全 文 ：·药理与临床·
小檗碱抑制人乳腺癌 MDA2MB2231 细胞增殖及其与
过氧化物酶体增殖物激活受体γ的关系
章 　涛1 ,2 ,李苌清1 ,杨俊卿1 ,刘颖菊1 ,万敬员1 ,周岐新1 3
(11 重庆医科大学药学院 药理学教研室 ,重庆 　400016 ; 21 遵义医学院附属医院
贵州省细胞工程重点实验室 ,贵州 遵义 　563003)
摘 　要 :目的 　探讨小檗碱对人乳腺癌细胞 MDA2MB2231 体外生长的影响及其与过氧化物酶体增殖物激活受体γ
( PPARγ)的关系 ,以评价其在乳腺癌治疗中的应用潜力。方法 　采用 M T T 法检测小檗碱对 MDA2MB2231 细胞
的生长抑制效应 ; TUN EL 法检测细胞凋亡 ;联合 PPARγ拮抗剂 GW9662 ,分析小檗碱对 MDA2MB2231 细胞增殖
的影响与 PPARγ受体的关系 ;实验同时采用罗格列酮作为阳性药进行平行比较分析。结果 　小檗碱呈量2效和
时2效关系抑制 MDA2MB2231 细胞生长 ,24 h 的半数抑制浓度 ( IC50 ) 为 0121μmol/ L ;小檗碱诱导 MDA2MB2231
细胞凋亡作用随药物浓度的增加而增强 ; PPARγ受体拮抗剂不能逆转小檗碱对细胞增殖的抑制作用。结论 　小
檗碱可明显抑制 MDA2MB2231 细胞生长 ,但与罗格列酮不同 ,其作用不通过 PPARγ受体介导 ;小檗碱诱导 MDA2
MB2231 细胞凋亡的效应较罗格列酮更为显著 ;小檗碱可望成为治疗乳腺癌的有效药物。
关键词 :小檗碱 ; MDA2MB2231 细胞 ; 抗肿瘤效应 ; 过氧化物酶体增殖物激活受体γ ( PPARγ)
中图分类号 :R286191 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0220244204
Anti2proliferation of berberine on human breast cancer cell l ine MDA2MB2231
and its relationship to PPARγ
ZHAN G Tao1 ,2 , L I Chang2qing1 , YAN G J un2qing1 , L IU Ying2ju1 , WAN Jing2yuan1 , ZHOU Qi2xin1
(11Department of Pharmacology , College of Pharmaceutical Sciences , Chongqing Medical University ,
Chongqing 400016 , China ; 2. Key Laboratory of Cell Engineering of Guizhou Province ,
Affiliated Hospital of Zunyi Medical College , Zunyi 563003 , China)
Abstract : Objective 　To investigate t he anti2t umor effect s and it s relationship to peroxisome prolifera2
tor2activated receptorγ ( PPARγ) of berberine on human breast cancer cell line MDA2MB2231 in order to
evaluate the potential application value of berberine for breast cancer therapy. Methods 　Cytostatic effect s
of berberine on MDA2MB2231 cells were measured by M T T assay. Apoptotic cells were determined by
Tunel assay. MDA2MB2231 Cells were t reated with berberine alone or in combination wit h PPA Rγantago2
nist GW9662 to investigate the effect s of berberine on t he cells p roliferation and it s relationship to PPARγ.
Results 　M T T Analysis detected t hat berberine could inhibit t he growt h of MDA2MB2231 cells in a concen2
t ration and time2dependent manner wit h IC50 values of 0. 21μmol/ L at 24 h after t he drug added into t he
cult ure. Apparent apoptosis of MDA2MB2231 cells induced by berberine was observed and t he apoptotic
rates could be going up with t he concent ration of berberine increased. The inhibitory effect of berberine on
cell p roliferation could not be reversed by PPARγ selective antagonist GW9662. Conclusion 　In addition to
inhibiting of MDA2MB2231 cells growt h which was independent of PPA Rγ, berberine can also induce t he
cells′apoptosis which suggest s t hat berberine might be an effective and promising agent for t he t reatment
of breast cancer .
