全 文 ：·232· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月
红三叶总异黄酮对人乳腺癌MCF一7细胞增殖和凋亡的影响
尹春萍1，樊龙昌2，何俊文2，刘妙娜1，王月琴1，张滋洋2
(1．华中科技大学同济医学院药学院，湖北武汉430030；2．华中科技大学同济医学院附属同济医院
泌尿外科，湖北武汉430030)
摘 要：目的 研究红三叶总异黄酮对人乳腺癌MCF一7细胞的生长抑制和凋亡的诱导作用。方法在体外细胞培
养下，采用不同质量浓度红三叶异黄酮和5-Fu处理MCF一7细胞，MTT法测定红三叶总异黄酮抑制MCF一7细胞
增殖的量一效关系；TUNEL法、流式细胞术分析其细胞凋亡率和周期分布。结果红三叶总异黄酮对MCF-7细胞
增殖的抑制作用随药物质量浓度提高和作用时间延长而更加明显，而在低质量浓度时却出现轻微促细胞增殖现
象。TUNEL法、流式细胞术分析结果表明，红三叶总异黄酮能诱导MCF一7细胞凋亡，阻滞细胞于Gz／M期，降低
细胞增殖指数，且这种作用也存在剂量一效应关系。结论 红三叶总异黄酮可抑制MCF一7细胞增殖并诱导其凋亡，
具有抗肿瘤作用。
关键词：红三叶总异黄酮；乳腺癌；MCF一7；细胞凋亡
中图分类号：R286．91 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)02—0232—03
Effectofredclovertotalisoflavonesoncellproliferationandap ptosis
ofhumanbreastcancerc llineMCF一7
YINChun—pin91，FANLong—chan92，HEJun—wen2，LIUMiao—nal，WANGYue—qinl，ZHANGZi—yan92
(1．DepartmentofPharmacy，TongjiMedicalCo lege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，
Wuhan430030，China；2．DepartmentofUrology，TongjiH spital，TongjiMedicalCollege，
HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China)
Abstract：ObjectiveTostudyth ffectofredclovertotalisoflavonesonproliferationandapoptosis
ofhumanbreastcancercellineMCF一7andthemolecularmechanismoftheaction．MethodsProli—
ferationofMCF一7cellspre—andpost—treatmentwithredclovertotaIisoflavonesand5一Fuwasdetermined
byMTTassay．TheinductionofapoptosisandthechangeofcellcycleinMCF-7cellstreatedwithred
clovertotalisoflavoneswereinvestigatedbyTUNELandFlowcytometry．ResultsMTTAssayshowed
thattheproliferationofMCF一7cellsinvitrowasinhibitedbyredclovertotalisoflavonesintime—dependent
andconcentration—dependentmann rs．Butitco ldpromotetheproliferationinlowconcentration(<：25．0
pg／mL)．TUNELandflowcytometryshowedthatheapoptosisandnhibitionofMCF一7cellsinG2／M
phasew reinducedaftert eatedwithredclovertotalisoflavones．ConclusionThetotalisoflavonesfrom
redcloverhavetheffectofanti—tumorfortheycouldinhibittheproliferationandinducethecellapoptosis
ofMCF一7cells．
Keywords：redclovertotalisoflavones；breastcancer；MCF一7cell；apoptosis
红三叶(英文名redclover)，又名红花车轴草
TrifoliumpratenseL．、红荷兰翘摇，为豆科车轴属
