全 文 ：·药材与资源·
中国不同地区绞股蓝 ITS序列分析
蒋玲艳 ,郭志刚 ,王 　翀 ,赵桂仿 3
(西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室 西北大学生命科学学院 ,陕西 西安 　710069)
摘 　要 :目的 　比较中国不同地区绞股蓝的 nrDNA ITS 碱基序列的差异 ,以期分析绞股蓝的地理分布与 ITS 基因
型的相关性 ,为我国不同地区绞股蓝的鉴别提供分子依据。方法 　PCR 克隆测序 ,MegAlign (DNASTAR) 软件对
序列进行对位排列 ,PAU P410b10 软件进行系统发育分析 ,构建最大简约树。结果 　绞股蓝 ITS 区长度为 658～
659 bp ,变异位点为 8148 % ,信息位点为 2172 %。不同地区的样品在碱基的量、信息位点的碱基位置和遗传距离等
方面存在一些差异。系统发育分析表明 ITS 基因型与绞股蓝的地理分布具有一定的相关性 ,但也有部分不一致 ,
可能主要是因为绞股蓝种内复杂的倍性。结论 　ITS 序列可作为中国不同地区绞股蓝的一种良好的分子标记 ,而
要确定不同地区的绞股蓝合理的亲缘关系还需要结合其他方面的证据。
关键词 :绞股蓝 ; ITS 克隆测序 ;分子鉴定
中图分类号 :R28217 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0721123205
ITS Sequence analysis of Gynostemma penta phyllum from different habitats in China
J IAN G Ling2yan , GUO Zhi2gang , WAN G Chong , ZHAO Gui2fang
( Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China , Minist ry of Education ,
College of Life Science , Northwest University , Xi′an 710069 , China)
Abstract : Objective 　By comparing t he difference for ITS sequences of Gy nostem m a pent a p hy l l um
f rom different habitat s in China , to investigate t he correlation between ITS genotype and geograp hic loca2
tion and provide molecular evidence for identification of G1 pent a p hy l l um f rom different habitat s in China1
Methods 　PCR Clone sequencing , sequence alignment s were performed using MegAlign (DNASTAR) ,
p hylogenetic analyses were conducted using PAU P410b10 by maximum parsimony (MP) criteria1 Results
The length of ITS region varied f rom 658 to 659 bp1 The proportion of variable sites is 8148 % and the p ro2
portion of parsimony information (parsim2info) sites is 2172 %1 Some differences in t he base content s , po2
sition of parsim2info sites , and genetic distance were detected f rom samples collected f rom different habi2
tat s1 Phylogenetic analysis showed some correlation between ITS genotype and geograp hic location of G1
pent a p hy l l um ; but t here were also some discrepancies between geograp hical location and affinity , which