Key words : berberine ; MDA2MB2231 cells ; anti2t umor effect ; peroxisome proliferator2activated recep2
torγ ( PPA Rγ)
　　乳腺癌现已跃居我国女性恶性肿瘤发病数的首 位 ,但是目前为止 ,对于一些类型的乳腺癌还缺乏有
·442· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
3 收稿日期 :2008205211
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30572353)
作者简介 :章　涛 (1969 —) ,男 ,浙江省湖州市人 ,副教授 ,医学博士 ,主要从事分子药理学和肿瘤生物治疗研究。
Tel : (0852) 8608806 　E2mail : oceanzt @163. com3 通讯作者　周岐新　E2mail : cqzhouqx @yahoo. com. cn
效的治疗方法 ,如雌激素受体阴性乳腺癌细胞对于
激素治疗不敏感 ,而表达乳腺癌耐药蛋白 ( breast
cancer resistance protein , BCRP) 的乳腺癌具有多
药耐药性 ,化疗药物治疗效果差[1 ] 。寻找新的治疗
途径和药物以提高尤其是特殊类型乳腺癌的治疗效
果 ,是现阶段需要重点研究和解决的问题之一。目
前 ,以小檗碱为主要成分的黄连生物碱 ( Copti dis
rhi z om a alkaloid) 防治肿瘤方面的研究令人瞩目 ,
但其药效学特点和价值仍有待于评价。本研究从细
胞增殖和凋亡等方面探讨了小檗碱对雌激素受体阴
性乳腺癌 MDA2MB2231 细胞的体外生物学效应的
影响 ,并对其抑制 MDA2MB2231 细胞增殖与过氧
化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome prolifera2
tor2activated receptorγ,PPARγ) 的关系进行了初
步探讨 ,为今后小檗碱临床应用于乳腺癌治疗提供
理论依据。
1 　材料与方法
111 　材料 :人乳腺癌细胞株 MDA2MB2231 购自中
国科学院上海细胞库。小檗碱、M T T、PPA Rγ受体
拮抗剂 GW9662 为 Sigma 公司产品 ;罗格列酮购自
重庆康尔威药业公司 (批号 200521) ; TUN EL 细胞
凋亡原位检测试剂盒为南京凯基生物公司产品 ;
RPMI 1640 培养基、小牛血清购自 HyClone 公司 ;
其他试剂均为分析纯。主要仪器 : Coulter counter
细胞计数仪 (Beckman Coulter 公司) ; Safire 全波
长酶标仪 ( TECAN 公司) ; FACS Calibur 流式细胞
仪 (Becton2 Dickinson 公司) 。由于小檗碱、罗格列
酮和 GW9662 难溶于水 ,和二甲基亚砜 (DMSO)
配制成 011 mol/ L 的母液 , - 20 ℃冰箱保存备用 ,
临用时用培养基按照所需要的终浓度稀释后使用。
112 　方法
11211 　细胞培养 : MDA2MB2231 细胞培养于含
10 % 小牛血清的 RPMI 1640 培养基中 ,常规添加
青霉素 (1 ×105 U/ L ) 与链霉素 (100 mg/ L ) ,于
37 ℃、5 % CO2全湿环境下培养。
11212 　细胞增殖抑制的 M T T 检测 :取对数生长期
的 MDA2MB2231 细胞 ,计数并调整密度为 112 ×
108 / L ,以每孔 100μL 接种于 96 孔板中培养 ,15 h
后更换培养基 ,设置 011 % DMSO 对照组和不同浓
度小檗碱药物组 (1 ×10 - 8 、1 ×10 - 7 、1 ×10 - 6 、1 ×
10 - 5 、1 ×10 - 4 mol/ L) ,每组设 8 个复孔。继续培养
24 h 后 ,加入 10μL M T T (5 g/ L) 孵育 4 h ,弃上
清 ,每孔加入 100μL DMSO ,振荡 10 min 待结晶溶
解 ,于酶标仪上测定 570 nm 波长的吸光度 ( A 570 )
值 ,计算不同浓度小檗碱对 MDA2MB2231 细胞的
生长抑制率[生长抑制率 = (1 - 药物组 A 570 / 对照组
A 570 ) ×100 %]。将药物浓度的对数值和抑制率拟
合后计算出半数抑制浓度 ( IC50 ) 。根据上述实验的
量2效关系结果 ,选择合适的小檗碱浓度 ,作为时2效
关系分析的药物浓度 ,分别设置药物作用 8、16、24、
48、72 h 共 5 个 干 预 时 间 段 , 同 上 法 进 行
M T T 检测。
11213 　细胞增殖影响与 PPA Rγ受体关系 :取对数
生长期细胞 ,细胞计数并调整密度为 5 ×107 / L ,以
每孔 1 mL 接种于 6 孔板中培养。第 2 天更换含不
同药物组合的新鲜培养基 , 包括 011 % DMSO、