植物，其主要活性成分为异黄酮类化合物，具有雌激
素样作用和抗肿瘤效应，除对激素相关肿瘤发挥抗
癌作用外，还可抑制体外培养的胃癌、肝癌及肺癌细
胞株的生长n’2]。虽然有关的研究已取得较深入的进
展和认识，但迄今为止其抗癌成分和机制仍未阐明。
本实验通过MTT法、原位细胞凋亡检测、流式细胞
术等方法，研究红三叶总异黄酮对体外培养的人乳
腺癌MCF一7细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用，并
探讨其作用机制。
1材料与方法
1．1 实验材料：红三叶总异黄酮(有效部位)由湖
北省医药工业研究院孙代华研究员馈赠，其中含总
异黄酮58％；5一Fu(5一氟尿嘧啶，天津金耀氨基酸有
限公司，批号0508161)。人乳腺癌MCF一7细胞引自
同济医院基础外科实验室。RPMI一1640及胰酶为
Gibco公司生产；胎牛血清购于兰州市民海生物制
收稿日期：200608—08
作者简介：尹春萍(1965一)，女，湖北武汉人，副教授，硕士生导师，长期从事生药学、中药药理学教学及科研工作，发表论文20余篇，获
多项省、厅级科研课题，先后赴日本、美国留学。Tel：(027)83692733E—mail：cpyin888@163．corn
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月·233·
品公司；MTT、二甲基亚砜(DMSO)均购自美国
Sigma公司；细胞凋亡检测试剂盒购自武汉博士德
生物工程有限公司；碘化丙啶(propidiumiodide，
PI)购自武汉凌飞科技有限公司。
1．2对MCF一7细胞体外增殖的影响：采用MTT
比色法，取对数生长期MCF一7细胞接种于96孔培
养板，每孔5×103个细胞，培养24h后，加入红三叶
总异黄酮溶液，使终质量浓度分别为6．25、12．5、
25．0、50．0、100、200／-g／mL，每个质量浓度设4个
平行孔，另设溶剂对照组、5-Fu(5．0、10．0pg／mL)
组，分别检测各组24、48、72、96h时细胞增殖情况。
即加药后继续培养相应时间，加入5mg／mLMTT，
再培养4h后倒掉板中的培养液，各孔加150弘L
DMSO，轻轻振动后，用酶标仪(波长570nm)测定
各孑L的吸光度(A)值，以上实验重复5次。取每组
4个孔总计20孔A的平均值作为各组的A值，按
下式计算细胞存活率及增殖抑制率。
存活率一A药物／A对照×100％
增殖抑制率一(1一A药物／A对照)×100％
1．3 原位凋亡细胞检测(TUNEL染色)：取对数
生长期细胞常规消化，以含红三叶总异黄酮100
pg／mL培养基、细胞以2×104／mL的密度接种于6
孔板中，制备细胞爬片，培养48、96h，用丙酮溶液
[丙酮一无水乙醇(1：1)]固定。按照细胞凋亡检测
试剂盒的说明操作，用二氨基联苯胺法(DAB)显
色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封
固。光镜下观察见细胞核中有棕色颗粒者为阳性细
胞，即凋亡细胞。在高倍镜(×200)下随机选择细
胞分布均匀的5个视野，计数l000个细胞，计算阳
性细胞的百分率，即凋亡指数。
1．4流式细胞仪检测凋亡细胞：用含红三叶总异黄
酮100弘g／mL培养基培养MCF一7细胞48、72、96
h后，0．25％胰蛋白酶消化成细胞悬液，收集于离
心管中离心，弃上清液。用磷酸盐缓冲溶液(PBS)
反复洗涤、离心。加入75％乙醇，4℃固定过夜。加
200肛LRNA酶溶液(5mg／mL)，37、C作用30
min后，冰浴终止。细胞悬液加等体积的PI(50弘g／
mL)避光染色，4℃放置30min。将样品放人流式
细胞仪的样品室，以激发波长488nm测定细胞周
期。每组设4个平行孔，实验重复3次，取12孔平均
值统计凋亡率和细胞周期。
1．5统计方法：采用t检验，用软件SPSS11．5处理。
2结果
2．1 红三叶总异黄酮对MCF一7细胞体外增殖影
响的量一效关系：MTT结果显示，低质量浓度红三
叶总异黄酮(<25．0tlg／mL)对MCF一7细胞表现
轻微促细胞增殖作用，高质量浓度时表现为抑制作
用，且随着质量浓度的升高呈明显的量一效关系(见
表1、2)。
表1红三叶总异黄酮对MCF一7细胞存活率的影响
(；±s，开一20)
Table1 EffectofredclovertotalisoflavonesonMCF一7
cellssurvivalr te(；±s，n一20)
组别
p／ 存活率／％
(陌·mL一1)24h 48h 72h 96h
与对照组比较：’P<0．05一P
(；±S，n一20)
Table2 Effectofredclovertotalisoflavonesonproli—
