全 文 ：加压提取红三叶草总异黄酮的研究
杨薇薇 ,张永忠 3 ,李成刚 ,张丽丽
(东北农业大学理学院 应用化学系 ,黑龙江 哈尔滨 150030)
摘 　要 :目的 　考察加压技术提取红三叶草总异黄酮的试验条件。方法 　通过正交试验 ,以异黄酮得率为指标 ,优
选红三叶草异黄酮的加压提取工艺参数。结果 　当压力为 018 MPa ,乙醇体积分数为 50 % ,液固比为 15 mL/ g ,保
压时间为 5 min 时 ,红三叶草总异黄酮得率和质量分数分别达 5710 mg/ g 和 8185 %。结论 　与醇提法相比 ,加压
提取是一种快速高效的新方法 ,这一方法在中草药有效成分的提取分离中将具有很好的应用前景。
关键词 :红三叶草 ;总异黄酮 ;加压 ;提取
中图分类号 :R28412 ; R286102 　　　文献标识码 :B 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0921406202
　　红三叶草 T ri f ol i um p ratense L1 又名红车轴
草、红菽草、红爪草 ,为豆科三叶草属多年生牧草 ,原
产小亚细亚与东南欧 ,广泛分布于温带及亚热带地
区[1 ] 。红三叶草中异黄酮的量比其他豆科植物中异
黄酮的量高 10～30 倍[2 ] 。天然存在的红三叶草异
黄酮主要有芒柄花黄素 (formononetin) 、鸡豆黄素
(biochanin A) 、染料木黄酮 ( genistein) 、黄豆苷元
(daidzein)等 ,其中芒柄花黄素和鸡豆黄素是大豆中
不存在的异黄酮类化合物且量较高[3 ] 。红三叶草异
黄酮具有弱雌激素作用、能有效改善妇女更年期综
合症[ 4 ] 、预防和治疗动脉硬化[5 ] 。加压萃取技术是
用温度和压力来加速从固体或半固体提取有效成分
效率的技术。此项技术在中药提取领域仍是一种全
新的方法[6 ] ,在国内研究并不多见。由于传统的回
流提取存在提取时间长、溶剂用量多、能耗大、提取
效率不高等缺陷 ,因此本实验尝试将加压技术应用
于红三叶草异黄酮的提取上 ,以期对红三叶草异黄
酮的生产提供参考。
1 　材料和仪器
　　红三叶草于东北农业大学园艺站室外种植 ,采
于花期 ,全株晒干后用高速万能粉碎机粉碎。芒柄
花黄素、鸡豆黄素对照品 (质量分数为 99 % , Fluka
公司) ;无水乙醇为分析纯 (国药集团化学试剂有限
公司) 。
　　Mettler Toledo A G135 型电子天平[梅特勒2托
利多仪器 (上海)有限公司 ] ; FW 型高速万能粉碎机
(天津市泰斯特仪器有限公司) ;高压磁力搅拌反应
釜 (烟台高新区科立自控设备研究所) ;高效液相色
谱仪 :Waters 515 泵、Waters2487 紫外检测器 ( Wa2
ters 公司) 。
2 　方法和结果
211 　异黄酮的高效液相色谱法测定[ 7 ]
21111 　色谱条件 :Nova2Pak C18 色谱柱 (150 mm ×
319 mm) ;流动相 :60 %甲醇 ;体积流量 :110 mL/ min ;
柱温 :25 ℃;进样量 :10μL 。
21112 　标准曲线的绘制 :称取芒柄花素和鸡豆黄素
对照品各 11000 mg ,用无水甲醇定容于 10 mL 量
瓶。分别从芒柄花黄素、鸡豆黄素各对照品储备液
中吸取一定量 ,用甲醇稀释到 2、4、6、8μg/ mL 测
定 ,记录峰面积。结果芒柄花黄素、鸡豆黄素在 2～
8μg/ mL 线性关系良好 ,所得回归方程分别为 Y =
471096 X + 11163 4 ( R2 = 01999 7) 、Y = 601148 X
- 91132 ( R2 = 01999 5) 。
21113 　供试品溶液的制备 :称取 6 g 红三叶草粉
末 ,按正交试验条件提取。提取液减压滤过后转移
至量瓶 ,用 50 %乙醇定容至 100 mL 。从中精密吸
取 110 mL ,加 50 %乙醇定容至 25 mL ,再精密吸取
110 mL 加 50 %乙醇定容至 25 mL ,摇匀 ,0145μm
微孔滤膜滤过 ,即得。
21114 　测定和计算方法 :红三叶草异黄酮的得率以
芒柄花黄素和鸡豆黄素的总得率计算 ,即得率 = 提
取液中异黄酮的质量/ 红三叶草的质量。
212 　加压提取工艺流程 :加压提取包括升压、保压、
卸压 3 个过程。将红三叶草粉和 50 %乙醇放入到
·6041· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 9 期 2009 年 9 月
3 收稿日期 :2008211212　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :黑龙江省“十一五”重大科技攻关项目 ( GA06B40224) ;大豆生物学教育部重点实验室主任基金项目 (SB05A04)
