由
BL →A P 测得的 P app 1, 经统计学处理发现各质量浓
度的P app 1 值并无显著性差异, 基本保持恒定; 由A P
→BL 测得的P app 2, 经统计学处理发现各质量浓度
的 P app 2 值并无显著性差异, 基本保持恒定; 二者的
比值 (P app 1öP app 2)为018, 小于115; 各方向不同质量
浓度的吸收率也基本恒定, 差异无显著性。表明被动
扩散为主要转运机制。
3　讨论
　　Caco22 细胞模型应用在药物吸收机制研究中
时, 若在整个质量浓度范围内 (于漏槽条件下) 测得
的 P app 值保持恒定, 则被动扩散为主要转运机制。
P app值可由BL →A P 测得 (P app 1) , 也可由A P→BL 方
向测得 (P app 2) , 若P app 1 与P app 2 相同也可确定被动
扩散为主要转运机制, 若P app 1öP app 2> 115 则提示可
能存在主动转运机制: P 2糖蛋白和多药耐药蛋白是
Caco22 细胞中两种主要的转运蛋白。两者均能发挥
外排泵作用, 能将细胞内的化合物逆浓度梯度运至
细胞外。
　　由于Caco22 细胞来源于结肠, 缺乏分泌黏液的
杯状细胞, 因而缺乏小肠上皮中的黏液层; 而且由于
缺乏肠道菌群代谢酶, Caco22 细胞模型也不能完全
模拟药物在小肠中的吸收过程。所以, 与整体动物实
验数据相结合, 研究芍药苷在体内的吸收过程从而为
新剂型的设计提供更完善的理论依据是有必要的。
　　Caco22 细胞模型作为药物吸收研究的体外模
型, 是一种快速的筛选工具, 可以阐明药物分子的转
运机制以及确定某些影响药物转运特性的结构特
征, 为药物的体外药物动力学提供了广阔的前景, 同
时也有助于改善药物的转运特性, 以便增加其吸收。
特别是在中国传统药物的研究方面, 由于大部分中
药的具体吸收成分和机制还未明确, 因此本实验建
立的Caco22 细胞模型在中药口服吸收研究方面具
有广泛的应用前景, 对中药现代化具有重要意义。
参考文献:
[ 1 ]　陈崇宏, 张　源, 陈光亮1 芍药甙药物动力学的研究 [J ]1 中
国药理学通报, 1990, 6 (5) : 29923021
[ 2 ]　林　晓, 徐德生, 冯　怡1 药物的肠吸收与处置研究进展[J ]1
·34·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 1 期 2008 年 1 月
中国临床药理学杂志, 2004, 20 (1) : 722751
[ 3 ]　牟永平, 吴　刚 , 周立社, 等1 Caco22 细胞模型在药物研究
中的应用 [J ]1 中国药理学通报, 2005, 21 (5) : 53625391
[ 4 ] 　M eunier V , Bourrie M , Berger Y1 T he hum an in testinal
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cok inetic app lications [J ]1 Cell B iol T ox icol, 1995, 11 (32
4) : 18721941 [5 ]　Gan L L , D h iren R T 1 A pp lications of the Caco22 model inthe design and developm ent of o rally active drugs: elucidationof b iochem ical and physical barriers po sed by the in testinalep ithelium [J ]1 A d v D rug D eliv R ev , 1997, 23 (1) : 771[ 6 ]　Yee S. In v itro perm eab ility acro ss Caco22 cells (clon ic) canp redict in v ivo ( sm all in testina1, abso rp tion in m anfact o rm yth [J ]. P harm R es, 1997, 14 (6) : 76327661
泡沫分离法分离重楼中重楼皂苷的工艺研究
兰　洁, 李　锐, 韩　丽, 杨　明Ξ , 王　瑾
(成都中医药大学药学院, 四川 成都　611130)
摘　要: 目的　研究泡沫分离法分离重楼皂苷的半间歇式操作工艺。方法　以富集比、回收率、纯度比为评价指标,
对操作方式、气流速度、进料浓度、pH 值、进料体积、温度进行单因素考察, 研究其对泡沫分离效果的影响。结果　
在气流速度为400 mL öm in, 进料质量浓度约为013 m gömL , pH 7, 液相高度维持在30 cm , 温度为40 ℃时, 重楼皂苷
泡沫分离的富集比为2517, 回收率为4211% , 泡沫液总皂苷纯度为4114% , 相比原料液纯度提高415 倍。结论　泡沫
分离技术可较好地用于重楼中皂苷的分离。
关键词: 重楼皂苷; 泡沫分离; 富集比; 回收率; 纯度比
