全 文 ：中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10月·1493·
裹l 无机■瓷徽滤虞的清洗效果
Table1 Cleaningeffectsofinorganicceramic
micro—filtrationmembrane
当的条件下渗入容胀并破坏静电作用和化学键，再
通过水流冲刷去除。热水与清洗剂的交替清洗较好
地破坏了中间层和吸附层的结构，使清水通量在很
大程度上得以恢复。此外，在高温下NaCIO的氧化
性可能受到了某些限制，致使其清洗效果较热水+
NaOH低。因此，确定微滤膜的清洗方法为热水与
1％NaOH溶液交替清洗并伴有间歇、短时反向清洗。
3讨论
采用无机陶瓷微滤膜纯化虫草粗多糖溶液，工
艺可行、操作稳定。由试验确定微滤的操作条件为：
料液的pH值在7～8、温度为60℃，操作压差为
0．3～o．4MPa。在该条件下微滤处理虫草粗多糖溶
液，多糖收率较传统的醇提工艺高约30％，同时可
除去大部分不溶固体物和蛋白质胶体等大分子有机
物杂质。清洗结果表明，在伴有间歇、短时反冲洗的
操作方式下，采用80℃热水与1％NaoH溶液交替
对污染后的微滤膜进行清洗，可使膜的清水通量恢
复率达到90％以上。另外，微滤清洗和运行过程中
均建议采用带间歇、短时反冲洗式的操作方式。
参考文献：
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HPLC法测定小鼠血浆中杠柳毒苷的血药浓度
阙红玉，谢跃生，王跃飞，戚爱棣’，潘桂湘，刘 虹
(天津中医药大学中医药研究院教育部省部共建方剂学重点实验室，天津300193)
摘要：目的建立小鼠血浆中杠柳毒苷的HPLC测定方法．对其药动学进行研究。方法血浆样品中加人内标地
高辛．用甲醇沉淀蛋白一C。。固相萃取处理，氮气吹干后流动相复溶进样。色谱条件：色谱柱为AgilentZorbasS&C·8
柱(150mill×4．6mm，5pm)和保护柱AgilentZorbaxC18柱(12．5mm×4．6mm，5pm)；流动相：乙腈一水(25l
75)l体积流量：1．0mL／minl柱温：25℃l检测波长：220nlnI进样量：20pL。结果此法空白血浆中无内源性物质
干扰样品测定，血药浓度线性范围为0．02-2．0mg／L(r=0．9998)，最低定量限为0．02mg／L，平均提取回收率大
于81．8％，批内、批间精密度RSD均小于4．64％，准确度试验的结果在101．3％～111．7％。结论本方法简便，准
确．灵敏度高．并用于小鼠尾静脉注射杠柳毒苷的药时曲线研究。
关键词：杠柳毒苷}血药浓度l药动学；HPLC
中圈分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)10—1493—04
DeterminationofperiplocinconcentrationinmouseplasmabyHPLC
KANHung—yu，XIEYue—sheng，WANGYue—fei，Q1Ai—di，PANGui—xiang，LIUHung
(KeyLaboratoryofPharmacologyofTraditionalChineseMedicalFormulae，MinistryofEducationResearchCenter
ofTraditionalChineseMedicine，TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine．Tianjin300193，China)
收稿日期：2007—12-10
基金项目：天津市科技发展计划项目(05YFZJC01102)l天津市高等学校科技发展基金资助项目(20050310)I天津市卫生局中医、中西医
结合科研基金资助项目(2005072)I天津市科委应用基础研究计划项目(07JCYBJC01800)
作者简介：阚红玉(1982一)，女．河北人．天津中医药大学2006级硕士研究生，研究方向为药物分析．E—mail。khy820527@sina．corn
-通讯作者戚爱棘Tel：13803009082E-maillqiaidi@tjutcm．edu．cn

万方数据
·1494· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10月
Abstract：ObjectiveToestablishanaccuratendreliableHPLC—UVmethodforeterminationof
periplocinconcentrationinmouseplasmaandapplytOpharmacokineticstudies．MethodsThemouse
plasmaspikedwithdigoxinastheinternalstandardwaseproteinizedbymethanol，followedbysolid—
