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中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第6期2008年6月·877
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紫芝液体深层发酵液的抗肿瘤活性部位研究
杨国红，杨义芳+，金隽迪
(I-海医药工业研究院中药研究室，上海200040)
摘 要：目的 寻找紫芝液体深层发酵液的最佳抗肿瘤活性方法。方法采用液体深层发酵得到菌丝体，利用小鼠
移植肿瘤模型追踪测试抗肿瘤活性，导向得到最佳抗肿瘤活性部位，并用苯酚一硫酸法测得其总多糖质量分数，3，
5一二硝基水杨酸(DNS)法测定其还原糖质量分数，并对活性部位进行体外的细胞毒试验。结果紫芝液体深层发
酵液的最佳抗肿瘤活性部位为胞内水提醇沉得到沉淀的水溶部分(样品B)含多糖88．4％，含还原糖3．15％，该部
分不含蛋白质；在ig给药剂量为40．5mg／kg时，该活性部位对H：：肝癌小鼠的抑瘤率为63．94％，对Lewis肺癌
小鼠的抑瘤率为58．32％；该活性部位对A549、LoVo、CEM、QGY一7703等4种人肿瘤细胞的IC5。值分别为160、
29．28、45．06、37．38产g／mL。结论紫芝液体深层发酵液的最佳抗肿瘤活性部位为胞内水提醇沉物可溶于水部分，
对小鼠移植肿瘤有较好的抑制作用，但体外细胞毒作用较弱。
关键词：紫芝；液体深层发酵；抗肿瘤
中图分类号：R286．91 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)06—0877—04
AntitumorfractionfromliquidsubmergedfermentationofGanodermasinense
YANGGuo～hong，YANGYi—fang，JINJun—di
(DepartmentofChineseMateriaMedica，ShanghaiInstituteofPharmaceuticalIndustry，Shanghai200040，China)
Abstract：ObjectiveTos udytheantitumorfractionfromliquidsubmergedfermentationof
Ganodermasinense．MethodsTheantitumoractivefractionswereextractedfromthehyphostromawhich
wasproducedbyliquidsubmergedfermentationndtheirantitumoractivitieswereobservedbymice
transplanttumormodel．Thetotalpolysaccharideswe etestedbyphenol—sulphuricacidmethodandthe
contentsofreducingsugarsweremeasuredbyDNSmethod．ThecytotoxicactivitiesweretestedbyMTT
methodinvitro．ResultsTheoptimumfractionwastheintracellularsolublepr cipitation(sampleB)bv
waterxtractingw thalcoholsedimentation．Thecontentsof otalpolysaccharideande ucingsugarin
theoptimumactivefractionfromliquidsubmergedfermentationofG．sinensewere88．4％and3．15％，
respectively，butnoprotein．Theinhibitoryratioswere63．94％and58．320AonthegrowthofH22and
Lewistumort ansplantedinmicebyigadministrationinthec centrationof40．5mg／kg，respectively．
TheIC500nfourtumorcellsofA549，LoVo，CEM，andQGY一7703were160，29．28，45．06，and37．38
pg／mL，respectively，whichsuggestedt atheactivefractionhadweakcytotoxicnLoVo，CEMt and
QGY一7703．ConclusionTheactivefractionfromliquidsubmergedfermentationofG．sinenseis
polysaccharidewhichhasbetterinhibitoryrateonthegrowthofH22andLewistumort ansplantedinmice
butheircytotoxicitiesareweak．
收稿日期：2007—09—07
