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木贼大孔树脂提取物对单个核细胞-内皮细胞黏附的影响
李丽玮 ,黄　伟 ,李云峰 ,甄艳军 ,张　莉 ,侯建明＊
(河北医科大学 基础课教学部 , 河北 石家庄　050091)
摘　要:目的　探讨木贼大孔树脂提取物对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的单个核细胞-内皮细胞黏附的作用
及其可能的机制。方法　体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),大孔吸附树脂分离法获取木贼提取物 , 用不同
质量浓度的木贼大孔树脂提取物作用于 ox-LDL 诱导的 ECV304 细胞 12 h ,观察人单个核细胞与内皮细胞的黏附
及 ECV304 细胞的 IL-8 和 VCAM-1 蛋白表达 ,并通过 RT-PCR 观察 IL-8 和 VCAM-1 的基因表达。 结果　高 、
中 、低剂量(100 、50、25 μg/ mL)的木贼大孔树脂提取物均显著抑制 ox-LDL 诱导的单个核-内皮细胞的黏附 ,下调
ox-LDL 诱导的 ECV304 细胞 IL-8 和 VCAM-1 蛋白和基因的表达 ,以中剂量(50μg/ mL)效果最明显。结论　木
贼中总黄酮和总酚酸是木贼抗动脉粥样硬化(AS)的有效部位之一 , 两者抑制 IL-8 和 VCAM-1 的基因及蛋白表
达可能是其抑制单个核-内皮细胞黏附及抗 AS 的机制之一。
关键词:木贼;内皮细胞;血管细胞黏附分子;氧化低密度脂蛋白;白细胞介素-8;动脉粥样硬化
中图分类号:R285.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:0253-2670(2009)02-0265-04
　　单核细胞及淋巴细胞向动脉内膜黏附 、迁移是
动脉粥样硬化 (artherosclerosis , AS)早期炎症反
应的特征事件 ,抑制单个核细胞与内皮细胞间黏附
是抗 AS 的重要机制。研究表明木贼 Equisetum
hiemale L.具有包括抗 AS 等多方面的药理活性 ,
但对其抗 AS 有效部位的研究少有报道 。本实验采
用乙醇回流提取 ,大孔吸附树脂分离法初步提取木
贼中的有效部位总黄酮和总酚酸 ,作用于氧化低密
度脂蛋白 (ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞
(HUV EC),观察有效部位对单个核细胞-HUV EC
黏附及白细胞介素-8(I L-8)和血管细胞黏附分子-
1(VCAM-1)表达的影响 ,为研究木贼抗 AS 的有
效部位及作用机制提供依据。
1　材料
　　木贼药材 (购于石家庄市乐仁堂大药房 ,经河
北医科大学中医学院中药系鉴定),槲皮素和阿魏酸
对照品 (中国药品生物制品检定所 , 批号 0080-
9705 、0773-9910), D101 型大孔树脂 (天津大均科
技开发有限公司), 人脐静脉内皮细胞株 ECV304
(武汉大学中国动植物细胞保藏中心),新生小牛血
清(杭州四季青公司),DMEM 培养液和胰酶(Gib-
co 公司),淋巴细胞分离液 (北京鼎国生物技术公
司),白细胞介素-8 (IL-8)放射免疫分析药盒 (北
京普尔伟业生物科技有限公司), VCAM-1 鼠抗人
单克隆抗体 、羊抗鼠 FITV-IgG 二抗工作液 (美国
Santa Gruz 公司), TRIzol 试剂和 PCR 试剂盒 (北
京天根公司),其他试剂均为国产分析纯。
2　方法
2.1　木贼大孔树脂提取物的制备:称取适量木贼于
圆底烧瓶中 ,加 12 倍量 70%乙醇浸泡 2 h ,回流提
取 3次 ,滤过 ,合并滤液 。大孔树脂 40 g 经适当处
理后湿法装柱 ,将滤液上树脂柱 ,先以水冲至洗脱液
近无色后(Molish 反应阴性)分别用蒸馏水 、30%
乙醇 、70%乙醇洗脱 ,收集 70%乙醇洗脱液 ,分别
以槲皮素 、阿魏酸作为对照品测定总黄酮和总酚酸 ,
结果木贼大孔树脂提取物中含黄酮 36.62%、酚酸
26.66%。将 70%乙醇洗脱液减压浓缩后 ,用无血