may mainly caused by t he complex cytotypes in G1 pent a p hy l l um1 Conclusion 　The nrDNA ITS could be a
good marker to distinguish G1 pent a p hy l l um f rom different habitat s in China , but t he rational affinity
could be determined t hrough associating t hese ITS data with ot her evidence1
Key words : Gy nostem m a penta p hy l l um ( Thunb1 ) Makino ; ITS clone sequencing ; molecular identifi2
cation
　　绞股蓝属 ( Gy nostem m a Blume1 )为葫芦科 (Cu2
curbitaceae)多年生草本植物 ,全属共有 16 种 2 变
种 ,主要分布于中国秦岭、长江以南广大地区及朝
鲜、日本等地[1 ,2 ] 。绞股蓝 Gy nostem m a pent a p hy l2
l um ( Thunb1 ) Makino , 又名五叶参、七叶参、七叶 胆、小苦草、遍地生根等 ,是绞股蓝属内分布最广、资源最丰富的药用植物 ,在我国 17 个省区均有分布 ,种的分布区即属的分布区。作为我国常用中药 ,绞股蓝具有悠久的应用历史 ,最早记载于公元 1046 年朱棣所著的《救荒本草》中 ,作为充饥的野菜食用 ,其
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3 收稿日期 :2008211219　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :教育部“长江学者和创新团队发展计划”资助项目
作者简介 :蒋玲艳 (1984 —) ,女 ,河北省沧州人 ,在读硕士 ,研究方向为植物分子系统与进化。E2mail :jianglingyan8406 @1631com3 通讯作者　赵桂仿　Tel : (029) 88305207 　E2mail :zhaogf @nwu1 edu1cn
后 ,明代徐光启在《农政全书》中收录了《救荒本草》
的有关绞股蓝的全部文字。绞股蓝含有多种药用成
分 ,如绞股蓝皂苷、黄酮、维生素、氨基酸、多糖、微量
元素等 ,现代医学临床研究表明其具有调血脂、抗肿
瘤等重要的药理作用 ,并且具有无毒、廉价、资源丰
富等优点 ,市场现已开发出多种绞股蓝产品 ,如绞股
蓝茶、绞股蓝可乐、绞股蓝含片等[2～5 ] 。由于生态环
境和人为因素的影响 ,不同地区的绞股蓝遗传成分
产生分化 ,从而影响其化学成分和临床药效 ,因而从
其遗传本质对不同产地的绞股蓝进行分子鉴定显得
非常重要。
近年来 ,随着分子生物学的发展 ,各种分子标记
技术和 DNA 序列分析技术等在植物种源鉴定、药
材真伪鉴别等方面发挥了重要作用。ITS (internal
t ranscribed spacer) 是介于 18S 和 26S 之间的非编
码内转录间隔区 ,包含一个 518S 编码区。其具有进
化速率快 ,片段长度小 (在大多数被子植物中都小于
700 bp) ,由于协同进化 (concerted evolution) 使得这
个片段在不同的重复单元之间十分一致[6 ]等优点 ,近
年来被广泛地应用于解决较低分类单元层次上的植
物系统发育问题[6～9 ] ,包括近缘属间关系 ,属下种间
的关系[10 ,11 ] ,甚至种下居群间的关系[12 ] 。本实验采
用 PCR 克隆测序技术 ,测定了 13 个来自中国不同地
区的绞股蓝的 ITS 序列 ,并对序列进行了分析 ,以期
分析绞股蓝的地理分布与 ITS基因型的相关性 ,为我
国不同地区绞股蓝的鉴别提供分子依据。
1 　材料与方法
111 　实验材料 :本实验研究材料绞股蓝于 2005 年
7～10 月分别采自湖南、湖北、贵州、云南、四川、浙
江、安徽、江苏等 8 个省区共 13 个地区。野外采集
新鲜、完整的植物幼嫩叶片 ,置于盛有硅胶的塑胶袋
中干燥保存 ,每个地区随机采集 10～15 个不同个
体 ,个体间距离尽量保持在 5 m 以上。同时在每个
采样点制作标本 ,记录样品的采样地位置及采样时
间等信息 ,标本由中国科学院昆明植物研究所陈书
坤研究员与西北农林科技大学陈彦生研究员鉴定。
所有用于分析的材料来源及编号见表 1。
112 　DNA 提取 :以硅胶快速干燥的植物叶片为材
