全 文 ：检测信号 ,使得褪黑素主峰与杂质峰清晰分开。
建立 RP2H PL C 的检测方法 ,可以简便、准确地
测定贯叶连翘的褪黑素量 ,该法测定的贯叶连翘
YXu55 转基因株系的褪黑素量均显著高于 p ZP122
转基因株系和未转基因的 C K 植株 ( T2检测 , 3 P <
0105) ,说明外源褪黑素合成酶基因 AANA T2HI2
OM T 的导入和表达 ,提高了转化植株内源褪黑素
的量 ,同时也为褪黑素功能的研究工作确定了实验
材料。
参考文献 :
[ 1 ] 　宋立人 , 洪　恂 , 丁绪亮 , 等1 现代中药学大辞典 [ M ]1 上
册1 北京 : 人民卫生出版社 , 20011
[ 2 ] 　Chat terjee S S , Bhattacharya S K , Wonnemann M , et al1
Hyperforin as a possible antidepressant component of H y pe2
ricum ext ract s [J ]1 L i f e Sci , 1998 , 63 (6) : 49925031
[ 3 ] 　李　宏 , 姜怀春 , 邹国林 1 贯叶连翘活性成分研究新进展
[J ]1 中草药 , 2001 , 32 (7) : 65726601 [4 ] 　Lerner A B , Takahashi Y , Lee T H , et al1 Isolation of me2latonin , t he pineal gland factor t hat lightens melatocytes [J ]1J A m Chem S oc , 1958 , 80 : 2578225791[5 ] 　程永炜1 褪黑素对手术病人免疫功能和睡眠质量的影响[ D]1 北京 : 中国医学科学院 , 20041[6 ] 　Hattori A , Migitaka H , Ligo M , et al1 Identification of me2latonin in plant s and it s effect s on plasma melatonin levels andbinding to melatonin receptors in vertebrates [J ]1 B iochemMol B iol I nt , 1995 , 35 : 62726341[7 ] 　刘伟华 , 张贵友 , 戴尧仁1 HPLC 法测定黄芩叶、花、种子中褪黑激素的含量 [J ]1 植物学通报 , 2003 , 20 (1) : 752791[8 ] 　郑灿辉 , 谢继青 , 袁　成 , 等1 褪黑激素制剂含量测定方法概述 [J ]1 中国生化药物杂志 , 2003 , 24 (3) : 15321551[9 ] 　Jacek M , Ewa P , Marek T1 On2line preconcent ration tech2niques in determination of melatonin and it s precursors/ me2tabolites using micellar elect rokinetic chromatography [J ]1 JChromatogr A , 2006 , 1104 (122) : 33723451[ 10 ] 　Ayano E , Suzuki Y , Kanezawa M , et al1 Analysis of melato2nin using a p H2 and temperature2responsive aqueous chroma2tography system [J ]1 J Chromatogr A , 2007 , 1156 ( 122) :21322191
PR2HPLC法测定甘肃蚤缀中苜蓿素、苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯、
异牡荆素、异金雀花素和苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷
雷 　宁1 ,杜树山2 ,欧阳捷3 ,刘丽宏1 ,王永炎2 3
(11 中国人民解放军第二炮兵总医院 药剂科 ,北京　100088 ; 21 北京师范大学 教育部资源药物工程研究中心 ,北京　100088 ;
31 北京师范大学 分析测试中心 ,北京 　100875)
摘 　要 :目的 　建立 HPLC 法对甘肃蚤缀中苜蓿素、苜蓿素24′2O2β2愈创木甘油基酯、异牡荆素、异金雀花素和苜蓿
素272O2β2D2葡萄糖苷同时定量的方法。方法 　采用反相高效液相色谱法。色谱柱为 Diamonsil TM C18 (250 mm ×
416 mm ,5μm) ,流动相为乙腈2015 %磷酸梯度洗脱 ;体积流量为 110 mL/ min ;柱温为 30 ℃;检测波长为 350 nm ;
进样量为 10μL 。结果 　苜蓿素、苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯、异牡荆素、异金雀花素和苜蓿素272O2β2D2葡萄
糖苷 5 个化合物达到基线分离且线性关系良好 ,线性范围分别为 5144～97192μg/ mL ( r = 01999 2) 、4176～85168
μg/ mL ( r = 01999 2) 、6152～117136μg/ mL ( r = 01999 6) 、4192～88156μg/ mL ( r = 01999 8) 、1160～29134μg/ mL
( r = 01999 1) ,平均加样回收率分别为 100121 % ( RSD = 1194 %) 、97150 % ( RSD = 2150 %) 、100138 % ( RSD =