清培养基 DMEM 配制 ,加入二甲基亚砜 (DMSO ,
终体积分数为 5%)使其充分溶解 ,此为用于本实
验的木贼大孔树脂提取物(以下简称木贼提取物)。
·265·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
＊ 收稿日期:2008-04-07基金项目:河北省科学技术研究与发展计划项目(06276102D—28)作者简介:李丽玮(1980—),女 ,河北省邢台市人,硕士 ,研究方向为中药防治动脉粥样硬化的基础研究。
Tel:(0311)86265219　E-mail:losingangle567@163.com＊通讯作者　侯建明　E-mai l:h oujianming@mail.china.com
2.2　ox-LDL 的制备和鉴定:采用化学沉淀法[ 1] ,
由人静脉外周血制备低密度脂蛋白(LDL),考马斯
亮蓝法测定蛋白的量 , 在终浓度为 10 μmol/ L 的
CuSO 4中透析 24 h(37 ℃),然后在 4 ℃生理盐水
中透析 24 h 去除 CuSO 4 ,琼脂糖凝胶电泳和氧化
曲线法鉴定 LDL 的氧化修饰结果 。4 ℃保存制备
好的 ox-LDL , 2周内用完。
2.3　单个核细胞悬液的制备:取人外周静脉血 1
mL 与 3.8%枸橼酸钠以 9∶1比例混合 ,与等体积
Hank′s液混匀后加于盛有 2 mL 淋巴细胞分离液
的试管内 ,2 000 r/min 离心 15 min 使血细胞分层 。
用毛细管将单个核细胞吸出 ,以 5 倍 Hank′s 液洗
涤后离心 (1 500 r/min , 15 min), 所得细胞以
DMEM (高糖)培养液配成 1×106/mL 的细胞悬
液 ,备用。
2.4　木贼提取物对单个核细胞-内皮细胞黏附的影
响:调整 ECV304 细胞数至 3 ×105/mL , 按每孔
100 μL 加入 96 孔培养板中 ,置于培养箱中培养 。
待长成单层后换成无血清培养液 (0.5 mL)培养
6 h ,加无血清培养液 0.5 mL (对照组)、含 ox-LDL
(80μg/mL)的无血清培养液 0.5 mL (模型组)、含
不同质量浓度 (100 、50 、25 μg/mL)木贼提取物+
ox-LDL (80μg/mL)的无血清培养液 0.5 mL (药
物干预组),每个浓度加 5 个孔 , 37 ℃孵育 12 h 。
每孔去上清液后 ,用 PBS 洗 1次 ,加入 100μL 人外
周血单个核细胞 (1.5×106/mL),孵育 30 min ,每
15 min 摇动 1次 。用 100 μL PBS 轻轻洗孔 3次 ,
以洗去未黏附的单个核细胞。于倒置显微镜下计数
每个视野黏附的单个核细胞数 ,每个孔计数上 、中 、
下 、左 、右 5个视野 ,观察各个孔每个视野黏附的单
个核细胞数。
2.5　木贼提取物对 ECV304 细胞的影响
2.5.1　细胞培养与分组:采用含 15%新生小牛血
清的 DMEM 作为培养液 ,在 37 ℃、5%CO2培养箱
中培养 ECV 304 细胞。将对数生长期细胞的培养
液换成无血清 DMEM 培养液 , 6 h 后分成 5组:对
照组以无血清 DMEM 培养液培养 ,模型组以无血
清 DMEM 培养液继续培养 1 h 后加入 ox-LDL
(终质量浓度为 80 μg/mL),木贼提取物高 、中 、低
剂量组:无血清 DMEM 培养液中加入木贼提取物
使其终质量浓度分别为 100 、50 、25 μg/mL ,培养 1
h 后加入 ox-LDL ,使其终质量浓度为 80 μg/mL。
加药培养 12 h 后收集细胞和培养液 , 进行检测
(VCAM-1和 RT-PCR药物干预组只检测木贼提取
物中剂量组)。为观察木贼提取物对细胞生长状态
的影响 ,在培养液中加入木贼提取物使其终质量浓
度为 100μg/mL ,培养 12 h 后倒置显微镜下观察细
胞形态良好 ,台盼蓝染色其细胞存活率近似对照组
细胞 ,均在 95%以上 ,说明木贼提取液可直接用于
细胞培养。
2.5.2　ECV304 细胞培养上清液中 IL-8 水平检
测:收集各组细胞培养液 ,按试剂盒说明操作 ,放射
免疫分析法测定。
