全 文 ：中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年lo月·1507·
·药理与临床·
苦参碱诱导肺腺癌A549细胞凋亡及对人端粒酶逆转录酶表达的影响
钟 梁，刘北忠’，郝坡，刘 畅，王东生，王春光
(重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室，重庆400016)
摘要：目的观察苦参碱诱导肺腺癌A549细胞凋亡及对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达的影响。方法
以终质量浓度为0．1、0．2、0．4、0．6mg／mL的苦参碱作用肺腺癌A549细胞48h后，通过台盼蓝拒染法计数细胞
的生长抑制率；以终质量浓度为0．2mg／mL的苦参碱作用A549细胞48、72、96h后，经透射电镜和DNALadder
实验了解到细胞凋亡的发生．PCR—TRAP法检测端粒酶活性。实时RT—PCR检测hTERT的mRNA表达水平。
结果 各种质量浓度的苦参碱作用A549细胞48h后，均显著抑制细胞的增殖且呈浓度依赖性；0．2mg／mL的苦
参碱作用A549细胞不同时间后，经透射电镜形态学检测和DNALadder实验，均显示A549细胞发生了凋亡改
变；0．2mg／mL的苦参碱作用A549细胞48h后，端粒酶活性明显受抑。hTERTmRNA表达显著降低。结论苦
参碱能抑制肺腺癌A549细胞的生长并诱导其凋亡．其机制可能与下调hTERT基因表达，抑制端粒酶活性，破坏
端粒稳定性有关。
关键词：苦参碱；肺腺癌A549细胞，细胞凋亡；人端粒酶逆转录酶(hTERT)
中图分类号：R285．5}R733．7文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)10—1507一04
Effectsofmatrineo inductionofcellapoptosisandexpressionofhTERTgene
inlungadenocarcinomacellineA549
ZHONGLiang，LIUBei—zhong，HA0Po，LIUChang，WANGDong—sheng，WANGChun—guang
(KeyLaboratoryofLaboratoryMedicalDiagnostics，MinistryofEduca ion，
ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectsofmatrineo theinductionofapoptosisinlung
adenocarcinomaellineA549andtheexpressionofthehumantelomeraseev rsetransscriptase
(hTERT)gene．MethodsAftertheA549lungadenocarcinomacellsweretreatedwithmatrineat0．1，
O．2，O．4，and0．6mg／mLfinalconcentration，respectively，thenumberof iablecellswasascertainedby
trypanbluedyexclusiontest．AfterA549cellsweretreatedwithmatrineof0．2mg／mLfinal
concentrationfor48，72，and96h，respectively，morphologicalchangesofapoptoticcellswereobserved
byelectronicmicroscopyandDNAladderassay．thetelomeraseactivitywasanalyzedbyPCR—TRAPassay
andhTERTmRNAexpressionwasdetectedbyreal—timeRT—PCR．ResultsThevariousconcentrationof
matrinehadasignificantnhibitionontheproliferationofA549cellsinadose—dependentman er．The
resultsfromelectronmicroscopyandDNALaddershowedthatapoptosisccurredintheA549cellsby
treatedwith0．2mg／mLmatrineatthedifferenttimes．AtierA549cellsweretreatedwith0．2mg／mL
matrinefor48h，theresultsofquantitativeRT—PCRandPCR—TRAPrevealedthatthe xpressionof
hTERTmRNAwasignificantlyinhibitedbymatrinea dtelomeraseactivitydecreased．Conclusion