ferationOfMCF一7cellstreatedfor72h
(xis，n一20)
与对照组比较：一P
见，红三叶总异黄酮作用48、96h后，细胞凋亡指数
明显高于溶剂对照组。红三叶总异黄酮作用48、96
h组细胞凋亡率分别为(8．49±1．07)％、(13．28±
2．07)％，而溶剂对照组的凋亡指数分别为(2．82±
1．34)％、(3．02±1．26)％。差异有统计学意义(P<
0．05)，见表3。
2．3 流式细胞仪分析结果：流式细胞仪分析显示，
100／-g／mL红三叶总异黄酮作用于MCF一7细胞
48、96h，细胞凋亡率显著高于溶剂对照组(P<
0．05)，见表3。红三叶总异黄酮作用72h，MCF一7
细胞产生明显的亚G。期峰。同溶剂对照组比较，G：／
M期细胞百分比增加，G。／G。期细胞百分比下降，S
期细胞两者比例相近，细胞滞留于G。／M期。处理
万方数据
·234· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月
组凋亡细胞占9．32％。见表4。
表3红三叶总异黄酮对MCF一7细胞凋亡率的影响
Table3 Effectofredclovertotalisoflavones
onapoptosisfMCF一7cells
与对照组比较：+P
周期分布的影响
Table4 Effectofredclovertotalisoflavones(treated
for72h)oncellcyclesofMCF一7cells
与对照组比较：。P
红三叶为优良饲料和牧草，含有植物雌激素，其
有效成分为异黄酮类[i’2]，具有弱雌激素作用、抗氧
化作用、抗癌作用等，国外民间应用其花、种子、植株
及根部制膏、浸膏、糊剂、煎剂和泡茶饮用，能有效地
预防和治疗动脉硬化、冠心病、妇女更年期综合征、
骨质疏松、乳腺癌、前列腺癌、肥胖症等疾病[3~6]。近
来的研究发现，异黄酮类对肿瘤细胞的影响是多途
径、多机制的，除具有雌激素样作用外，另一条重要
的途径是影响细胞周期，通过诱导细胞凋亡抑制细
胞增殖。
MCF一7细胞为雌激素受体阳性(ER+)细胞
株之一。本实验结果提示，低质量浓度红三叶总异黄
酮(<25．0弘g／mI。)对MCF一7细胞表现出轻微促
增殖作用，高质量浓度时表现为抑制作用，且随着质
量浓度的升高呈明显的量一效关系。与NakagawaH
等∞峙艮道一致，分析可能的原因是，红三叶总异黄酮
的不同成分有雌激素活性或抗雌激素作用，在低、高
剂量时，与ERa、ER／3有不同的亲和力，通过不同的
胞内信号途径，刺激或抑制雌激素依赖性乳腺癌细胞
株MCF一7增殖。而高剂量时，因其中活性成分的化
学结构与雌二醇相似，可与胞内的雌激素受体结合，
启动TGF—t?1信号转导途径，上调P53、P21等抑癌
蛋白的合成，下调C—myc的转录；上调Bax蛋白、下
调Bcl—XL蛋白及激活caspase一3，使肿瘤细胞凋亡。
细胞凋亡是细胞的一种自杀过程，肿瘤无限制
增生的恶性生物学特征与肿瘤细胞凋亡减少有关，
增加肿瘤细胞凋亡是一种有效治疗肿瘤的手段[7’8]。
本实验通过TUNEL法，光镜下可见，随药量增大，
抑制作用增强，细胞凋亡也逐渐明显。流式细胞仪分
析显示，红三叶总异黄酮组MCF一7细胞滞留于G：／
M期，出现明显的亚G。期峰[凋亡细胞占(9．32±
0．42)％]。上述实验结果表明，红三叶总异黄酮对
MCF～7细胞生长有抑制作用，其机制与诱导癌细胞
凋亡、阻滞细胞周期进程有关。
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万方数据
红三叶总异黄酮对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响
作者： 尹春萍， 樊龙昌， 何俊文， 刘妙娜， 王月琴， 张滋洋， YIN Chun-ping， FAN Long-
chang， HE Jun-wen， LIU Miao-na， WANG Yue-qin， ZHANG Zi-yang
作者单位： 尹春萍,刘妙娜,王月琴,YIN Chun-ping,LIU Miao-na,WANG Yue-qin(华中科技大学同济医学
院,药学院,湖北,武汉,430030)， 樊龙昌,何俊文,张滋洋,FAN Long-chang,HE Jun-
wen,ZHANG Zi-yang(华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科,湖北,武汉,430030)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(2)
被引用次数： 6次
参考文献(8条)
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