phaseextractionw thaC18extractioncartridge，boastedthextractedsolutionwithN2，andthenredis—
solvewiththemobilephase．finallyinjeetedthissolutionintotheHPLCinstrumentforde erminationUS—
ingaAgilentZorbasSB—C18column(150mm×4．6mm，5弘m)withacetonitrile—water(25：75)asmobile
phase，theflowratewas1．0mL／min，columntemperaurewas25℃，andUVdetectionwavelengthwas
220nm．ResultsTherewasnointernalsubstancei plasmainterferedwiththedeterminationofthesam—
pies．T‘helinearrangewasbetween0．02—2．0mg／L(r=0．9998)，thelowerlimitquantizationwas0．02
mg／L，theaveragerecoverywasmorethan81．8％，theRSDofprecisionwaslessthan4．64％，andthe
accuracywasbetween101．3％一111．7％．ConclusionThismethodiSconvenient，theresultiSaccurate，
andthesensitivityshigher．ItcouldbesuccessfullyappliedtOdeterminationofperiplocinconcentrationin
mouseplasmaduringitspharmacokineticandbioavailabilitystudiesandprovidingscientificbasis．
Keywords：periplocin；bloodco centration；pharmacokinetics；HPLC
杠柳毒苷又名杠柳苷、杠柳苷G、蘼萝毒苷，是
一种具有甾核和不饱和五元内酯环结构的甲型强心
苷‘¨，主要用于治疗慢性充血性心力衰竭‘引。杠柳毒
苷是香加皮中的重要效应成分[3]，同时也是香加皮
中的有毒成分[．]。临床上使用香加皮有不良反应和
致死病例的报道，这与人们对于杠柳毒苷的体内过
程认识不清楚导致用量过大、时间过长有密切关系，
所以，研究杠柳毒苷在动物体内的药动学过程对于
含香加皮中药制剂的安全使用具有重要的意义。本
实验建立了甲醇沉淀蛋白一固相萃取前处理小鼠血
浆样品，采用HPLC法测定杠柳毒苷血药浓度的方
法，为研究该药物在动物体内的动态变化过程提供
了依据。
l仪器与试药
Waters515高效液相色谱仪、Waters2487双
波长紫外检测器(美国Waters公司)，GilsonA孓
PECXli型全自动固相萃取仪(法国Gilson公司)，
8W型高速离心机(美国Tomos公司)，N—
EAVPTMlll氮吹仪(美国Organomation公司)，C18
型固相萃取小柱(天津双吉仪器有限公司)，微型旋
涡混合仪，AX205十万分之一天平(瑞士Mettler
Toledo公司)。
杠柳毒苷对照品(天津中医药大学中医药研究
院自制，质量分数大于98％)；地高辛对照品(中国
药品生物制品检定所，批号：100015—200308)；昆明
种雄性小鼠购白天津药物研究院，体质量(20±5)g。
乙腈(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)，
超纯水为Millipore超纯水净化系统制得。
2方法与结果
2．1 色谱条件：色谱柱为AgilentZorbasSB—C18柱
(150mm×4．6mm，5肛m)和保护柱AgihntZor—
baxC18柱(12．5mm×4．6mm，5弘m)；流动相：乙
腈一水(25l 75)；体积流量：1．0mL／min；柱温：
25℃；检测波长：220am；进样量：20弘L。
2．2对照品溶液和内标溶液的制备：分别精密称取
杠柳毒苷对照品10．4mg和内标地高辛10．2mg，
加适量甲醇配制成1．04mg／mL对照品储备液和
0．2弘g／mL内标溶液，4℃冰箱内保存备用。
2．3标准曲线的制备：取1．04mg／mL杠柳毒苷对
照品储备液适量，稀释成0．05、0．1、0．25、0．5、1．0、
2．5、5．0ng／mL系列对照品溶液，平行操作3份，进
样20pL测定，记录杠柳毒苷峰面积。以峰面积(y)
为纵坐标，质量浓度(C)为横坐标，得回归方程y=
22050C+674．74，r=0．9994。
2．4校正曲线的制备：取空白血浆样品0．25mL，
加入地高辛内标溶液0．05mL和系列杠柳毒苷对
照品溶液0．1mL，配制成0．02、0．04、0．1、0．2、
0．4、1．0、2．0弘g／mL含药血浆样品，按血浆样品处