MatrinecouldinhibitthegrowthandinduceapoptosisfA549cells，itsmechanismmayberelatedothe
down—regulatingexpressionofhTERT，suppressionoftelomerase，andd structiontelomere．
Keywords：matrine；lungadenocarcinomaA549cell；cellapoptosis；humantelomeraseeverse
transscriptase(hTERT)
肺癌是常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类健
康。近年来，随着城镇工业化进程和人口老龄化的加
剧，以及人类生活环境的污染与破坏，世界范围内肺
癌发病率迅速上升，但目前有关药物防治肺癌的效
收稿日期：2007—12一16
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30300449)l国家中医药管理局资助项目(02—03ZP52)
作者简介：钟梁(197z一)，女．重庆市人，实验师，硕士，主要从事中药抗肿瘤的分子机制研究．
*通讯作者刘北忠Tell(023)66645783E—mail：liubeizhong@yahoo．COIll．Cgl

万方数据
中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10Jq
果并不理想。因此，开展中医药防治肺癌的研究工作
具有重要意义。
苦参碱是传统抗炎、抗心律失常的中药。对白血
病、肝癌等多种肿瘤具有抑制增殖及诱导凋亡作
用[1]。近年来，苦参碱潜在的肿瘤预防和治疗作用日
益受到关注，其抑癌机制众说纷纭，并且目前国内外
对苦参碱是否具有诱导肺癌细胞凋亡的作用及如何
启动凋亡级联反应尚不甚清楚。为了证实苦参碱的
抗癌效应及可能作用机制，本实验观察苦参碱诱导
肺腺癌细胞A549凋亡及对人端粒酶逆转录酶
(humantelomerasereversetranscrJptase，hTERT)
基因表达和端粒酶活性的影响，探讨其抑制A549
细胞生长的可能机制。
l材料与方法
1．1药品、试剂与细胞：苦参碱(广州明兴制药厂，
质量分数99％)，RPMI一1640培养基(美国
Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)，总
RNA提取试剂(美国invitrogen公司)；PCR试剂
(日本TaKaRa公司)；端粒酶TRAP—HybKit(华
美生物工程公司)。肺腺癌细胞A549细胞株购自上
海细胞生物研究所。
1．2方法
1．2．1细胞培养及处理：细胞在含10％胎牛血清
的RPMI一1640培养液，37℃、5％CO。孵箱中常规
培养。取对数生长期细胞，调浓度为2×105／mL，每
个培养瓶接种5mL进行试验。以终质量浓度为
0．1、0．2、0．4、0．6mg／mL的苦参碱加入各培养液
中作为药物处理组，同时以不加药的细胞培养液为
实验对照组，每组设3个复孔。
1．2．2台盼蓝拒染试验：不同质量浓度苦参碱处理
细胞48h后，经0．4％台盼蓝染液染色后用血球计
数仪于光镜下计数，死细胞被染成蓝色，活细胞则不
被染色，计数活细胞，计算抑制率。
抑制率=(1一实验组活细胞敬／对照组活细胞数)X
100％．
1．2．3电子显微镜观察：收集肺腺癌细胞A549细
胞1×106个，PBS洗涤2遍，4℃冷戊二醛固定2h，
体积分数为50％、70％、90％、100％梯度丙酮脱
水，618环树脂包埋，LKBNOVA切片，厚度0．05
pm，醋酸铀、枸椽酸铅双染色法染色，电镜下观察。
1．2．4DNA凋亡片断分析：参照Hermanm等[21
的方法，将苦参碱处理组和对照组细胞分别收集于
1．5mL离心管中，加入500pL细胞裂解液(10
mmol／LTris、10mmol／LEDTA、75mmol／L
NaCI、0．5％SDS、150／Jg／mL蛋白酶K)，置于
37℃水浴过夜至混合物变清亮；用苯酚一氯仿一异戊
醇(25t24t 1)抽提液提取DNA，离心弃上清，TE
缓冲液溶解，2％琼脂糖凝胶电泳，记录结果。
1．2．5端粒酶活性检测：采用PCR—TRAP法检测
端粒酶活性，培养细胞1×106个经4000r／min离
心10min，沉淀加入裂解液，取上清2pL做TRAP
反应模板。在PCR反应管中各加人反应混合物45
弘L，混匀，离心数秒，置25℃水浴30min。PCR仪
扩增，各孔加入杂交反应液反应，洗板，加显色剂
A、B各1滴，37℃避光显色10rain，加终止液，在
酶标仪上(450nm／595rim)测得吸光度(A)值，
判断端粒酶活性。
1．2．6实时荧光定量PCR检测hTERTm NA
表达：实时PCR反应体系25肛L，内含5×realtime