2146 %) 、98154 %(RSD = 2140 %) 、97145 %(RSD = 3114 %) 。结论 　测定了 4 种来源的甘肃蚤缀样品中 5 个化合
物的量 ,该方法分离度好、快速、简便 ,重现性佳。
关键词 :甘肃蚤缀 ;苜蓿素 ;苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯 ;异牡荆素 ;异金雀花素 ;苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷
中图分类号 :R28216 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 1021653203
　　甘肃蚤缀为石竹科蚤缀属植物甘肃蚤缀 A re2
nari a kansuensis Maxim1 的干燥全草 ,系传统藏药 ,
其味苦、性寒 ,具清热利肺、退热止咳之功效。藏医
常用于治疗各种肺病、淋巴结核、黄疸、风湿、肾结石
以及筋骨疼痛等[1～3 ] 。现代药理学研究表明 ,甘肃
蚤缀具有抗炎、免疫调节、抗缺氧和肿瘤抑制等作
用[ 4 ,5 ] 。早年有研究从甘肃蚤缀中分离得到甾类、
生物碱类和黄酮类化合物。为了寻找其活性成分 ,
研究者曾经对甘肃蚤缀全草 70 %乙醇提取物的大
孔吸附树脂 50 %乙醇洗脱物进行了系统的化学成
分研究 ,发现其含有多种黄酮类化合物 ,其中苜蓿
素272O2β2D2葡萄糖苷、苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油
基酯和异牡荆素为首次从该植物中得到 ,且苜蓿素2
4′2O2β2愈创木基甘油基酯为首次从石竹科植物中分
·3561·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
3 收稿日期 :2008212214　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :雷　宁 (1978 —) ,女 ,陕西人 ,博士 ,主要从事天然药物药效物质基础与质量控制研究工作。　
Tel : (010) 66343257 　E2mail :lilyzebra @1631com
得[ 6～8 ] 。为进一步比较不同来源甘肃蚤缀中的黄酮
类化合物 ,也为今后有效的控制其质量 ,本实验建立
RP2HPL C 法同时测定 4 种来源的甘肃蚤缀中苜蓿
素、苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯、异牡荆素、异
金雀花素和苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷的方法 ,有助
于甘肃蚤缀这一传统藏药的深入研究和质量控制。
1 　仪器与试药
L C —20A 高效液相色谱仪、SIL —20A 自动进
样器、CTO —20A 柱温箱、SPD —20A 紫外检测器、
L C Solution 色谱工作站 (日本岛津公司 ) ; KQ2
500V 型超声波清洗器 (昆山超声仪器有限公司) ;
CP225D 型电子天平 (德国 Sartorius) 。
苜蓿素、苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯、异
牡荆素、异金雀花素和苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷对
照品均为自制 ,质量分数均大于 98 %。乙腈为色谱
纯 (美国 Fisher 公司) ,蒸馏水为自制双重蒸馏水 ,
其他试剂均为分析纯。甘肃蚤缀药材样品共有 4 个
来源 ,其中 3 个分别于 2002 年、2004 年、2005 年购
自青海省西宁药市 ,第 4 个于 2006 年采集自青海巴
颜喀拉山口 ,均由中国科学院西北高原生物研究所
卢学峰博士鉴定为石竹科蚤缀属植物甘肃蚤缀 A1
k ansuensis Maxim1 的全草。样品粉碎过 40 目筛 ,
置广口瓶中 ,于阴凉干燥处密闭保存。
2 　方法与结果
211 　色谱条件 :迪马公司 Diamonsil TM C18 色谱柱
(250 mm ×416 mm ,5μm) ;乙腈2015 %磷酸为流动
相 ,梯度洗脱 :0～40 min ,10 %～63 %乙腈 ,40～45
min ,63 %～90 %乙腈 ;体积流量为 110 mL/ min ;柱
温为 30 ℃;检测波长为 350 nm。
212 　对照品溶液的制备 :分别精密称取苜蓿素、苜
蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯、异牡荆素、异金雀
花素和苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷对照品适量 ,用
80 %乙腈溶解并稀释成质量浓度分别为 27210、
23810、32610、24610、32010μg/ mL 的溶液。
213 　供试品溶液的制备 :取甘肃蚤缀药材粉末 015
g ,精密称定 ,置 100 mL 锥形瓶中 ,加入 80 %乙腈
50 mL 称质量 ,超声提取 60 min ,取出放冷 ,再称定
质量 ,用 80 %乙腈补足减失的质量 ,摇匀 ,滤过 ,将
滤液回收溶剂至小体积后转移至 25 mL 量瓶中 ,再
加 80 %乙腈定容至刻度 ,即得。
214 　线性关系考察 :分别精密吸取苜蓿素、苜蓿素2
4′2O2β2愈创木基甘油基酯、异牡荆素和异金雀花素
对照品溶液 210 mL 、苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷对照
