全 文 ：华蟾蜍毒素在大鼠体内的组织分布研究
张 　磊1 ,张 　莉2 3 ,白 　雪2 ,齐 　刚2
(1. 武警医学院附属医院 药剂科 ,天津 　300162 ; 2. 武警医学院 药剂学教研室 ,天津 　300162)
摘 　要 :目的 　研究华蟾蜍毒素在大鼠体内的组织分布特征 ,为临床合理用药提供依据。方法 　大鼠舌下 iv 015、
1mg/ kg 华蟾蜍毒素。采用 HPLC 法测定大鼠组织中不同时间点的药物浓度 ,组织生物样品用液2液萃取法处理。
结果 　大鼠舌下 iv 华蟾蜍毒素后 ,组织分布较快 ,给药后 30 min , 除脂肪外其余 8 个组织均可测到华蟾蜍毒素 ;给
药后 60 min ,大部分血流丰富组织即达到药物浓度峰值 ,其中肝脏药物浓度最高 ;当给药浓度成倍增加时 ,华蟾蜍
毒素在各组织中的达峰时间并没有变化 ,只是相应时间点的药物浓度均略有升高 ,药物消除的时间也相应延长。
结论 　华蟾蜍毒素在大鼠组织中分布广泛 ,吸收和消除均较快 ,在脑组织中也可达到较高药物浓度。
关键词 :华蟾蜍毒素 ;高效液相色谱 ;组织分布
中图分类号 :R286. 02 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2009) 05 0722 04
Tissue distribution of cinobufagin in vivo in rats
ZHAN G Lei1 , ZHAN G Li2 , BA I Xue2 , Q I Gang2
(1. Department of Pharmacy , The Affiliated Hospital of Medical College of Chinese People′s Armed
Police Force , Tianjin 300162 , China ; 2. Department of Pharmacy , Medical College
of Chinese People′s Armed Police Forces , Tianjin 300162 , China)
Abstract : Objective 　To investigate t he tissue dist ribution character of cinobufagin in i n vi vo in rat s ,
in order to p rovide some references for rational drug use in t he clinic. Methods 　Two kinds of solutions of
cinobufagin were given to rat s (015 and 1 mg/ kg) by sublingual iv injection. The cinobufagin concent ra2
tion in rat tissues corresponding to different time2point was determinated by HPL C. The biological samples
of t he different tissuses were performed by liquid2liquid ext raction met hod. Results 　Cinobufagin dist ribu2
ted rapidly to tissue af ter sublingual iv injection. At 30 min cinobufagin in eight tissues except fat was de2
tected. At 60 min t he concent ration in a majority of tissue achieved t he peak value and liver′s was tip top .
When t he concent ration of cinobufagin increased by gemination , the time of reaching peak value had no
change. Only t he concent ration of cinobufagin increased slightly corresponding to t he time2point . Conclu2
sion The dist ribution of cinobufagin in tissues of rat s is extensive. Both the absorption and elimination of
cinbufagin are quick and up to t he top concent ration in brain tissue.