基金项目：上海市自然科学基金项目(05ZRl4112)；上海市科委“登山行动计划”项目中药现代化专项重点项目(06DZl9706)
作者简介：杨国红(1976一)，男，山西人，博士，主要从事中药活性成分及新药研究。
Tel：(021)62479808—491E-mail：yangguohon丘2001@yahoo．corn．cn
*通讯作者杨义芳Tel／Fax：(021)62473018E—mail：yangy94912@163．corn
万方数据
·878· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第6期2008年6月
Keywords：Ganodermasin nseZhao，XuetZhang；liquidsubmergedfermentation；antitumor
真菌被认为是抗肿瘤药物的重要研究对象，寻
找真菌中的抗肿瘤多糖成为发现抗肿瘤药物的一个
重要途径。本课题组以小鼠S。。。肉瘤、小鼠Hzz肝癌、
小鼠Lewis肺癌、小鼠C26肠癌等为模型，筛选了
十余种真菌子实体粗提取物，结果发现紫芝子实体
多糖粗提取物显示了很强的抗肿瘤活性，进而通过
对不同产地的紫芝多糖粗提取物进行抗肿瘤活性比
较，发现紫芝多糖粗提物的抗肿瘤活性最佳。
紫芝GanodermasinenseZhao，XuetZhang是
我国名贵中药灵芝的一种[1]，为传统“药食同源”的
补品，具有广泛的保健作用和悠久的使用历史，早在
《神农本草经》就把灵芝列为上品，并根据灵芝类的
形态和颜色将其分为赤芝、黑芝、青芝、白芝、黄芝、
紫芝6种。灵芝中使用和研究较多的是赤芝
Ganodermalucidum(Leyss．ExFr．)Karst．L¨，国
内外已对赤芝的子实体、发酵菌丝体、孢子的抗肿瘤
成分进行了广泛的研究，主要包括多糖、糖肽、三萜
类等成分‘引。而对紫芝的研究较少，一个重要原因是
紫芝的资源贫乏。为避免受资源制约，本实验对所选
择的真菌采集鲜品，进一步对紫芝进行菌种分离和
液体发酵培养得到菌丝体。本研究旨在寻找紫芝液
体深层发酵液的抗肿瘤最佳活性部位。
1材料
1．1 仪器与试剂：Biotech--50BS自动发酵罐(上
海宝兴)；LXJ—IIB低速大容量多管离心机(上海
安亭科学仪器厂)；HWS26电热恒温水浴锅(上海
一恒科技有限公司)；FD一1C一50多歧管冷冻干燥
机(北京博医康实验仪器有限公司)；Wellscan
MK一2全自动酶标仪(Labsystems)；双灵固本散
(批号050104、070105；西安绿谷制药有限公司)。
1．2试验动物：雄性昆明种小鼠和C57BL／6小鼠
(18～21g)，上海斯莱克实验动物责任有限公司，生
产许可证号：SCXK(沪)2003—0003；使用许可证
号：SYXK(沪)2004—0015。
1．3瘤株：小鼠肝癌H。。、小鼠Lewis肺癌，上海医
药工业研究院药理室传代维持。
1．4 细胞株：A549(人肺癌细胞)；LoVo(人肠癌
细胞)；CEM(人T细胞白血病细胞)；QGY一7703
(人肝癌细胞)，均由上海医药工业研究院药理室冻
存和传代。
2方法与结果
2．1 发酵：选取我国山东荷泽产的新鲜紫芝(由本
院杨义芳研究员鉴定)进行菌种分离，对获得的菌株
采用液体深层发酵方法进行发酵，获得菌丝体。
2．2体内抑瘤试验：取生长良好的小鼠肝癌H。。腹
水或Lewis肺癌瘤块，用生理盐水稀释(细胞浓度
约1×107～2×107／mL)，每只小鼠右腋皮下接种
0．2mL，随机分组。接种后次日起给药，给药体积为
0．5mL／20g，肝癌H2：小鼠连续ip给药7d，Lewis
肺癌小鼠连续ip给药10d。接种后10d解剖H：：小
鼠，14d解剖Lewis肺癌小鼠，取瘤块，称瘤质量，
计算抑瘤率。
抑瘤率一(对照组平均瘤质量一给药组平均瘤质量)／对
照组平均瘤质量×100％
2．3活性部位的确定
2．3．1胞内胞外提取物的活性比较：发酵液离心，
得胞外液(上清液)和残渣。胞外液(上清液)浓缩，乙
醇进行沉淀，抽滤，分为滤液和沉淀，将滤液减压浓
缩，干燥至恒质量(胞外上清)；沉淀部分干燥至恒
质量(胞外沉淀)。残渣放入烧杯，水浴提取3次，合
并3次水煎液(胞内提取物)，减压浓缩，乙醇进行沉
淀，抽滤，分为滤液和沉淀，滤液减压浓缩，干燥至恒
质量(胞内上清)；沉淀部分干燥至恒质量(胞内沉
淀)。4个样品分别ig和ip给药，按照“相当于原发
酵液的相同量”给药，进行体内抑瘤试验，结果见表1
和2。
2．3．2胞内水提醇沉部分可溶于水部分和不溶于
水部分的活性比较：发酵液离心，上清液(胞外液)
弃去，残渣加水提取3次，合并水煎液，减压浓缩，乙
醇进行沉淀，离心滤过得沆淀；沉淀部分干燥至恒质
量，研磨成细粉，得胞内提取物总沉淀。
裹1 紫芝发酵液的胞内、胞外提取物ig给药对肝癌Hzz
小鼠的抑瘤作用(月=10)
TableInhibitionof ntra-andextracellularextractof
fungusfermentationfromG．sinenseongrowth
ofH22tumortransplantedinmicebyigadminis—