料 ,参照改进的 CTAB 法[ 13 ]提取总 DNA ,并作适当
修改。
113 　PCR 扩增及回收纯化 :实验中使用 ITS 通用
引物 ITS4 (5′23′) TCCTCCGCT TA T T GA TA T GC
和 ITS 5 ( 5 ′2 3 ′) GGAA GTAAAA GTCGTAA 2
CAA GG[14 ] 对目的片段进行扩增和测序。PCR扩
表 1 　绞股蓝材料来源
Table 1 　Resources of G1 penta phyllum
来 　源 编号 纬度/°N 经度/°E 海拔/ m 序列号
云南省大理市苍山 　　 DL 25141 109107 2 560 EU910158
云南省昆明市黑龙潭 　 KM 25108 102144 1 943 EU910164
贵州省梵净山 　　　　 FJ S 27150 108146 538 EU910160
四川省峨眉山 　　　　 EM 29135 103117 882 EU910159
四川省成都市青城山 　 CD 30154 103134 924 EU910157
湖南省吉首市高光界 　 J S 28139 110104 840 EU910163
湖南省株州市桃源洞 　 ZZ 26129 114101 651 EU910169
湖北省房县 　　　　　 FX 31154 110130 700 EU910161
湖北省十堰市赛武当山 SY 32126 110145 936 EU910167
河南省灵宝市灵湖 　　 LB 34152 110185 469 EU910165
河南省西峡县伏牛山 　 XX 32148 112112 800 EU910168
浙江省杭州市灵隐 　　 HZ 30114 120105 132 EU910162
江苏省南京市紫金山 　 NJ 32103 118149 133 EU910166
增反应在 P TC DNA Engine PCR 仪上进行。反应
总体积为 20μL ,其中 2μL 10 ×PCR Buffer (含 20
mmol/ L Mg2 + ) , 014 μL dN TP (10 mmol/ L ) ,018
μL T aq DNA 聚合酶 (2 U/μL) , ITS4 和 ITS5 引物
各 015μL (10μmol/ L) ,DNA 模板约 50 ng ,扩增程序
为 :94 ℃预变性 5 min ,94 ℃变性 45 s ,56 ℃退火 45 s ,
72 ℃延伸 1 min ,35 个循环 ;最后 72 ℃延伸 7 min。
扩增产物在含有 EB 的 118 %琼脂糖凝胶中电
泳分析 ,80 V 电泳 3 h ,目的条带从琼脂糖凝胶中切
下 ,用 Gel Ext raction Mini Kit 试剂盒回收 ,操作步
骤见说明书。
将回收纯化后的扩增产物在 118 %琼脂糖凝胶
中电泳 ,分析其浓度 ,确定连接反应中外源插入片段
的量。
114 　扩增产物的克隆与测序 :回收后的 PCR 产物 ,
用宝生物工程有限公司的 pMD182T Vector 连接试剂
盒进行连接 ,热激法转化大肠杆菌感受态细胞
Top 10 ,用含有 50μL/ mL 的氨苄青霉素的 LB 平板
(预先涂 x2gal 和 IPTG) 筛选阳性克隆。重组质粒的
提取采用碱裂解法进行 ,提取的重组质粒进行 PCR
鉴定[15 ] 。每个地区的材料选取 5～10 个含有目的片
段的克隆进行双向测序。测序反应由上海生工生物
工程有限公司完成 ,测序引物为 T7 + / M13 - 。
115 　序列分析和系统发育树的构建 :用 MegAlign
(DNASTA R)软件对序列进行对位排列 ,然后手工
适当校正。ITS21 及 ITS22 的范围根据 GenBank 中
已发表的苦瓜属 ( M omordica L1 ) nrDNA ITS 序列
确 定 ( GenBank 检 索 号 为 A Y606266 ) 。用
PAU P410b10 软件[ 16 ] 进行系统发育分析。空位
(gap)被处理为缺失 (missing) 。最大简约性分析采
用如下选项完成 ,即树二组重新连接 ( TBR) 、启发
·4211· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
式搜索 ( Heuristic search) 、多重性选择 ( Muhrees
option) 、ACCTRAN 优化和 100 次随机附加的重
复。利用自展法 (Boot st rap ,1 000 次重复) 检验各
分支的置信度。
2 　结果与分析
211 　不同地区绞股蓝 ITS 序列比较 :本实验测得