1μmol/ L 小 檗 碱、5 μmol/ L GW9662 以 及
1μmol/ L 小檗碱与 5μmol/ L GW9662 联用共 4
个组 ,另外设 011 % DMSO、110μmol/ L 罗格列酮、
5μmol/ L GW9662 以及 110μmol/ L 罗格列酮与
5μmol/ L GW9662 联用 4 个组作为阳性对照。分
别于用药后第 2、4、6 天收集细胞计数 ,每组计 3 个
复孔 ,求其平均值。
11214 　TUN EL 法检测细胞凋亡 :将预铺多聚赖氨
酸的盖玻片放入 6 孔培养板中 ,每孔接种 3 ×105个
细胞 ,第 2 天更换为含 1 ×10 - 6 、1 ×10 - 5 、1 ×10 - 4
mol/ L 3 种不同浓度小檗碱的新鲜培养基。药物作
用 36 h 后弃培养液 , PBS 洗 1 次 ,4 % 多聚甲醛室
温固定 25 min ,按照原位检测试剂盒说明操作 ,最
后以 DAB 显色、甲基绿衬染 ,每个浓度作 2 个复
孔。在高倍镜 ( ×200) 视野下 ,随机选取 10 个视
野 ,以凋亡细胞在全部细胞中所占的比例计算
凋亡率。
11215 　统计学处理 :以上实验均重复 3 次 ,并以罗
格列酮作为阳性对照药进行平行比较分析。实验数
据以 x ±s 表示 ,用 SPSS 1310 软件包对实验数据
进行方差分析。
2 　方法
211 　小檗碱对 MDA2MB2231 细胞体外生长抑制作
用 :MDA2MB2231 抑制作用随小檗碱浓度增加而加
剧 ,呈明显的量2效关系 (图 1 ,图 22A) ,小檗碱干预细
胞 24 h 的 IC50 为 0121μmol/ L。随着小檗碱 (1 ×
10 - 6 mol/ L) 作用时间的延长 ,MDA2MB2231 细胞的
抑制效应相应增强 ,时2效关系明显 (图 22B) 。
212 　小檗碱抑制 MDA2MB2231 细胞增殖与
PPARγ受体的关系 :小檗碱 (1μmol/ L) 给药后第
2、4、6 天的细胞计数分别为 ( 1138 ±0112) ×
105 、(11120 ±1131) ×105 、(15107 ±1160) ×105个/ 孔 ,
·542·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
图 1 　小檗碱对 MDA2MB2231 细胞体外生长形态改变的影响
Fig. 1 　Effect of berberine on morphological change of MDA2MB2231 cells growth in vit ro
A2量2效关系　B2时2效关系 　12罗格列酮 (11 0μmol ·L - 1 ) 　22
小檗碱 (110μmol ·L - 1)
A2dose2dependent manner 　B2time2dependent manner 　12rosig2
litazone (1. 0μmol ·L - 1) 　22berberine (1. 0μmol ·L - 1)
图 2 　小檗碱对 MDA2MB2231 细胞的体外增殖抑制
效应 ( x ±s , n = 24)
Fig. 2 　Inhibition of berberine on proliferation of MDA2
MB2231 cells in vit ro ( x ±s , n = 24)
与 011 % DMSO 对照组 ( 2146 ±0144 ) ×105 、
(17110 ±1169) ×105 、(28182 ±2179) ×105个/ 孔比
较 ,两组差异显著 ( P < 0101) ,说明小檗碱能明显抑
制 MDA2MB2231 细胞增殖 ;而与 PPA Rγ受体拮抗
剂 GW9662 (5μmol/ L) 和小檗碱 (1μmol/ L) 联
用组的细胞计数 [ 分别为 ( 1158 ±0119 ) ×105 、
(10181 ±1110) ×105 、(13190 ±1143) ×105 个/ 孔 ]
比较 ,差异无统计学意义 ( P > 0105) (图 32B) ,说明
小檗 碱 抑 制 MDA2MB2231 细 胞 增 殖 与 激 活
PPARγ受体无关。而 GW9662 (5μmol/ L ) 与罗
格列酮 (1μmol/ L) 联用组的细胞计数高于罗格列
酮组的细胞计数 ( P < 0105) ,说明罗格列酮抑制
MDA2MB2231 细胞增殖与激活 PPA Rγ受体有关
(图 32A) 。
213 　小 檗 碱 诱 导 MDA2MB2231 细 胞 凋 亡 :
TUN EL 法检测不同浓度罗格列酮作用 MDA2MB2
231 细胞 36 h 后 ,仅 1 ×10 - 4 mol/ L 浓度下即可明
与对照组比较 : 3 3 P < 0101 ; 　与罗格列酮组比较 : △P < 0105
12对照 ( 011 % DMSO) 　22罗格列酮 ( 11 0 μmol ·L - 1 ) 　32
GW9662 (51 0μmol ·L - 1 ) 　42罗格列酮 + GW9662 　52小檗碱