Key words : cinobufagin ; HPL C ; dist ribution of tissue
　　华蟾蜍毒素是蟾酥的提取物 ,具有较强的药理
活性 ,可以调节患者的细胞和体液免疫功能 ,防止乙
肝慢性病变和癌变 ,而价格比干扰素等抗病毒药物
低得多。在临床上也已广泛应用于肿瘤治疗 ,尤其
是对原发性肝癌、肺癌、食管癌和胃癌有较好的疗
效。但是临床用于治疗病毒型肝炎时发现其不良反
应发生率高达 43128 %[1 ,2 ] 。笔者经反复探索建立
了血液中华蟾蜍毒素的高效液相色谱测定方法 ,采
用舌下静脉 iv 的给药方式 ,研究两个不同剂量下华
蟾蜍毒素在大鼠体内的药动学过程[3 ,4 ] 。为进一步
指导临床合理用药 ,本实验又进行了两个剂量华蟾
蜍毒素在大鼠体内的组织分布研究。
1 　材料与仪器
雄性 Wistar 大鼠 ,体质量 (220 ±15) g ,购自军
事医学科学院实验动物中心 ,合格证号为 SCXK -
(军) 20022001 ,实验前 ,正常饲养 2 周。
华蟾蜍毒素对照品由中国药品生物制品检定所
提供 ,批号 :80329202 ;对羟基苯甲酸乙酯对照品由
中国药品生物制品检定所提供 ,批号 : 80329202 ;色
谱纯甲醇 ,其他试剂均为分析纯 ,由天津市康科德科
·227· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
3 收稿日期 :2008208204　　　
基金项目 :武警医学院青年基金资助项目 ( W YQ2006213)
作者简介 :张　磊 (1973 —) ,男 ,天津人 ,主管药师 ,2003 年获河北医科大学药理学硕士学位 ,从事天然药物药动学及医院制剂研究。
Tel : (022) 60577684 　E2mail : zhanglei458 @sohu. com3 通讯作者　张　莉　Tel : (022) 60578196 　E2mail : zhli62tianjin @yahoo. com. cn
技有限公司提供 ;超纯水。
Shimadzu 高效液相色谱仪 ( Shimadzu L C -
10A TV P 高压泵 , Shimadzu CTO - 10ASV P 柱箱 ,
SPD - 10AV P UV 检测器 ,Shimadzu C - R8A 积分
仪) 。L C - P45 百万分之一天平 ( Mettler) ; A E100
万分之一天平 (上海) ; HZS - H 水浴振荡器 (哈尔
滨市东联电子技术开发有限公司) ; XW - 80A 型旋
涡混合器 (上海琪特分析仪器有限公司) 。
2 　方法与结果
211 　色谱条件 : Shim2pack V P2ODS 色谱柱 (150
mm ×416 mm , 5μm) ;流动相 :甲醇2水 (70 ∶30) ;
体积流量 :1mL/ min ;检测波长 :290 nm ;柱箱温度 :
30 ℃;进样量 : 20μL 。在本研究的液相色谱条件
下 ,华蟾蜍毒素的最低检出质量浓度为0114μg/ mL 。
212 　溶液的配制
21211 　对照品溶液的配制 :精密称取华蟾蜍毒素对
照品 101066 mg ,置于 100 mL 量瓶中 ,加入甲醇溶
解并稀释至刻度 ,得华蟾蜍毒素对照贮备液 (100166
μg/ mL ) 。避光 4 ℃冰箱保存。临用时将贮备液用
流动相稀释至所需浓度。
21212 　内标液的配制 :精密称取对羟基苯甲酸乙酯
对照品 101010 mg ,置于 100 mL 量瓶中 ,加入甲醇
溶解并稀释至刻度 ,得对羟基苯甲酸乙酯内标贮备
液 (100μg/ mL) ,避光 4 ℃冰箱保存。
213 　方法学确证
21311 　标准曲线的制备 :取 100μg/ mL 对羟基苯甲
酸乙酯内标溶液 20μL 和适量华蟾蜍毒素对照品溶
液置于尖底离心试管中 ,挥干溶剂后加入空白组织
匀浆液 1 mL ,共 5 份 ,使空白组织匀浆液中华蟾蜍
毒素的质量浓度分别为 0125、015、110、210、310
μg/ mL 。离心试管中加入 4 mL 提取液乙醚2醋酸
乙酯 (5 ∶1) ,旋涡混合器上间断提取 3 min ,2 000
r/ min 离心 2 min ,取出上层液。同法再提取 1 次 ,