中国 13 个地区的绞股蓝的 ITS 区 (包括 518S rD2
NA)序列的长度范围 658～659 bp ,仅 1 bp 差异 ,长
度变异很小。同一地区的不同克隆间序列高度一
致 ,单一的碱基置换可能由于 T aq 酶的错误 ,因而
忽略不计。这样 ,每个地区的绞股蓝仅有一种主要
的克隆类型。当空位 ( Gap) 作缺失处理时 , ITS 区
全序列排序后的长度为 660 位点 ,其中有 56 个变异
位点 ,18 个为系统发育的信息位点 ,分别占 8148 %
和 2172 %。ITS1 的长度均为 226 bp ,排序后长度
也为 226 bp ,含 7 个信息位点 (表 2) 。ITS2 的长度
范围为 269～270 bp ,排序后长度为 271 bp ,含 11 个
信息位点 (表 2) 。不同地区样品的 G+ C的量基本相
同 , ITS1 为 6618 % ～ 6812 % , ITS2 为 5510 % ～
5710 %。518S rDNA 高度保守 ,长度均为 163 bp ,在
13 个地区的样品中没有变异位点。(各地区 ITS1、
ITS2 长度和序列中的 G + C 质量分数见表 3) 。本
实验测得的序列已提交至 GenBank 数据库 ,序列号
见表 1。
212 　系统发育分析 :中国 13 个地区的绞股蓝样品
相互间的遗传距离见表 4。云南大理的样品 (DL )
和贵州梵净山的样品 ( FJ S) 之间遗传距离最大 ,为
01044 ;遗传距离最小的是湖北房县 ( FX) 的样品和
湖南株洲 (ZZ) 的样品 ,为 01002。基于 ITS 序列中
国 13 个地区的绞股蓝样品的系统发育树见图 1。
在系统发育树中 ,13 个地区样品以较高的支持率聚
为两个主要的大支 ,其中一支包含来自云南、河南、
湖北、湖南、江苏等 7 个地区的样品 ,云南两个地区
的样品 ( KM 和 DL) 和河南两个地区的样品 (LB 和
XX)都分别以较高的支持率 (100 %、81 %) 首先聚成
一支 ,显示其较近的亲缘关系。另一支包含来自四
川、贵州、湖南、湖北等 5 个地区的样品 ,支持率为
100 %。浙江杭州的样品 ( HZ)独立于两个主要大支
外 ,单独成支。各地区样品间的亲缘关系基本与它
们的地理分布相一致 ,但是也有例外 ,如系统发育树
中吉首的样品 (J S) 位于第一大支 ,与位于第二大支
的与其地理位置较近的 ZZ 和 FJ S 表现出较远的亲
缘关系 ;杭州的样品 ( HZ) 也与其地理位置近的 NJ
样品表现出较远的亲缘关系。
表 2 　13 个地区绞股蓝样品的 ITS序列信息位点
Table 2 　Comparison of parsim2info sites in ITS1 and ITS2 sequence from 13 samples of G1 penta phyllum
来源编号
ITS1
18 80 89 95 97 160 189
ITS2
402 412 448 561 570 585 588 628 638 642 646
DL A T T G G G T A A T C A C T C G G T
KM G 3 3 3 3 3 3 G 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
FJ S 3 C G T 3 T 3 G G C 3 G T C 3 A A C
EM G C G T 3 T 3 G G C 3 G T C 3 A A C
CD G C G T 3 3 3 G G C 3 G T C 3 A A C
J S 3 3 3 3 3 3 C G 3 3 3 3 3 3 3 A 3 C
ZZ A C G 3 3 T 3 G G C 3 G T C 3 A A C
FX A C G T 3 T 3 G G C 3 G T C 3 A A C
SY 3 3 3 T 3 3 C G 3 3 3 3 3 3 T A 3 C
LB A C G 3 T 3 3 G 3 C T 3 T 3 3 A A C
XX A C G 3 T 3 3 3 3 3 T 3 T 3 T A A C
HZ A C G T 3 T 3 G G 3 3 G T C 3 A A C
NJ 3 3 3 3 3 3 3 G 3 3 3 3 3 3 3 A 3 C
　　　上方的数字代表信息位点的位置　3 代表该位点碱基与 DL 相同
　　　Upper numbers indicate nucleotide position f rom upst ream of ITS sequence , asterisk ( 3 ) indicates identity to base composition of DL