理项下操作，测定，以杠柳毒苷与内标地高辛峰面积
比值(y)为纵坐标，以杠柳毒苷质量浓度(C)为横坐
标，得回归方程Y=0．1971 C+0．0148(r=
0．9995)，结果表明血浆中杠柳毒苷在0．02～2．0
／-g／mL线性关系良好。
2．5给药方法与样品采集：选取健康雄性小鼠40
只，随机分为5组，每组8只(每只小鼠作为一个取
血点，每组为一条药时曲线)。小鼠实验前12h禁食
不禁水。按1mg／kg给药，采用尾静脉注射方式给
药，自给药后2、5、10、15、20、30、40、60rain摘眼球
取血置于肝素化试管中，3000r／rain离心10min，
分离血浆，一20℃保存至测定。

万方数据
中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年lo月·1495·
2．6血浆样品处理：取小鼠血浆样品0．25mL置
离心管中，加入1mL甲醇，旋涡1min，4000r／min
离心10min，取上清液于50℃水浴氮气吹干，1mL
超纯水复溶，旋涡1min。上已预先经过1mL甲醇
和1mL水活化处理好的C，。型固相萃取小柱(规格
100rag)，上样保持1min，先用1mL40％甲醇洗脱
2次，每次0．5mL，弃去洗脱液，再用1mL甲醇洗
脱2次，每次0．5mL，收集洗脱液，于50℃水浴氮
气吹干，残渣以100pL流动相复溶，旋涡1min，
13000r／rain离心5min，取上清液20弘L，即得。
2．7 最低定量限的测定：取空白血浆0．25mL5
份，各加入内标地高辛溶液0．05mL和0．05pg／mL
杠柳毒苷对照品溶液0．1mL，按血浆样品处理项下
操作，测定，结果血浆中杠柳毒苷最低定量限为
0．02}tg／mL，RSD为5．13％。
2．8方法专属性试验：取小鼠空白血浆0．25mL；
空白血浆加入1．0pg／mL杠柳毒苷对照品溶液0．1
mL和10．2／zg／mL地高辛内标溶液0．05mL；取健
康小鼠尾静脉注射杠柳毒苷后的血浆样品，加10．2
／比g／mL地高辛内标溶液0．05mL，按血浆样品处理
项下方法处理，测定，得色谱图1。结果表明，该法处
理后小鼠空白血浆在杠柳毒苷和地高辛出峰处均无
内源性物质干扰，峰形良好，保留时间分别为15．4
rain和22．5rain。
2．9提取回收率的测定：取空白血浆，加杠柳毒苷
配制成质量浓度分别为0．04、0．4、2．0／zg／mL样品
3 6 9 12 15 18 2l
tinfin
A一空白血浆B-空白血浆中加人杠柳毒苷和地高辛C一血浆样品加地高辛1一杠柳毒苷2一地高辛
A-blankplasmaB-blankplasmaspikedwithperipiocinandigoxin
C-plasmasampleafterivadministrationspikedwithdigoxin1-periplocin2-digoxin
圈1血浆样品HPLC色谱圈
Fig．1HPLCChromatogramofplasmasample
各5份，处理，进样测定，记录杠柳毒苷峰面积 加入内标地高辛标对照品溶液0．05mL，处理，进样
(As)；另取质量浓度分别为0．04、0．4、2．0pg／mL 20fiL，测定不同时间杠柳毒苷的血药浓度，结果见
杠柳毒苷对照品直接进样20pL，测定，记录峰面积 图2。
为(Asd)，计算提取回收率R=(As／2．5)／Asd×
100％，结果分别为82．6％、81．8％、88．2％，RSD分
别为2．2％、4．3％、4．1％(咒=5)。3个质量浓度的提
取回收率均大于81．8％，符合生物样品测定关于提
取回收率的要求。
2．10精密度和准确度试验：取空白血浆，加杠柳毒
苷配制成质量浓度分别为0．04、0．4、2．0mg／L血
浆样品各5份，内标地高辛溶液为10．2mg／L，处
理，测定，记录杠柳毒苷峰面积和内标峰面积，计算
杠柳毒苷与内标地高辛峰面积比值，带人回归方程
计算质量浓度，并计算测得质量浓度／理论质量浓
度，作为精密度试验结果，以RSD表示；用测得质量
浓度的平均值／理论质量浓度×100％作为准确度试
验结果。同法处理3批血浆样品，测定，分别计算，结
果见表1。结果表明本法精密度和准确度均符合生
物样品测定要求。
2．11小鼠血浆样品的测定：测定小鼠血浆样品时
2．12数据分析：血药浓度一时间数据采用中国药理
学会数学药理专业委员会DAS实用药动学计算程
裹1精密度和准确度试验将结果钿一5)
Table1 Resultsofprecisionandaccuracytest(一=5)
理论质量浓度测定质量浓度 批内 批间
／(rag·L一1)／(rag·L一1)RSD／％RSD／％
准确度试验／％
一
2
j
r5
磊1
篓0．5
曩
O
O lO 20 30 40 50 60
tlmin
圈2小一体内杠柳毒苷的平均血药浓度一时闻曲线
Fig．2Meanpertplocinbloodconcentration—time
ctirveofmice

万方数据