合并上层液 ,置于水浴摇床上 (40 ℃,50 r/ min) 挥
干溶剂。加入 250μL 色谱纯甲醇 ,旋涡混合器上间
断混合 2 min ,滤过 ,取滤液 20μL 进行 H PL C 分
析。以样品峰与内标峰面积比对相应的组分质量浓
度进行线性回归 ,结果线性范围均为 0125～310
μg/ mL ,并得到标准曲线方程和线性系数。心脏 : Y =
01042 51 + 01477 5 X ( r = 01995 1 ) , 肝脏 : Y =
01029 31 + 01490 6 X ( r = 01995 6 ) , 脾脏 : Y =
01077 52 + 01406 7 X ( r = 019961 ) , 肾脏 : Y =
01098 23 + 01417 0 X ( r = 01995 3 ) , 睾丸 : Y =
01015 79 + 01509 7 X ( r = 01996 8) ,骨骼肌 : Y =
01063 91 + 01431 2 X ( r = 01996 1) ,脑组织 : Y =
01042 93 + 01355 3 X ( r = 01995 6 ) , 脂肪 : Y =
01051 63 + 01358 9 X ( r = 01994 9 ) , 肠道 : Y =
01059 68 + 01351 9 X ( r = 01994 3) 。
21312 　专属性考察 :按照选定的色谱条件 ,测定华
蟾蜍毒素对照溶液、用药前大鼠空白组织、用药后大
鼠组织中华蟾蜍毒素质量浓度 ,按照生物样品处理
方法处理各个组织样品后进行色谱分析 ,华蟾蜍毒
素的保留时间为 611 min ,大鼠组织中的内源性杂
质不干扰华蟾蜍毒素的测定。
21313 　精密度试验 :取 1 mL 空白组织匀浆液加入
不同量的华蟾蜍毒素对照品溶液 ,分别配制成含华
蟾蜍毒素 50、100μg/ mL 样品 ,在 1 d 内重复测定 5
次 ;1 d 测定 1 次 ( - 20 ℃保存) ,连续 5 d ,计算各组
织日内和日间 RSD ,结果见表 1。显示各组织中 2
种质量浓度的日内、日间 RSD 均小于 10 % ,说明该
分析方法的精密度符合要求。
表 1 　精密度试验结果
Table 1 　Results of precision test
组 织
50μg ·mL - 1 100μg ·mL - 1
日　内
RSD / %
日　间
RSD / %
日　内
RSD / %
日　间
RSD / %
心脏　 1. 6 5. 3 1. 5 5. 6
肝脏　 1. 7 5. 5 1. 4 5. 8
脾脏　 1. 6 6. 2 1. 6 5. 6
脑组织 1. 6 5. 5 1. 3 5. 0
肠道　 1. 9 5. 9 1. 8 4. 8
肾脏　 1. 7 4. 8 1. 7 5. 1
睾丸　 2. 1 5. 3 1. 7 4. 7
骨骼肌 2. 2 6. 2 1. 9 7. 1
脂肪　 2. 1 9. 8 2. 6 8. 9
21314 　方法回收率试验 :取空白大鼠各组织匀浆液
1 mL 共两份 ,加入不同量的华蟾蜍毒素对照品溶
液 ,分别配制成含华蟾蜍毒素 50、100μg/ mL 样品 ,
测定 ,各 5 次 ,以华蟾蜍毒素的测得量/ 加入量 ×
100 %计算回收率 ,结果见表 2。表明样品中华蟾蜍
毒素的回收率均达到 93 %以上。
214 　组织样品取样方法 :70 只大鼠随机分成 2 组 ,
即华蟾蜍毒素低、高两个剂量组 ,每组 35 只 ,按 1
mL/ 100 g 舌下静脉分别 iv 50、100μg/ mL 华蟾蜍
毒素溶液。各实验组分别在舌下静脉 iv 给药后第
30、60、90、120、180、240、360 min 准时取 5 只大鼠
断头取血 ,同时尽快解剖大鼠 ,摘取大鼠心脏、肝脏
(上叶) 、肾脏、脑组织、脾脏、右侧后腿骨骼肌、睾丸、
小肠上段 4～5 cm、脂肪 ,生理盐水清洗 ,滤纸吸干。
·327·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
表 2 　回收率试验结果
Table 2 　Results of recovery test
组 织
回收率/ %
50μg ·mL - 1 100μg ·mL - 1
心脏　 96. 34 ±2. 8 94. 32 ±2. 4