trationf r7d(甩=10)
组剐 剂量／(mg·kg一1)体质量f去瘤后)／g瘤质量／g tlll*／％
与模型组比较：。P。P 万方数据
中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第6期2008年6月-879·
裹2紫芝发酵液的胞内、胞外提取物Ip给药对肝癌Hz：
小鼠的抑瘤作用(万=10)
Table2 Inhibitionof ntra—andextracellularextract
offungusfermentationfromG．sinenseon
growthofH2ztumortransplantedinmice
byipadministrationfor7d(丹一10)
与模型组比较：。P<0·05一尸<0．01
’P样品A(胞内提取物总沉淀)：取胞内提取物总
沉淀624mg，放入200mL量瓶中，加少量去离子
水，超声，定容，得A的质量浓度3．12mg／mL，按
20g动物0．5mL给药，换算得A的给药剂量78
mg／kg。
样品B(胞内提取物总沉淀可溶于水部分)：按相
当于A的质量浓度配制，即把胞内提取物总沉淀780
mg，放人250mL量瓶中，加去离子水，超声溶解，离
心，得上清液(B)和不溶物(C)，按20g动物0．5
mL给药，实际样品B的给药剂量为40．5mg／kg。
样品C(胞内提取物总沉淀不溶于水部分)：取
上面不溶物(C)放入250mL量瓶，配成混悬液，得
样品C，按20g动物0．5mL给药，实际样品C的给
药剂量为37．5mg／kg。
按照“相当于原发酵液的相同量”ig给药，进行
体内抑瘤试验，结果见表3和4。
裹3样品A、B、C对肝癌H22小鼠的抑瘤作用(n=10)
Table3 InhibitionofsamplesA，B，andCOilgrowth
ofH22tumortransplantedinmicebyig
administration(一=10)
与模型组比较：一尸’。P2．4体外抗肿瘤试验：采用MTT法。96孔板每孔
加入浓度为3×104～4×104／mL的细胞悬液100
弘L，置37℃、5％C0：培养箱内。24h后，加入样品
B液，10肛L／孔，设3个复孔，37℃、5％C0。作用72
h。每孔加入5mg／mL的MTT溶液20弘L，作用4
h后加入溶解液，100弘L／孔，置培养箱内，溶解后用
MK一2全自动酶标仪测570nm处吸光度值，计算
IC。。值。结果见表5。
衰4样品A、B、C对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用(尼=10)
Table4 InhibitionofsamplesA，B，andCongrowth
ofLewistumort ansplantedinmicebyig
administrationfor7d(万一10)
与模型组比较：。P‘P衰5样品B对A549、LoVo、Q6Y一7703、CEM细胞的
lC¨值(；士s，席=3)
Table5 ICs,ValueofsampleBtoA549，LoVo，
QGY-7703，andCEMcells(工±s，一=3)
2．5样品中总糖的测定[3]
2．5．1葡萄糖标准曲线的测定：经测定，在6．3～
21．4／。g／mL吸光度(A)值与质量浓度(C)呈良
好的线性关系，回归方程为C=20．363A一
0．8017，r=0．9996。
2．5．2 样品的测定：样品质量浓度为144．3弘g／
mL。样品中有絮状不溶物，滤过，得上清液，测定结
果见表6，样品C由于是不溶物，没有测得总糖。
裹6样品A、B、C的总糖和还原糖测定结果
Table6 Determinationoftotalsugarndreducing
sugarinsamplesA·B，andC
2．6样品中还原糖的测定[3]
2．6．1葡萄糖标准曲线的测定：采用3，5一二硝基水
杨酸(DNS)法，测定结果表明：在30～90／-g／mL
吸光度(A)与质量浓度(C)呈良好的线性关系，回
归方程为C一96．768A+5．6262，r=0．9995。
2．6．2样品还原糖的测定：样品质量浓度配制为
20．32mg／mL，还原糖的测定结果见表6，样品C由
于是不溶物，没有测得还原糖。
万方数据
·880· 中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第6期2008年6月
2．7样品中蛋白质的测定：茚三酮反应呈阴性，表
明不含蛋白质；UV扫描未见280am的蛋白特征
吸收峰。
3讨论
紫芝液体深层发酵的胞内胞外提取物的抗肿瘤
活性经比较，无论ig给药还是ip给药，胞内提取物
在剂量小于胞外提取物一半的情况下，活性高于胞
外提取物，尤其是胞内水提醇沉的沉淀，活性最好。
进一步筛选，紫芝液体深层发酵的胞内水提醇沉物
的沉淀，再溶于水，分为可溶于水部分和不溶于水部
分，结果可溶于水部分(样品B)对小鼠肝癌H：：、小
鼠Lewis肺癌的活性，均高于总的胞内水提醇沉物
(样品A)，后者又高于不溶于水部分(样品C)，说明