PCRBuffer5肚L，300vmol／LdNTP，5mmol／L
MgCl2，hTERT上下游引物各200nmol／L，相应荧
光探针120nmol／L，Taq酶1．25U，cDNA2弘L，
水补至25弘L。95℃、3rain后，按下述条件进行循
环：95℃、15S，65℃、25s，40个循环，每个样本设3
个平行反应。换取内参照PO基因(编码人酸性核
糖体磷酸蛋白)的引物和探针，按前述同样条件进
行RT—PCR检测。结果数据采用Rotor—GeneReal—
TimeAnalysisSoftware进行定量分析。hTERT
mRNA表达半定量以hTERT／PO的相对值来确
定，其中hTERT为端粒酶逆转录酶基因的拷贝数，
PO为内参照基因拷贝数。hTERT基因的引物序列
为上游引物：57一TGACACCTCACCTCACCCAC一
3’，下游引物：5-CACTGTCTTCCGCAAG—
TTCAC一3’，hTERT基因的探针序列为：57一
ACCCTGGTCCGAGGTGTCCCTGAG一37，扩增产
物95bp；内参照PO基因的引物序列为上游引物：
5-GGCGACCTGGAAGTCCAACT一37，下游引物：
5’一CCATCAGCACCACAGCCTTC一3’，内参照Po
基因的探针序列为：5-ATCTGCTGCA—
TCTGCTTGGAGCCCA一3’，扩增产物149bp。
1．2．7统计学方法：计量资料采用两小样本均数t
检验，完全随机设计资料方差分析，均采用
SPSSl0．0统计软件分析处理。
2结果
2．1苦参碱抑制肺腺癌A549细胞生长：台盼蓝拒
染计数结果显示不同质量浓度苦参碱对A549细胞
生长有抑制作用，其抑制率随剂量的增大而增加，呈
质量浓度依赖性。0．1mg／mL苦参碱作用A549细

万方数据
中革焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第lo期2008年lo月·1509·
胞48h后，对细胞的生长抑制率与对照组比较，差
异有显著性(P48h对A549细胞的IC5。约为0．4mg／mL。
衰1苦参碱对A549细胞的生长抑制作用(；士s，n----3)
Table1 Inhibitionofmatrineo growth
ofA549cellG+s。一=3)
与对照组比较l～尸<0．01
‘’P2．2苦参碱诱导肺腺癌A549细胞凋亡：透射电镜
下观察，对照组A549细胞染色质丰富，核规则或不
规则，核仁大，细胞器少，表面有短小微绒毛，具有典
型的癌细胞特征。而A549细胞经0．2mg／mL苦参
碱处理48h后，细胞体积缩小、细胞表面纤毛丧失、
细胞质固缩，核碎，可见凋亡小体形成。见图1。
同时，经0．2mg／mL苦参碱作用48、72、96h
后，肺腺癌A549细胞DNA琼脂糖凝胶电泳可见
凋亡细胞典型的梯状条带；对照组未出现此变化，仅
呈现正常细胞DNA条带。见图2。
对照组 苦参碱(0．2ms·mL‘1)
圈l肺腺癌A549细胞的电镜图
Fig．1Electronicmicroscopyoflung
adenocarcinomaA549cells
1一对照组 2～4-0．2mg／
mL苦参碱分别作用48、
72、96h组
1-controlg oup2～4-O．2
rrlg／mLmatrinetreatedfor
48，72，and96hgroups
图2肺腺癌A549细胞DNA片断
Fig．2DNALadderoflungadenocarcinomaA549cells
2．3苦参碱对A549细胞端粒酶活性与hTERT
mRNA表达水平的影响：与对照组相比，0．2rag／
mL苦参碱作用肺腺癌A549细胞48、72、96h后，
反映其端粒酶活性大小的A值(450nm／595nm)
与hTERTmRNA的表达水平均显著降低(P<
0．01)，见表2。
哀2苦参碱对A$49细胞端粒酶活性与hTERTmRNA的
影响G+s，厅=3)
Table2 Effectofmat—neOntelomeraseactivity
andexpressionofhTERTmRNA
inA549cells(；土s，一=3)
与对照组比较：一P‘。P3讨论
在正常人体细胞，端粒随细胞的分裂而进行性
缩短，当达到一定程度，细胞就衰老死亡。端粒酶则
是一种核糖核蛋白酶，由蛋白质和RNA组成，具有
逆转录酶的功能，能以自身的RNA为模板合成端
粒DNA，从而维持端粒的长度。端粒酶激活可使端
粒长度保持相对稳定，从而使细胞获得永生化，进一
步发生癌变，表明端粒酶的激活与恶性肿瘤的发生、
发展密切相关。
而hTERT与肿瘤的关系更为密切[3^]，在肿瘤
发生的早期就有表达，并随着肿瘤的进展，hTERT
在单个肿瘤细胞中的表达量不断增加，且表达
hTERT的肿瘤细胞数也相应增多，表明端粒酶在肿
瘤发生早期就有激活，并随肿瘤的发展而增加。由于
hTERT在正常肺组织细胞中不表达，而特异性地表
达于肿瘤细胞中，且在肿瘤的发生、发展中起重要作
用，因此hTERT有望成为新的肿瘤治疗靶点[5]。