sequence
3 　讨论
ITS 序列是近年来用于探讨植物种间变异和种
内变异以及近缘属间系统关系的重要分子标记。被
子植物的 ITS 区长度比较稳定 ,包括 518S rDNA 在
内 ,总长度为 600～700 bp ,特别易于扩增和测序。
被子植物 ITS 区又有核苷酸序列的高度变异性 ,屈
良鹄等[ 17 ]通过对不同生物类群的 ITS 序列 (自生物
学数据库)的比较得出 :被子植物大多数科属其 ITS
序列的种间差异值为 112 %～1012 % ,这对系统发
育研究都是较合适的范围。本实验测得中国 13 个
地区的绞股蓝样品在 ITS 区的碱基差异为 8148 % ,
高于一般的种内差异值 ,这表明不同分布区的绞股
·5211·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
表 3 　各地区绞股蓝 ITS序列长度及 G+ C的量
Table 3 　Length and G+ C contents of ITS1 and ITS2
of G. penta phyllum from various habitats
地区编号 ITS/ bp ITS1长度/ bp G + C/ %
ITS2
长度/ bp G + C/ %
DL 658 226 661 8 269 5518
KM 658 226 671 7 269 5518
FJ S 659 226 661 8 270 5617
EM 659 226 681 1 270 5710
CD 659 226 671 7 270 5613
J S 658 226 671 7 269 5517
ZZ 659 226 671 3 270 5617
FX 659 226 671 3 270 5617
SY 658 226 671 7 269 5514
LB 658 226 671 3 269 5510
XX 658 226 671 7 269 5510
HZ 659 226 661 9 270 5613
NJ 658 226 681 2 269 5517 蓝各居群间已产生了较大的遗传分化。绞股蓝雌雄异株 ,性比偏雄 ,有有性繁殖和无性繁殖两种繁殖方式 ,但在自然条件下以营养繁殖为主[ 3 ] ,居群内部占优势的克隆生长导致其不同居群间基因交流减少 ,从而产生了较大的遗传分化。这在前人研究中已经得到证实 ,研究者分别运用 ISSR 和 A FL P 分子标记对绞股蓝的遗传多样性进行研究 ,结果均表明 ,绞股蓝的遗传变异主要存在于居群间 ,居群间遗传分化显著[18 ,19 ] 。本研究运用的 ITS 序列在绞股蓝种内显示出较高的变异 ,这为不同地区的绞股蓝鉴别提供了新的手段。从 ITS 序列分析的结果来看 ,不同地区样品在碱基的量、信息位点的碱基位置和遗传距离等方面存在一些差异。如 :云南地区的样品( DL 、KM ) 在6 3 8和6 4 6 bp处有特异性的信息位
表 4 　各样品间的遗传距离
Table 4 　Genetic distance among samples
DL KM FJ S EM CD J S ZZ FX SY LB XX HZ NJ
DL
KM 01 005
FJ S 01 044 01042
EM 01 023 01019 01026
CD 01 025 01019 01028 01008
J S 01 011 01009 01042 01022 01023
ZZ 01 022 01020 01022 01005 01006 01020
FX 01 022 01020 01022 01005 01006 01020 01002
SY 01 018 01014 01050 01026 01028 01010 01028 01028
LB 01 022 01020 01037 01020 01018 01020 01018 01030 01028
XX 01 023 01025 01042 01025 01023 01025 01020 01020 01030 01017
HZ 01 026 01025 01030 01012 01014 01025 01003 01008 01033 01023 01025
NJ 01 011 01006 01042 01018 01020 01009 01020 01020 01014 01020 01025 01 025
分支上的数字是 1 000 次重复抽样检测的 boot st rap 值
Numbers on branches are boot st rap values of 1 000 replications