2.5.3　流式细胞仪检测细胞 VCAM-1 蛋白表达:
用胰酶消化收获细胞 ,并用 PBS 冲洗 2次 ,1 500 r/
min 离心 5 min ,弃上清用 2%甲醛固定。碘化丙
啶染色 ,流式细胞仪检测细胞 VCAM-1蛋白表达。
2.5.4　RT-PCR检测 IL-8和 VCAM-1的 mRNA表
达:按 Trizol 试剂盒说明书提取各组细胞总 mRNA ,
经 2%琼脂糖凝胶电泳后 ,每一样品均出现清晰的
28 S和 18 S 条带 ,且 28 S 条带的亮度和宽度约为 18
S 条带的 2倍 ,纯度鉴定 A260/A280值为 1.8～ 2.0。
RNA 的反转录过程及扩增过程分别按试剂盒
说明书进行。 IL-8 的引物序列为:正向引物 5′-
A TT TCTGCAGCTCTGTG TGAA-3′, 反向 引物
5′-TGAAT TCTCAGCCCTCT TCAA-3′,扩增产物
全长 255 bp 。VCAM-1 引物序列为:正向引物 5′-
A TGACA TGCTTGAGCCAGG-3′, 反向引物 5′-
GTG TCTCCT TCT TTGACACT-3′,扩增产物全长
260 bp 。内参 GAPDH 引物序列为:上游 5′-G T-
GAAGG TCGGAG TCAACG-3′, 下 游 5′-GG T-
GAAGACGCCAG TGGACTC-3′, 扩增产物全长
300 bp(均由北京三博远志生物技术合成)。 I L-8
反应条件为:94 ℃预变性 5 min , 94 ℃变性 35 s ,
53 ℃退火 60 s ,72 ℃延伸 60 s;30个循环后 72 ℃
延伸 5 min。VCAM-1反应条件为:94 ℃预变性 5
min ,94 ℃变性 45 s , 53 ℃退火 60 s , 72 ℃延伸
40 s;30个循环后 72 ℃延伸 5 min 。内参 GAPDH
反应条件为:94 ℃预变性 5 min , 94 ℃变性 10 s ,
57 ℃退火 40 s ,72 ℃延伸 40 s;30个循环后 72 ℃
延伸 5 min。取 10 μL 反应产物在 2%琼脂糖凝胶
上电泳 ,EB染色 ,FR-980生物电泳图像分析系统检
测各组目的基因及 GAPDH 基因的灰度值 ,以两者
的比值代表 IL-8 和 VCAM-1 mRNA 的相对表达
水平。
2.6　统计学处理:实验数据以 x ±s 表示 , 采用
SPSS 15.0 进行统计处理 ,样本间比较的统计学差
异用单因素方差分析 , S-N-K q检验。
·266· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
3　结果
3.1　木贼提取物对 ox-LDL 诱导单个核细胞-内皮
细胞黏附的影响:由表 1 可见 ,经 80 μg/mL ox-
LDL 作用后 ,单个核细胞与内皮细胞的黏附显著增
强(P<0.01)。高 、中 、低剂量木贼提取物均抑制
ox-LDL 引起的单个核细胞与内皮细胞的黏附
(P<0.01),以中剂量组作用最为显著 。
3.2　培养液中 IL-8 水平变化:模型组 IL-8 较对照
组明显升高(P<0.01),木贼提取物高 、中 、低剂量
组 IL-8 较模型组均降低 , 以中剂量组最为显著
(P<0.01),见表 1。
表 1　木贼提取物对 ox-LDL诱导单个核细胞-内皮细胞
黏附及 ECU304 细胞培养上清液中 IL-8 水平
的影响(x±s , n=5)
Table 1　Effect of extract from E.hiemale on ox-LDL-
induced mononuclear cell-EC adherence and IL-8
level in cultured supernatant of ECV304 cells
(x±s , n=5)
组　别 ρ/(μg ·mL-1) 黏附细胞/(个·视野-1) IL-8/(ng ·mL-1)
对照 　　- 52.6±3.4 0.922±0.171
模型 　80 106.2±5.8＊＊ 8.979±0.795＊＊
木贼提取物 100 74.8±3.7■■ 3.056±0.541■■
50 54.2±3.0■■ 2.052±1.018■■