品溶液 015 mL 置同一 100 mL 量瓶中 ,加乙腈至刻
度 ,摇匀 ,即得苜蓿素、苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油
基酯、异牡荆素、异金雀花素和苜蓿素272O2β2D2葡
萄糖苷质量浓度分别为 5144、4176、6152、4192、
1160μg/ mL 的对照品混合溶液。精密吸取上述对
照品混合溶液 1、3、7、10、13、15、18μL 进样 ,测定其
峰面积。分别以进样量为横坐标 ( X) ,峰面积为纵
坐标 ( Y) ,绘制标准工作曲线并进行回归分析 ,苜蓿
素、苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯、异牡荆素、异
金雀花素和苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷分别在
5144～97192、4176～85168、6152～117136、4192～
88156、1160～29134μg/ mL 呈良好线性关系。所
得回归方程为苜蓿素 : Y = 31636 ×106 X + 21 862 ×
103 , r = 01999 2 ;苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯 :
Y = 91029 ×105 X - 11183 ×103 , r = 01999 2 ;异牡
荆素 : Y = 11343 ×106 X - 11505 ×103 , r = 01999 6 ;
异金雀花素 : Y = 11973 ×106 X + 01561 ×103 , r =
01999 8 ;苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷 : Y = 21062 ×106
X + 01297 ×103 , r = 01999 1。
215 　精密度试验 :精密吸取上述对照品混合溶液
10μL ,在上述色谱条件下重复进样 6 次 ,以苜蓿素、
苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯、异牡荆素、异金
雀花素和苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷的峰面积计算 ,
RSD 分 别 为 0136 %、1179 %、0140 %、0154 %、
0161 %。
216 　稳定性试验 :分别于 0、2、4、6、8、12 h 取同一
供试品溶液进样 10μL ,以苜蓿素、苜蓿素24′2O2β2愈
创木基甘油基酯、异牡荆素、异金雀花素和苜蓿素2
72O2β2D2葡萄糖苷的峰面积计算 , RSD 分别为
0148 %、2147 %、1102 %、1108 %、1132 %。结果表明
该供试品溶液中苜蓿素、苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘
油基酯、异牡荆素、异金雀花素和苜蓿素272O2β2D2
葡萄糖苷在 12 h 内稳定。
217 　重现性试验 :取同一来源药材 6 份 ,按 213 项
下制备 ,在上述色谱条件下分析 ,计算苜蓿素、苜蓿
素24′2O2β2愈创木基甘油基酯、异牡荆素、异金雀花
素和苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷质量分数的 RSD 分
别为 1104 %、1131 %、1117 %、0193 %、2152 %。
218 　回收率试验 :分别称取已知质量分数的同一来
源甘肃蚤缀药材约 0125 g ,共 6 份 ,每份分别加入苜
蓿素、苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯、异牡荆素、
异金雀花素和苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷质量浓度
分别为 5144、4176、6152、4192、1160μg/ mL 的混合
对照品溶液 10 mL 制备供试品溶液 ,进样测定 ,计
算回收率 ,结果苜蓿素、苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘
·4561· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
油基酯、异牡荆素、异金雀花素和苜蓿素272O2β2D2
葡萄糖苷的平均回收率分别为 100121 %、97150 %、
100138 %、98154 %、97145 % , RSD 分别为 1194 %、
2150 %、2146 %、2140 %、2194 %。
219 　样品测定 :取所收集的不同来源的甘肃蚤缀干
燥药材粉末 ,按 213 项下操作 ,在上述色谱条件下进 行分析 ,用外标法计算甘肃蚤缀中苜蓿素、苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯、异牡荆素、异金雀花素和苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷的质量分数。测定结果见表 1 (样品 1～3 为西宁药市市售药材 ,样品 4 为实地采集药材 , 3 表示超出线性范围) ,液相色谱图见图 1。
表 1 　4 批不同来源甘肃蚤缀中的苜蓿素、苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯、异牡荆素、异金雀花素和
苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷测定结果( n = 4)
Table 1 　Contents of tricin , tricin 4′2O2β2guaiacylglyceryl ether , isovitexin , isoscoparin , tricin272O2β2D2
glucopyranoside in samples of A1 kansuensis from four different habitats ( n = 4)
编号 来　源
异牡荆素/
(mg ·g - 1)
异金雀花素/
(mg ·g - 1)
苜蓿素272O2β2D2葡萄糖
苷/ (mg ·g - 1)
苜蓿素24′2O2β2愈创木基
甘油基酯/ (mg ·g - 1)
苜蓿素/
(mg ·g - 1)
1 青海西宁　　　　 01 337 2 01235 3 01 108 4 01 154 3 01232 4
2 青海西宁　　　　 01 208 0 01187 3 01 065 4 01 182 9 01212 7
3 青海西宁　　　　 01 097 2 01162 0 01 065 8 01 051 9 01122 8
4 青海巴颜喀拉山口 01 016 6 3 01033 3 01 007 5 3 01 033 2 01065 3
t/ min
a2异牡荆素　b2异金雀花素　c2苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷
d2苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯　e2苜蓿素
a2isovitexin 　b2isoscoparin 　c2t ricin272O2β2D2glucopyranoside
d2t ricin 4′2O2β2guaiacylglyceryl et her 　e2t ricin
图 1 　混合对照品( A)和样品( B)色谱图
Fig11 　Chromatograms of mixed reference substances ( A)
and sample ( B)
3 　讨论
　　本实验采用 RP2HPL C 法对 4 个甘肃蚤缀样品
中的苜蓿素、苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯、异
牡荆素、异金雀花素和苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷这
5 个化学成分进行测定。结果表明 ,5 种黄酮类成分
中苜蓿素24′2O2β2愈创木基甘油基酯和苜蓿素272O2
β2D2葡萄糖苷的量普遍较苜蓿素、异牡荆素、异金雀
花素的量低 ;与 3 批市售药材相比较 ,巴颜喀拉山口
实地采集的药材样品中 5 种黄酮类成分的量最低 ,
并且苜蓿素272O2β2D2葡萄糖苷和异金雀花素的量
超出线性范围 ,原因可能与采收季节和采集地点有
关 ;3 批市售药材之间这 5 个化学成分的量差异亦
较大 ,因此对其进行同时测定很有必要。
　　根据文献 ,黄酮类成分在室温下超声的提取效
果较佳[9 ] 。故本研究以苜蓿素、苜蓿素24′2O2β2愈创
木基甘油基酯、异牡荆素、异金雀花素和苜蓿素272
O2β2D2葡萄糖苷为测定指标 ,采用超声提取法考察
了不同体积分数含水的甲醇和乙醇溶液对以上 5 种
化学成分的提取效率 ,结果表明 ,80 %乙醇的提取效
果最佳。在固定提取溶剂后 ,实验考察了提取时间
的影响 ,结果显示上述 5 种化学成分在 60 min 内已
经提取完全。因此 ,本实验确定的最佳提取条件为
80 %乙醇溶液超声提取 60 min。
参考文献 :
[1 ] 　中国科学院西北高原生物研究所1 藏药志 [ M ]1 西宁 : 青海
人民出版社 , 19911
[2 ] 　青海省药品检验所 , 青海省藏医药研究所 1 中国藏药 [ M ]1
第Ⅰ卷1 上海 : 上海科学技术出版社 , 19961
[3 ] 　肖培根1 新编中药志 [ M ]1 第Ⅰ卷1 北京 : 化学工业出版社 ,
20021
[4 ] 　彭宝珠 , 冯利伟 , 王利彦 , 等1 藏药雪灵芝对炎症和免疫功
能的影响 [J ]1 青海医学院学报 , 1990 , 2 : 682751
[5 ] 　苏红卫 , 徐维光 , 刘军祥 , 等1 雪灵芝的抗缺氧作用 [J ]1 泸
州医学院学报 , 2002 , 25 (5) : 37123741
[6 ] 　雷　宁 , 张文生 , 杜树山 1 蚤缀属植物的种群分布、化学及
药理研究进展 [J ]1 中国中医药信息杂志 , 2004 , 11 (10) :
92929311
[7 ] 　雷　宁 , 杜树山 , 李　林 , 等1 藏药甘肃蚤缀的化学成分研
究Ⅰ [J ]1 中国中药杂志 , 2007 , 32 (10) : 91829201
[8 ] 　雷　宁 , 杜树山 , 欧阳捷 , 等1 藏药甘肃蚤缀的化学成分研
究Ⅱ [J ]1 北京师范大学学报 , 2008 , 44 (3) : 26322651
[9 ] 　Escarpa A , Gonzalez M C1 Evaluation of high2performance
liquid chromatography for determination of phenolic com2
pounds in pear horticultural cultivars [J ]1 Chromatographia ,
2000 , 51 (1/ 2) : 372431
·5561·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月