图 1 　基于 ITS序列分析得到的严格一致树[ 步长为 65 ,一致
性指数( CI) 01 861 和维持性指数( RI) 01842]
Fig1 1 　Dendrogram of most2parsimonious ( MP) resulted from
ITS sequence ( tree length = 65 , CI = 01861 , RI =
01842) 点 ,分别为 G、T ;河南地区的样品 (LB、XX)在 97 bp处有特异性的信息位点 T (表 3) 。ITS 序列可作为鉴别来自不同产地的绞股蓝的参考。从系统发育树 (图 1) 中可以看出 ,各地区样品间的亲缘关系基本与它们的地理分布相一致 ,这表明 ITS 基因型与绞股蓝的地理分布具有一定的相关性。但是在系统树中吉首的样品 (J S)和杭州的样品 ( HZ)都与其地理位置近的样品表现出较远的亲缘关系 ,这又显示了其地理分布与亲缘关系的不一致。推测这种部分不一致性主要是由于绞股蓝种内复杂的倍性。细胞学资料表明 ,绞股蓝有二倍体、四倍体、六倍体和八倍体 4 种细胞型 ,不同倍性的植物在形态上难以区分[20 ,21 ] ,但不同倍性的植物对生态环境的应对方式和居群间基因交流程度不同。目前还没有对该种植物进行多倍体起源的研究报道 ,其多倍体的性质 (同源 vs 异源) 还不清楚。ITS 区序列以同步进化 (concerted evolution) 的特定方式进
化 ,这种进化方式受杂交和多倍化等多种因素的影
·6211· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
响[22 ] 。目前的研究表明多倍体内 ITS 区序列的进
化十分复杂 (尤其在异源多倍体中) ,祖先的 ITS 区
序列在多倍体内可能共存[23 ] ,也可能朝着某一祖先
的序列进化[24 ] 。绞股蓝种内有 4 种倍性 ,其多倍体
复杂的起源 (种内还是种间起源) 与扩散方式 ,以及
不同于二倍体的基因交流方式和复杂的 ITS 同步
进化方向可能导致其 ITS 基因型与地理分布的差
异。应用分子生物学方法对绞股蓝多倍体的来源和
性质进行研究是十分必要的。鉴于绞股蓝 ITS 基
因型与地理分布的部分不一致性 ,要确定不同地区
的绞股蓝合理的亲缘关系还需要结合其他方面的证
据 ,从而达到准确的分子鉴定的目的。
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高山红景天叶肉原生质体分离培养与植株再生
刘剑锋 ,程云清 ,陈智文 3
(吉林师范大学 ,吉林 四平 　136000)
摘 　要 :目的 　利用高山红景天组培苗叶片分离得到原生质体 ,经培养后获得再生植株。方法 　研究了外植体前
期预处理、外植体大小、酶液配比、酶液中甘露醇浓度等影响原生质分离的相关因素 ,确定最优分离条件。结果
用于原生质体分离的外植体无需黑暗预培养便可进行原生质体分离 ,外植体叶片长度大于 115 cm 为宜。获得原
生质体的酶液组成为 :110 %纤维素酶 Onzuka R210 + 015 %果胶酶 Macerozyme R210 + 10 mmol/ L CaCl2 ·2 H2 O +
011 % MES + 017 mmol/ L KH2 PO4 + 015 mol/ L 甘露醇 ,在 25 ℃条件下酶解 4 h ,原生质体最高产量为 39143 ×
106 个/ g 鲜质量 ,原生质体活力为 7816 %。原生质体培养基为 1/ 2MS + 1 mg/ L 2 ,42D + 015 mg/ L ZT + 015 mol/ L 甘
露醇 + 500 mg/ L 水解酪蛋白。浅层培养 40 d 时形成小愈伤组织。愈伤组织在 MS + 1 mg/ L 62BA + 011 mg/ L NAA
·7211·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
3 收稿日期 :2008210219　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金项目“药用植物高山红景天优良种质筛选与倍性创新研究”(30801516) ;吉林省教育厅“十一五”科学技术
研究项目“高山红景天四倍体的诱导与鉴定 (吉教科合字 2007 第 367 号)”
作者简介 :刘剑锋 (1976 —) ,男 ,湖北黄石人 ,吉林师范大学生命科学学院副教授 ,硕士生导师 ,从事细胞生物学的教学研究工作 ,已发表
论文 30 余篇。Tel : (0434) 3292019 　E2mail :jianfengliu1976 @1631com