25 80.6±3.4■■ 6.026±0.549■■
　　与对照组比较:＊＊P<0.01;　与模型组比较:■■P<0.01
　　＊＊P<0.01 vs cont rol g rou p;■■P<0.01 vs model group
3.3　内皮细胞 VCAM-1 蛋白表达量的变化:模型
组 VCAM-1 蛋白表达较对照组显著升高 (P <
0.01),木贼提取物中剂量组(50 μg/mL)VCAM-1
蛋白表达较模型组显著降低(P <0.01),见表 2。
表 2　木贼提取物对 ox-LDL诱导 ECU304 细胞 VCAM-1 蛋白 、
IL-8 及 VCAM-1 mRNA 表达的影响(x±s , n=5)
Table 2　Effect of extract from E.hiemale on protein
expression of VCAM-1 and mRNA expression
of IL-8 and VCAM-1 of ECV304 cells induced
by ox-LDL(x±s , n=5)
组　别
ρ/
(μg ·mL-1)
VCAM-1蛋白
表达量(FI)
mRNA表达水平
VCAM-1/GAP DH IL-8/GAPDH
对照 - 1.000±0.028 0.223±0.008 1.155±0.059
模型 - 1.204±0.011＊＊ 1.071±0.054＊＊ 2.602±0.169＊＊
木贼提取物 50 1.070±0.017■■ 0.396±0.014■■ 1.446±0.021■■
　　与对照组比较:＊＊P<0.01;　与模型组比较:■■P<0.01
　　＊＊P<0.01 vs cont rol g rou p;■■P<0.01 vs model group
3.4　ECV 304 细胞 VCAM-1 和 I L-8 mRNA 表达
的变化:见表 2及图 1 。模型组的 VCAM-1 和 IL-8
mRNA 表达量显著高于对照组(P<0.01),50 μg/
mL 木贼提取物组的 VCAM-1 和 IL-8 mRNA 表达
图 1　木贼提取物对 ECV304 细胞 IL-8 和
VCAM-1 mRNA 的影响
Fig.1　Effect of extract from E.hiemale on mRNA ex-
pression of IL-8 and VCAM-1 of ECV304 cells
量显著低于模型组 (P<0.01)。
4　讨论
　　木贼中含黄酮类和酚酸类化合物[ 2] ,这两类物
质具有抗氧化 、抗炎 、保护血管内皮细胞 、抑制 AS
形成的作用 。本课题组曾以动物实验证实木贼水煎
剂及正丁醇萃取物有保护血管内皮 、降低细胞黏附
分子表达 、降低血清 IL-8 等作用 ,显著抑制动脉粥
样斑块形成[ 3 ～ 5] 。本实验则是在前期实验基础上将
提取有效部位的方法加以改进得到含黄酮及酚酸质
量分数较高的提取物 ,经离体细胞实验 ,得到与整体
动物实验类似结果 ,证实黄酮及酚酸是木贼抗 AS
的有效部位之一 。值得注意的是 ,在本实验所应用
的木贼提取物质量浓度范围内 ,中剂量组的检测指
标效果比低剂量组效果好 ,高剂量组反而不如中剂
量组 ,这种现象可能的原因是中剂量黄酮和酚酸对
损伤细胞的保护作用已达到最佳 ,或者高剂量木贼
提取物中其他成分对细胞有一定的损伤作用 ,因此
进一步改进提取工艺 、得到纯度更高的木贼提取物
用于实验是本课题组下一步的研究内容。
VCAM-1 主要存在于血管内皮细胞 ,它介导多
种白细胞与内皮细胞间的黏附。 ox-LDL 通过上调
内皮细胞表达 VCAM-1促进淋巴细胞 、单核细胞与
内皮细胞黏附 、并向内皮下迁移 ,这是 AS 发生 、发
展过程中的重要事件[ 6] 。除了黏附分子 ,许多趋化
因子 ,如单核细胞趋化蛋白 (MCP-1)和 IL-8 ,也在
细胞黏附中起重要作用。内皮细胞受 ox-LDL 刺激
后高表达 IL-8 , IL-8 不仅对中性粒细胞有强烈趋化
作用 ,还是重要的单核细胞和淋巴细胞向血管壁游
走的趋化因子[ 7] ;IL-8 还直接促进单核细胞与内皮
细胞间的牢固黏附 , Gerszten[ 8] 证实在离体实验条
件下 2 nmo l/L 的 IL-8 即可大幅度增加单核-内皮