(110μmol ·L - 1) 　62小檗碱 + GW96623 3 P < 01 01 vs cont rol group ; △P < 0105 vs rosiglitazone group
A2cont rol (0. 1 % DMSO) 　22rosiglitazone (1. 0μmol ·L - 1 ) 　32
GW9662 (51 0μmol ·L - 1) 　42rosiglitazone + GW9662
52berberine (1. 0μmol ·L - 1) 　62berbering + GW9662
图 3 　小檗碱对 MDA2MB2231 细胞的增殖抑制作用
与 PPARγ关系 ( x ±s , n = 9)
Fig. 3 　Inhibition of berberine on proliferation of MDA2
MB2231 cells and its relationshiop to PPARγ
( x ±s , n = 9)
显检测到凋亡细胞 ,其形态皱圆、细胞核呈棕黄色 ,
细胞凋亡发生率为 (18 ±3) %;1 ×10 - 6 、1 ×10 - 5 、1 ×
10 - 4 mol/ L 小檗碱干预 MDA2MB2231 细胞 36 h 后
的凋亡发生率分别为 (18 ±3) %、(60 ±5) %、(90 ±
6) % ,其致 MDA2MB2231 细胞凋亡作用显著 (图 4) 。
3 　讨论
　　迄今为止 ,有关中草药使用的安全性和有效性
的争议 ,极大地限制了包括黄连在内的中药材在临
床上的科学合理使用。因此 ,围绕中药材有效成分
及药理作用机制的研究显得尤为紧迫。现有研究表
明 ,黄连 Copti dis rhi z om a 的有效成分是生物碱 ,
其中小檗碱约占黄连总生物碱的 90 % 左右。研究
·642· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
图 4 　小檗碱对 MDA2MB2231 细胞的凋亡作用
Fig. 4 　Apoptosis of MDA2MB2231 cells induced
by berberine at various concentration
显示 ,黄连生物碱及以黄连为主药的复方制剂具有
清除自由基、降血糖和逆转糖尿病大鼠胰腺组织的
病理损害、调节脂质代谢、抗消化性溃疡、阻遏神经
元退行性变、防治肿瘤等作用[2～4 ] 。
小檗碱是黄连提取物抗细胞增殖活性的主要成
分[5 ] 。以往研究也显示 ,小檗碱是黄连总碱抗肿瘤
作用的主要有效成分 ,5 mg/ L 小檗碱已对人结肠
癌细胞株 HCT116 和 SW480 有显著杀伤作用[6 ] 。
Hwang 等[7 ] 报道 ,小檗碱诱导肝癌细胞株 Hep G2
凋亡依赖于激活 caspase28 和 caspase23 ,并可明显
下调抗凋亡因子 Bcl2XL 的表达。本研究针对雌激
素受体阴性乳腺癌 MDA2MB2231 细胞的研究结果
显示 , 1μmol/ L 小檗碱即可明显抑制 MDA2MB2
231 细胞的增殖 ,随着药物浓度的提高 ,细胞凋亡率
上升 ,100μmol/ L 小檗碱诱导的细胞凋亡率高达
(90 ±6) % ,其抑制 MDA2MB2231 细胞增殖和诱导
细胞凋亡的效应均强于罗格列酮。
近年来研究发现 ,由罗格列酮、吡格列酮和环格
列酮等组成的噻唑烷二酮类 ( t hiazolidinedione ,
TZD) 人工合成 PPARγ激动剂能够抑制多种组织
来源的肿瘤细胞的生长 ,使得激活 PPARγ受体极
有希望成为治疗多种恶性肿瘤的新途径[8 ,9 ] 。根据
小檗碱对染色体的特殊亲和力[10 ] ,提出其抗肿瘤作
用机制的靶点很可能在细胞染色体特定区域或基因
位点 , 从而抑制肿瘤细胞生长的观点 , 这恰好
与 PPARγ受体激活后结合特定DNA序列作用方式
一致 ,加之目前研究所显示的小檗碱的药理作用与
PPARγ配体的作用所涉及范围一致 ,因此 ,值得就
小檗碱抗肿瘤等作用与 PPARγ关系进行研究。本
研究采用特异性 PPA Rγ受体拮抗剂 GW9662 的
结果显示 ,联用 PPARγ受体拮抗剂并不能逆转小
檗碱对 MDA2MB2231 细胞的增殖抑制作用 ,由此
可初步确定小檗碱对 MDA2MB2231 细胞的增殖抑
制作用不经 PPARγ受体介导。
综上所述 ,小檗碱抑制 MDA2MB2231 细胞增
殖和诱导其凋亡的效应均强于罗格列酮 ,但与罗格
列酮不同的是 ,其抑制细胞增殖作用不经 PPARγ
受体介导。这使得下一步应围绕小檗碱是否为
PPARγ激动剂 ,以及其抗肿瘤作用与另一调节细胞
增殖密切相关的核受体 —视黄酸受体 ( RA R) 的关
系等进行研究 ,这对最终阐明小檗碱的抗肿瘤作用
机制和评价其作为治疗包括乳腺癌等肿瘤的应用潜
力具有重要意义。
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·742·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月