作者简介 :杨薇薇 (1984 —) ,女 ,吉林人 ,硕士研究生 ,主要从事食品化学及天然产物化学的研究。E2mail : weiyang126 @1631com3 通讯作者　张永忠　E2mail : zyz1953 @sohu1com
高压反应釜内 ,启动电热加热套通过升温加压 ,磁力
搅拌转速为 240 r/ min。当压力上升到所需压力时
停止升压 ,保压一段时间后 ,通冷凝水降温卸压。然
后取出提取液滤过 ,测定异黄酮的质量浓度。
213 　正交试验设计 :根据单因素预试验结果 ,每次
试验称取 6 g 红三叶草粉 ,采用 L 9 (34 ) 正交试验进
行优化 ,因素水平见表 1 ,测定结果见表 2。
表 1 　因素与水平
Table 1 　Factors and levels
水平
因　素
A 压力/
MPa
B 乙醇体积
分数/ %
C 液固比/
(mL ·g - 1)
D 保压时间/
min
1 014 60 10 3
2 016 40 15 5
3 018 50 20 7
表 2 　正交试验设计与结果
Table 2 　Design and results of L9 ( 43 ) orthogonal test
试验号 A B C D 得率/ (mg ·g - 1)
1 1 1 1 1 311 45
2 1 2 2 2 411 24
3 1 3 3 3 411 73
4 2 1 2 3 461 43
5 2 2 3 1 431 19
6 2 3 1 2 511 90
7 3 1 3 2 531 47
8 3 2 1 3 441 09
9 3 3 2 1 551 35
K1 114142 1311 65 1271 44 129199
K2 141152 1281 52 1431 02 146161
K3 152191 1481 98 1381 39 132145
k1 38114 431 88 421 48 43133
k2 47117 421 84 471 67 48187
k3 50197 491 66 461 13 44115
R 12183 61 82 51 19 3103
　　从极差分析结果得出影响红三叶草总异黄酮提
取效率的因素主次顺序为 A > B > C > D ,即压力、乙
醇体积分数、液固比 ,保压时间影响不显著。最佳组
合为 A3B3 C2 D2 ,即压力为 018 MPa ,乙醇体积分数
为 50 % ,液固比为 15 mL/ g ,保压时间为 5 min。
　　以优化试验所得的条件放大 10 倍进行 3 次验
证试验 ,结果红三叶草异黄酮的平均得率为 5710
mg/ g。
214 　对比试验 :分别取 60 g 红三叶草粉以优化工
艺参数进行加压提取和传统回流提取。精密吸取
1010 mL 提取液于恒重的蒸发皿中 ,真空干燥至恒
重 ,得其固形物质量 ,计算其中异黄酮的质量分数
(异黄酮的质量分数 = 固形物中异黄酮的质量/ 固形
物质量 ×100 %) ,比较结果见表 3。可知与回流浸
提法相比 ,加压法提取红三叶草总异黄酮得率和质
量分数都有很大提高 ,而且乙醇体积分数和液固比
都小于溶剂浸提法 ,另外提取时间大大缩短 ,说明采
用加压提取红三叶草总异黄酮省时节能 ,高率。
表 3 　对比试验结果
Table 3 　Results of contrast test
方　法
乙醇体积
分数/ %
液固比/
(mL ·g - 1)
提取时间
/ min
得率/
(mg ·g - 1)
质量分
数/ %
加压法 50 15 5 　　 5710 81 85
回流提法 [7 ] 80 20 90 　　 1813 31 65
3 　讨论
　　实验中发现压力对加压萃取红三叶草异黄酮的
影响最大 ,其原因可能是提高压力可以增加溶质的溶
解度及扩散速度 ,另外也可以减小溶液的黏度以减小
阻力 ,同时有压力下的渗透可能把红三叶草颗粒的某
些细胞壁破坏 ,这些都有利于异黄酮的渗出。由于本
实验是通过升温加压 ,当压力达到 112 MPa 时 ,温度
过高 ,导致红三叶草颗粒部分碳化溶液浑浊。从得率
及节能综合考虑 ,选取压力为 018 MPa。
　　加压提取不同于传统的加热回流提取 ,加压提
取是压力在液体媒介的作用下传递的过程 ,不论提
取对象是液体还是固体 ,均可受到均匀一致的压力
作用。传统的溶剂回流提取由于回流过程要与环境
有较大的能量交换 ;而加压提取在保压时间内几乎
没有能耗 ,其作用效果迅速、均匀且能量消耗较少。
将加压提取用于红三叶草异黄酮的提取上 ,是红三
叶草异黄酮提取手段的一种新的探索 ,可以提高有
机溶剂对异黄酮的提取效率 ,这对红三叶草异黄酮
的生产利用具有十分重要的意义。
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·7041·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 9 期 2009 年 9 月