细胞黏附。本实验结果表明木贼提取物显著下调
ox-LDL 诱导的 VCAM-1 和 IL-8 表达 ,且 mRNA
·267·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
和蛋白表达的变化有较好一致性 ,提示木贼提取物
对细胞黏附相关基因的表达有调控作用 ,是其降低
单个核-内皮细胞黏附作用进而抑制 AS 发生 、发展
的机制之一 ,其进一步的分子机制和该效应的有效
成分值得深入探讨和研究 。
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茯苓多糖修饰物抗肿瘤作用及其机制研究
王爱云1 , 2 ,陈　群1 ,李成付1 ,焦庆才1＊
(1.南京大学生命科学院 , 江苏 南京　210093;2.南京中医药大学中医药研究院 ,
江苏省方剂重点实验室 ,江苏 南京　210029)
摘　要:目的　通过对免疫功能的影响考察硫酸化茯苓多糖(PS)抗肿瘤的作用及其机制。 方法　以 S180肿瘤模
型小鼠和 Yac-1 肿瘤细胞株分别为体内和体外实验对象 ,研究 PS 的抗肿瘤活性和免疫调节功能。结果　PS 体内
显著抑制移植性 S180荷瘤小鼠肿瘤生长 ,最大抑瘤率达 32.22%(P<0.01);促进荷瘤小鼠脾脏和胸腺淋巴器官的
发育生长(P<0.05)。体外对小鼠淋巴细胞尤其是 B 淋巴细胞的增殖有显著促进作用(P <0.05)。 PS 体外可显
著提高 NK 细胞杀伤活性(P<0.001)。结论　PS 可以通过增强 NK 细胞杀伤活力 , 促进淋巴细胞增殖 , 增强机
体特异性免疫功能而发挥抗肿瘤作用。 PS 还可以拮抗免疫抑制药所致的免疫抑制。
关键词:茯苓;茯苓多糖硫酸酯;抗肿瘤;免疫
中图分类号:R286.91　　　文献标识码:A　　　文章编号:0253-2670(2009)02-0268-04
　　茯苓系多孔菌 科真菌茯苓 Poria cocos
(Schw .)Wolf 的干燥菌核 ,是我国传统的利尿安神
药。茯苓多糖是茯苓的主要有效成分之一 ,将天然
多糖进行硫酸酯化修饰是多糖结构改造的一个研究
热点 ,多糖硫酸化后可以增强原有的生物活性或产
生新的功能 ,人工合成的硫酸化多糖除抗血栓 、抗凝
血[ 1]和抗病毒[ 2]功能外 ,近年来不断发现还具有其
他生物活性 ,如抗氧化[ 3] 、抗肿瘤 ,抗细胞黏附与转
移[ 4] 。由于茯苓多糖不溶于水 ,对其进行结构改造
以发挥其生物活性势在必行。本课题组在已有工作
的基础上 ,利用碱提酸沉法提取了茯苓菌核多糖 ,分
别以氯磺酸(Wolfrom 法)和氨基磺酸为磺化试剂
制备茯苓多糖硫酸酯 (PS)[ 5] 。通过单因子和正交
实验 ,研究茯苓多糖硫酸化的反应工艺 ,通过研究茯
苓多糖硫酸化反应的热动力学过程和产品的波谱学
特征 ,探索茯苓多糖硫酸化的反应机制和产物的分
子结构信息[ 6] 。结果显示 , Wolfrom 法制备的 PS
具有取代高 、相对分子质量小 、制备工艺不同等特
点 ,故本实验以 PS 为实验药物 ,系统研究其体内外
抗肿瘤 、免疫调节等活性及其机制 ,为其临床应用提
供依据 。
1　材料
1.1　实验动物:ICR 小鼠 ,雄性 ,(20±2)g ,南京医
科大学实验动物中心提供。
1.2　细胞株:小鼠肉瘤 S180 、小鼠淋巴瘤细胞 Yac-
1 ,南京中医药大学药理毒理研究室保存。
1.3　实验仪器:倒置显微镜系统 ,德国 Leica;NU-
6511 超低温冰箱 , 美国 Nuaire;PL511402 纯水系
统 ,美国 USF ;二氧化碳培养箱 ,美国 Fo rma;台式
冷冻离心机 ,美国 Beckman;P2-1000 微量移液器 ,
·268· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
＊ 收稿日期:2008-05-05作者简介:王爱云(1974—),女 ,助理研究员 ,博士生 ,研究方向为中药学。 T el:(025)86798154　E-mail:w ay9815@163.com＊通讯作者　焦庆才　T el:(025)83594376　E-mail:jiaoqc@yahoo.com