活性集中在可溶于水部分(样品B)，而且经过分离
活性成分得到了富集；总的胞内水提醇沉物的活性
不如可溶于水部分，提示不溶于水部分对可溶于水
部分的活性有拮抗作用或者是影响吸收。
紫芝液体深层发酵的胞内水提醇沉物可溶于水
部分含总糖88．4％、含还原糖1．64％，茚三酮反应
阴性，UV扫描未见280nm的蛋白质特征吸收峰，
说明该部分不含蛋白质，主要成分为多糖。该活性部
位对LoVo、CEM、QGY一7703等3种人肿瘤细胞体
外增殖有弱的抑制作用。
综上所述，紫芝液体深层发酵的抗肿瘤活性部
位为胞内可溶于水的多糖，但由于所得活性多糖对
肿瘤细胞的细胞毒作用较弱，而且多糖口服吸收较
差，因此，该活性多糖部位的抗肿瘤作用可能是通过
提高机体的免疫力来实现的，活性多糖成分的分离、
纯化和结构鉴定正在进一步研究中，其确切的抗肿
瘤作用机制亦尚待深入研究。
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苦参碱对高胆固醇血症大鼠心肌缺血性损伤的保护作用
杨彩艳1，郑 萍1，王小萍1，闫 琳2，周 茹1，戴贵东p
(1．宁夏医学院基础学院药理学教研室，宁夏银川 750004；2．宁夏医学院基础学院机能学实验中心，宁夏银川750004)
摘要：目的研究苦参碱对高胆固醇血症大鼠心肌缺血性损伤的保护作用，并探讨其作用机制。方法SD大鼠
给予高胆固醇饮食4周后，SC异丙肾上腺素(ISO，85mg／kg，每日1次，连续2d)建立高胆固醇血症心肌缺血性损
伤模型，观察苦参碱对模型大鼠血脂、心功能、心肌损伤标志酶及抗氧化酶等的影响。结果 苦参碱(50、100和200
mg／kg)可降低模型大鼠血清胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平；改善大鼠左心室收缩(升高LVSP和+dp／
出。，)和舒张功能(降低LVEDP和升高--dp／dt。。)；减少血清心肌损伤标志酶：乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶
(CK)的量；提高血清及心肌组织中抗氧化酶：超氧化物歧化酶(SoD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物
酶(GSH—PX)的活力，并相应降低脂质过氧化物丙二醛(MDA)量。组织病理学结果显示，苦参碱可减轻高胆固醇
血症大鼠缺血性心肌组织形态学结构的异常改变。结论苦参碱对高胆固醇血症大鼠缺血性心肌结构与功能具有
保护作用，其作用机制与降低血清TC和／或TG，提高机体抗氧化酶活性并维持心肌细胞膜稳定性有关。
关键词：苦参碱；高胆固醇血症；心肌缺血；脂质过氧化；心功能
中图分类号：R286．2 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)06—0880一05
Cardioprotectiveeffectofmatrineo myocardiaIischemia
inhypercholesterolemiarats
YANGCai—yanl，ZHENGPin91，WANGXiao—pin91，YANLin2，ZHOURul，DAIGui—don91
(1．DepartmentofPharmacology，NingxiaMed calCo lege，Yinchuan750004，China；2．ExprimentalCenter
ofBasicMedicine，NingxiaMedicalCo lege，Yinchuan750004，China)
Abstract：ObjectiveToexplorecardioprotectiveeffectofmatrineo myocardialischemiain
hy ． 1 i i i_percholesterolemia ratsMethodsMyocardianfarctionwas ducedbysubcutaneousjectionof
收稿日期：2007—11—02
基金项目：教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NECT一06—0916)-宁夏教育厅高等院校科研项目(2005--2007)I宁夏自然科学基金
资助项目(NZ0782)
作者简介：杨彩艳(1980一)．女，宁夏人，在读药理学硬士研究生。研究方向为心血管药理学。E—mail：ping—lili@163．corn
*通讯作者戴贵东E—mail：daiguidong@163．corn
万方数据
紫芝液体深层发酵液的抗肿瘤活性部位研究
作者： 杨国红， 杨义芳， 金隽迪， YANG Guo-hong， YANG Yi-fang， JIN Jun-di
作者单位： 上海医药工业研究院中药研究室,上海,200040
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(6)
被引用次数： 5次

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