肝脏　 97. 65 ±2. 6 96. 25 ±2. 1
脾脏　 95. 01 ±3. 1 95. 13 ±4. 1
脑组织 94. 35 ±2. 2 93. 35 ±1. 4
肠道　 94. 38 ±2. 4 93. 98 ±2. 1
肾脏　 97. 35 ±2. 0 94. 89 ±1. 8
睾丸　 95. 44 ±2. 1 95. 21 ±2. 2
骨骼肌 95. 37 ±1. 8 95. 21 ±2. 0
脂肪　 94. 39 ±2. 3 94. 75 ±1. 5
215 　组织样品处理方法 :分别精密称量各组织
350～500 mg ,按 1 ∶4 的比例加入生理盐水 ,用高
速组织匀浆机匀浆 ;取尖底玻璃离心管 ,加入 20μL
内标液 ,挥干溶剂后加入 1 mL 组织匀浆液 ,旋涡混
合器上间断振荡混匀 2 min。然后加入提取液乙醚2
醋酸乙酯 (5 ∶1) 4 mL ,旋涡混合器上间断振荡 3
min ,2 000 r/ min 离心 10 min ,取出上清液。同法
再提取一次 ,合并倾出液 ,置于水浴摇床上 (40 ℃,
50 r/ min) 挥干溶剂。加入 250μL 色谱纯甲醇 ,旋
涡混合器上间断混合 2 min ,滤膜滤过 ,进样 20μL ,
进行 H PL C 分析。
216 　实验结果 :不同剂量不同时间点华蟾蜍毒素在
大鼠各组织中的分布见表 3。结果显示 ,大鼠舌下
静脉 iv 华蟾蜍毒素后 ,组织分布较快 ,给药后 30
min ,除脂肪外其余 8 个组织均可测到华蟾蜍毒素 ;
给药后 60 min ,大部分血流丰富组织即达到药物浓
度峰值 ,其中肝脏华蟾蜍毒素质量浓度最高 ,其他组
织依次是脾脏、脑组织、骨骼肌、睾丸、肾脏 ;到 120
min 华蟾蜍毒素在脂肪中才达到较高浓度 ,而小肠
中华蟾蜍毒素浓度的达峰时间则更长 ,在 180 min
以后。
给药后 240 min ,心脏、脑组织、骨骼肌、脾脏、
睾丸、脂肪中已经测不到华蟾蜍毒素 ,说明在这些组
织中华蟾蜍毒素消除较快 ,而在肝脏 ,尤其是在肾脏
中则消除得相对较慢。当给药浓度成倍增加时 ,华
蟾蜍毒素在各组织中的达峰时间并没有变化 ,只是
相应时间点的药物浓度均略有升高 ,药物消除的时
间也相应延长。研究还显示 ,在肠道中检测到华蟾
蜍毒素 ,表明华蟾蜍毒素可能有肠肝循环的迹象。
3 　讨论
给药方法的选择 :在预实验中 ,对 3 组大鼠分别
采用 ig、ip、舌下静脉 iv 给药方法。结果发现 ,ig 给
表 3 　大鼠舌下静脉给药不同剂量华蟾蜍毒素后不同时间的组织药物浓度分布
Table 3 　Drug distribution of cinobufagin in various dosages at different periods to rats by sublingual iv injection
组织
iv 1 mg ·kg - 1华蟾蜍毒素后组织药物质量浓度/ (μg ·mL - 1)
30 min 60 min 90 min 120 min 180 min 240 min 360 min
心脏　 2. 975 ±0. 274 2. 527 ±0. 235 2. 450 ±0. 291 1. 632 ±0. 181 0. 748 ±0. 093 0. 397 ±0. 043 —
肝脏　 2. 395 ±0. 322 8. 871 ±1. 061 3. 775 ±0. 539 3. 476 ±0. 434 3. 203 ±0. 405 2. 050 ±0. 283 1. 221 ±0. 167
脾脏　 3. 678 ±0. 832 5. 305 ±0. 756 3. 296 ±0. 655 2. 786 ±0. 821 2. 518 ±0. 705 0. 832 ±0. 333 —
脑组织 2. 408 ±0. 231 4. 762 ±0. 365 1. 563 ±0. 144 0. 976 ±0. 065 0. 908 ±0. 055 — —
肠道　 0. 746 ±0. 082 0. 793 ±0. 110 0. 862 ±0. 120 0. 811 ±0. 090 1. 309 ±0. 120 1. 349 ±0. 150 —