中图分类号: R 28611　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 025322670 (2008) 0120044204
Separa tion of polyphyll in from R h izom a P a r id is by foam fractiona tion techn ique
LAN J ie, L I R u i, HAN L i, YAN G M ing, W AN G J in
(Schoo l of Pharm acy, Chengdu U niversity of T radit ional Ch inese M edicine, Chengdu 611130, Ch ina)
Abstract: Objective　To study the p rocess of foam fract ionat ion of po lyphyllin in sem i2batch mode1
M ethods　T ak ing en richm en t ra t io , recovery ra te of po lyphyllin, and pu rity ra t io as the perfo rm ance crite2
ria and u sing single exam in ing m ethod to exam ine the opera t ional param eters, i1e1 opera t ion mode, a ir
f low rate, in it ia l feed concen tra t ion, so lu t ion pH value, in it ia l feed heigh t and temperatu re on separa t ion
perfo rm ance1 T he op t im al condit ion s of the p rocess w ere ob ta ined finally1 Results　T he separa t ion perfo r2
m ance is good w hen gas flow rate is 400 mL öm in, in it ia l feed concen tra t ion (po lyphyllin’s con ten t) is 013
m gömL , pH value is 7, feed heigh t is 30 cm , and feed temperatu re is 40 ℃1 T he en richm en t ra t io is 2517,
recovery ra t io is 4211% , and the foam liqu id’s pu rity of to ta l po lyphyllin is 4114% , w h ich is 415 t im es
h igher than that in feed pu rity1 Conclusion 　Foam fract ionat ion techn ique cou ld be app lied to separa te
po lyphyllin1
Key words: po lyphyllin; foam fract ionat ion; en richm en t ra t io; recovery ra te; pu rity ra t io
　　重楼为百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干
燥根茎, 主要有效成分是甾体皂苷。甾体皂苷按苷元
的不同分为两类: 一类为薯蓣皂苷元 (d io sgen in) 的
糖苷, 另一类为偏诺皂苷元 (pennogen in) 的糖苷, 连
接的糖主要有D 2葡萄糖、L 2鼠李糖和L 2呋喃阿拉伯
糖3 种[1 ]。重楼皂苷具备了两亲性分子结构, 具有表
面活性, 其水提液轻微振摇即可产生丰富的泡沫。泡
沫分离技术是根据表面吸附原理, 基于溶液中溶质
(或颗粒) 间表面活性的差异, 表面活性强的物质优
先吸附于分散相与连续相的界面处, 通过鼓泡使溶
质选择性的聚集在气2液界面并借助浮力上升至溶
液主体上方形成泡沫层, 从而分离、浓缩溶质或净化
液相主体的过程[2 ]。中药中皂苷类成分具有亲水性
的糖体和疏水性的皂苷元, 是一种优良的天然表面
活性成分, 在强烈搅拌或沸腾时就能产生稳定的泡
沫, 并且泡沫反应也是鉴别中药皂苷类成分常用的
·44· 中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 1 期 2008 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2007202225
基金项目: 国家“十五”科技攻关重点项目 (2004BA 721A 43)
作者简介: 兰洁 (1982—) , 女, 四川崇州人, 在读硕士生, 研究方向: 中药新制剂和新剂型的研究。　E2m ail: jane b lue77@yahoo1com 1cn3 通讯作者　杨　明　T el: (028) 61800456　E2m ail: yangm ing16@ 1261com