·1496· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10,el
序软件进行拟合。对各种模型的处理结果进行比较，
选择其中残差平方和(SUM)值最小、拟合度(r2)
最佳、AIC值最小者定为所测药物的最佳室型。结
果表明本法测定的杠柳毒苷在小体内符合二室代谢
模型，C(to)为1．39pg／mL，tl／2．为2．04min，gl／2P为
13．9min，CL为0．0314L／min，AUCo．60为30．84
mg／L·min，MRTo～60为8．20rain，VRTo~60141．0
rain2。
3讨论
3．1前处理方法的选择：本实验根据杠柳毒苷的理
化性质及极性等对血浆预处理方法进行了研究，主
要进行了液液萃取、沉淀蛋白和固相萃取3种方法
的摸索。
液液萃取法中考察了叔丁基甲醚一二氯甲烷
(2：1)、醋酸乙酯一丙酮(5z 1)、醋酸乙酯一乙醇
(15l 1、8I 1、5l 1)、醋酸乙酯一异丙醇(20l 1、10t
1、5l 1)、氯仿一异丙醇(95：5、9t 1、5l 1、1：1)、氯
仿一正丁醇(9z 1)、二氯甲烷一异丙醇(10：1、5t 1、
3 t 1)，结果回收率均不能达到要求。
沉淀蛋白法中考察了甲醇、乙腈、甲醇一乙腈
(1·1)为沉淀剂的方法。结果乙腈沉淀蛋白后，杠柳
毒苷的提取回收率仅60％。以甲醇为沉淀剂，提取
回收率虽然较高(约80％)，但干扰峰较多，不稳定。
以甲醇一乙腈(1t 1)为沉淀剂，提取回收率可达
80％，干扰较少。实验初期曾经甲醇一乙腈(1。1)沉
淀的方法作为血浆预处理方法并进行了方法学验
证，方法定量限0．1弘g／mL。小鼠尾静脉注射杠柳毒
苷中剂量(1mg／kg)后，于不同时间点采血进行测
定。结果此方法给药40min后杠柳毒苷已经低于定
量限，无法满足更低剂量的研究。
最后采用沉淀蛋白一固相萃取法，选择反相C，。
型固相萃取小柱进行实验，其上样量、洗脱溶剂用量
及成本方面都较合适，即1mL上样液，1mL40％
甲醇洗杂质、100％甲醇1mL两次洗脱杠柳毒苷和
地高辛，每次0．5mL，每处理5个样品换一个固相
萃取小柱。结果回收率符合药动学研究要求。
3．2色谱柱的选择：使用了TiahheC，。色谱柱(250
mm×4．6mm，5pm)，结果血浆中检测杠柳毒苷时
杂峰很多，回收率很低。改用窄径柱AgilentC。。(100
mm×2．1mm，3．5pm)测定，色谱图中仍然有干扰
峰。最后选用色谱柱AgilentZorbaxSB-C18柱(150
mm×4．6mm，5pm)及保护柱AgilentZorbaxC18
柱(12．5mE×4．6mm，5pm)，结果表明，血浆中检
测杠柳毒苷的最低定量限可以达到测定要求，并且
杂峰较少，符合要求。
3．3流动相比例的选择：方法建立初期，流动相采
用乙腈一水(27：73)，有杂峰干扰且峰型不好，改流
动相比例为乙腈一水(23：77)以减少样品出峰处的
干扰，但出峰时间太长。最后选择流动相为乙腈一水
(25：75)，色谱图中样品峰型较好且无干扰峰出现，
符合要求。
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(1-海医药工业研究院，上海200040)
摘要：目的优选提取黄芪中多糖的最佳方法和工艺参数。方法 比较微波、超声、碱水、酶法、加热回流提取黄
芪．对其中最佳的微波提取法的工艺条件分别进行了单因素和正交试验研究，以最佳工艺条件为基础进行放大实
验。结果黄芪多糖的最佳提取工艺为微波提取，控温70℃，提取3次，每次10min。该工艺条件同样适用于放大
实验，与小试试验的条件一致。结论优选的黄芪多糖微波提取法工艺稳定可行。
关键词：黄芪；多糖；微波提取；正交试验
中圈分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)10—1496一04
收稿日期：2008—01—05
作者简介：许海燕(1979一)，女．湖南省邵东县人，上海医药工业研究院中药研究室2003级硕士，研究方向为中药制荆．
Tel：(021)62479808—464E—mail：swalxh@yahoo．com．cn

万方数据
HPLC法测定小鼠血浆中杠柳毒苷的血药浓度
作者： 阙红玉， 谢跃生， 王跃飞， 戚爱棣， 潘桂湘， 刘虹， KAN Hong-yu， XIE Yue-sheng
， WANG Yue-fei， QI Ai-di， PAN Gui-xiang， LIU Hung
作者单位： 天津中医药大学中医药研究院,教育部省部共建方剂学重点实验室,天津,300193
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(10)
被引用次数： 2次

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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200810017.aspx