肾脏　 2. 982 ±0. 269 3. 047 ±0. 335 2. 820 ±0. 362 2. 625 ±0. 384 2. 185 ±0. 201 2. 029 ±0. 525 1. 437 ±0. 655
睾丸　 1. 427 ±0. 456 3. 912 ±0. 488 1. 351 ±0. 398 1. 297 ±0. 426 1. 261 ±0. 322 0. 519 ±0. 201 —
骨骼肌 21. 880 ±5. 340 4. 672 ±0. 998 2. 316 ±0. 521 1. 844 ±0. 425 1. 675 ±0. 686 — —
脂肪　 0. 752 ±0. 023 1. 379 ±0. 235 1. 582 ±0. 566 1. 245 ±0. 453 0. 862 ±0. 223 0. 711 ±0. 236 —
组织
iv 0. 5 mg ·kg - 1华蟾蜍毒素后组织药物质量浓度/ (μg ·mL - 1)
30 min 60 min 90 min 120 min 180 min 240 min 360 min
心脏　 1. 621 ±0. 183 0. 969 ±0. 102 1. 251 ±0. 112 0. 874 ±0. 111 0. 459 ±0. 045 — —
肝脏　 1. 830 ±0. 203 6. 688 ±0. 756 2. 992 ±0. 323 2. 654 ±0. 214 2. 037 ±0. 221 1. 651 ±0. 323 1. 193 ±0. 345
脾脏　 2. 627 ±0. 412 3. 172 ±0. 423 2. 830 ±0. 265 2. 329 ±0. 235 0. 804 ±0. 102 — —
脑组织 2. 254 ±0. 123 4. 672 ±0. 365 1. 413 ±0. 223 0. 926 ±0. 13 0. 891 ±0. 150 — —
肠道　 0. 720 ±0. 056 0. 750 ±0. 062 0. 596 ±0. 035 1. 024 ±0. 069 0. 609 ±0. 072 1. 399 ±0. 356 —
肾脏　 2. 746 ±0. 423 2. 747 ±0. 368 2. 659 ±0. 623 2. 637 ±0. 656 1. 848 ±0. 521 1. 874 ±0. 823 2. 492 ±1. 096
睾丸　 0. 851 ±0. 121 2. 755 ±0. 356 1. 004 ±0. 231 1. 247 ±0. 623 0. 709 ±0. 325 — —
骨骼肌 1. 392 ±0. 365 3. 546 ±0. 465 1. 793 ±0. 296 1. 56 ±0. 623 1. 509 ±0. 745 — —
脂肪　 0. 215 ±0. 012 0. 322 ±0. 111 1. 100 ±0. 466 1. 295 ±0. 485 0. 807 ±0. 223 — —
·427· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
药所需剂量大 ,且有肝脏首过效应 ,药品起效相对
慢 ,实验结果个体差异较大。而 ip 由于在腹腔给药
部位和深浅的不同 ,极易造成局部血药浓度过高 ,导
致在检测时得出错误的结论。相对而言 ,舌下静脉
ip 给药 ,药物直接入血 ,干扰因素较少 ,数据更为可
靠。目前临床上所用的华蟾蜍毒素制剂以注射液为
主 ,静脉给药的研究方法对临床更有指导意义。
提取条件的选择 :组织中提取华蟾蜍毒素时 ,笔
者参照前期血清中蟾蜍灵测定研究方法 ,采用混合
有机溶剂萃取的方法提取血清样品中的华蟾蜍毒
素[5 ,6 ] 。即取匀浆后的组织 ,加入内标后 ,加入提取
液乙醚2醋酸乙酯 (5 ∶1) 4mL ,旋涡混合器上间断振
荡混合 3 min ,是为了让组织的匀浆液及血清与提
取液之间充分混合 ,间断振荡是为了减少组织匀浆
液的乳化 ,从而使样品易于提取充分。
肺组织按照同样的方法进行实验 ,未测得华蟾
蜍毒素 ;肾上腺组织质量过轻 ,无法获取足够组织匀
浆液进行进一步分析 ,因此实验结果中没有这两个
组织的数据。
参考文献 :
[ 1 ] 　高艳荣 ,张　莉 ,张　磊 ,等. 蟾酥及其有效成分的药理作用及
机制研究进展[J ] . 武警医学院学报 ,2003 ,12 (5) : 4062408.