苦参碱类生物碱是从中药苦参的干燥根中提取
的一类活性物质，主要包括苦参碱与氧化苦参碱等，
有关苦参碱类抗肿瘤机制的研究目前已成为抗癌中
药研究的一个热点。除增殖抑制与诱导分化外，苦参
碱尚能诱导肿瘤细胞的凋亡。司维柯等[6]用流式细
胞仪检测肝癌HepG2细胞的凋亡情况，未用苦参
碱前，细胞凋亡率只有1．4％，而用药后，细胞的凋
亡率大增并出现凋亡峰。钟声等[7]的研究表明，苦参
碱能诱导肺腺癌A549细胞凋亡及抑制细胞的增
殖，此反应与苦参碱药物剂量呈量效关系。

万方数据
·1510· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10月
目前，国内外尚无苦参碱与hTERT基因的相
互关系报道。鉴于hTERT在肿瘤发生发展过程中
的重要性，结合苦参碱对肺腺癌A549细胞具有诱
导凋亡作用，研究hTERT在苦参碱诱导肺腺癌
A549细胞凋亡中的表达情况，必将有助于探讨苦
参碱抑制A549细胞生长的可能机制。
在本实验研究中，观察了苦参碱对肺腺癌
A549细胞的生长抑制与促进凋亡作用，并研究了
凋亡过程中端粒酶活性与hTERTmRNA表达量
的变化，探讨其可能的抗肿瘤机制。结果显示，电镜
下肺膑癌A549细胞经0．2mg／mL苦参碱处理
48h后，细胞表现凋亡细胞的特征性形态变化，细
胞体积缩小、细胞表面纤毛丧失、细胞质固缩。核碎
裂，可见凋亡小体形成。同时，经0．2mg／mL苦参
碱作用后肺腺癌A549细胞DNA片断呈现典型的
梯状条带，进一步证实了苦参碱可诱导A549细胞
凋亡。端粒酶活性测定与hTERTmRNA表达量的
改变，则提示苦参碱可能通过下调肺腺癌A549细
胞hTERT基因表达，抑制端粒酶活性，破坏端粒酶
稳定性而促进肺癌细胞凋亡。
本研究提示，苦参碱抗肺腺癌A549细胞的可
能机制是通过下调hTERT基因的表达，抑制端粒
酶活性，破坏端粒稳定性而导致细胞凋亡的发生。抗
端粒酶治疗已成为从分子水平上治疗肺癌的一种新
手段，从天然中药库中筛选并制备有效的端粒酶抑
制剂将可能为肺癌的临床治疗开辟新的途径。
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小檗碱与梓醇及其配伍对胰岛素抵抗3T3一L1脂肪细胞
葡萄糖转运子4蛋白及C—Cbl相关蛋白表达的影响
陈 立，杨明炜‘，汪忠煜，刘艳娟，陆付耳，黄先英
(华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合研究所．湖北武汉430030)
摘 要：目的 观察梓醇与小檗碱及其配伍对胰岛素抵抗3T3．L1脂肪细胞葡萄糖消耗及这一过程中葡萄糖转运
子4(Glut4)和C—Cbl相关蛋白(CAP)表达的影响。方法采用高糖联合高胰岛素诱导3T3一L1脂肪细胞产生胰
岛素抵抗(IR)，分别给予小檗碱、梓醇、小檗碱+梓醇、盐酸罗格列酮进行干预。以葡萄糖氧化酶法检测培养液中
葡萄糖消耗量．以WesternBlotting法检凋Glut4和CAP蛋白的表达。结果与模型组相比，小檗碱能增加培养液
中葡萄糖的消耗。但对Glut4蛋白的表达无影响；梓醇、小檗碱+梓醇均能显著增加培养液中葡萄糖的消耗，并使
细胞中Glut4蛋白的表达增强．且小檗碱+梓醇组的效应优于梓醇组及小檗碱组；与模型组相比，小檗碱与梓醇及
其配伍对CAP的表达没有显著性影响。结论小粟碱、梓醇及其配伍能改善IR3T3一L1脂肪细胞的胰岛紊活性，
其作用机制与罗格列酮不同。
关键词：梓醇I小襞碱，3T3一L1l葡萄糖转运子4(Glut4)lC—Cbl相关蛋白(CAP)
中围分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)10—1510—05
收稿日期：2008．01—31
基金项目：湖北省卫生厅2004年度中医药中西医结合课题
作者简介；陈立(1980一)．男．湖北襄樊人，在读研究生，研究方向为中西医结合内分泌专业．
Tel：(027)83663304Fax：(027)83663237E—mail：chenlimail@163．corn
·通讯作者杨明炜Tel：(027)83663275E—mail：mwyang@tjh．tjmu．edu．cn

万方数据
苦参碱诱导肺腺癌A549细胞凋亡及对人端粒酶逆转录酶表达
的影响
作者： 钟梁， 刘北忠， 郝坡， 刘畅， 王东生， 王春光， ZHONG Liang， LIU Bei-zhong，
HAO Po， LIU Chang， WANG Dong-sheng， WANG Chun-guang
作者单位： 重庆医科大学,临床检验诊断学教育部重点实验室,重庆,400016
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(10)
被引用次数： 9次

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