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2001 ,32 (2) :1842186 .
[ 3 ] 　张　磊 ,齐　刚 ,张　莉 ,等. 高效液相色谱法测定大鼠血清中
华蟾素浓度[J ] . 中国医院药学杂志 ,2006 ,26 (6) :6922694.
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蜍灵浓度[J ] . 药物分析杂志 ,2004 ,24 (5) : 5232525.
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rat s [J ] . A sia J D rug Metab Pharmacokinet , 2003 , 3 (4) :
2972300.
大黄不同炮制品指纹特征的识别研究
孙玉琦1 ,2 ,马永刚2 ,肖小河2 3　 ,刘晓娟1
(1. 辽宁医学院药学院 ,辽宁 锦州 　121001 ; 2. 中国人民解放军中药研究所 ,北京 　100039)
摘 　要 :目的 　建立大黄不同炮制品的 HPLC 指纹图谱 ,为大黄炮制品的质量评价和炮制机制研究提供依据。方
法 　采用梯度洗脱 HPLC 法 ,建立大黄不同炮制品指纹图谱 ,运用中药指纹图谱相似度评价方法与样品聚类分析
方法 ,对其指纹特征进行研究。结果 　该方法重复性良好 ,大黄不同炮制品指纹图谱共有峰特征明显 ,不同炮制品
指纹特征存在差异 ,其化学成分发生了不同程度的变化。其中生大黄与酒大黄、醋大黄差异较小 ,与熟大黄、清宁
片存在差异 ,与大黄炭差异明显。结论 　建立的大黄不同炮制品的指纹图谱可以识别大黄不同炮制品的归属特
征 ,可有效控制内在质量 ,探讨炮制机制 ,并可进一步进行大黄的安全性评价和指导临床合理用药。
关键词 :大黄 ;炮制 ;指纹图谱 ; HPLC 法
中图分类号 :R286. 02 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2009) 05 0725 04
　　大黄中主要含有蒽醌类、多糖类、鞣质等 80 多
种成分。大黄所含有的大黄素等蒽醌类成分有肝肾
毒性和致癌性的潜在危险 ,长期应用大黄停药后有
继发性便秘之虞[ 1 ] 。中药炮制是中医用药的一大特
色和优点 ,炮制减毒是中药合理制用的有效途径和
手段。大黄的炮制品主要有生大黄、酒大黄、醋大
黄、熟大黄、清宁片、大黄炭。大黄经炮制后 ,其化学
组分、药性和毒性都将发生相应的变化。色谱指纹
图谱是通过比较各样本间色谱图的差异来反映样品
化学成分的差异[ 2 ] 。本实验通过对大黄不同炮制品
指纹图谱的识别研究 ,旨在阐明大黄因炮制而产生
的成分变化规律 ,有效控制大黄的内在质量、探索大
黄的炮制机制 ,进而为大黄的不同炮制品的成分与
药效间建立联系 ,为大黄临床的安全、有效应用提供
依据。
1 　仪器与试药
美国 Agilent 1100 高效液相色谱仪 , 配有
DAD ;25 μL 微量进样器 (美国 Hamilton) ; 瑞士
Mettler Toledo AL204 微量分析天平。
纯净水 (乐百氏纯净水公司) ,乙腈为色谱纯试
剂 ,磷酸、甲醇等为分析纯试剂。大黄素、大黄酚、大
黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚对照品由中国药品生
·527·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
3 收稿日期 :2008207211　　　
基金项目 :“十五”国家科技攻关项目 (2004BA721A14)
作者简介 :孙玉琦 (1978 —) ,辽宁省大连市人 ,研究方向为中药新剂型新技术。E2mail :cpusyq @163. com3 通讯作者　肖小河　Tel : (010) 66933322 　Fax : (010) 63825768