全 文 ：培养基成分对云南红豆杉细胞生长和产生 102去乙酰巴卡亭Ⅲ的影响
李海峰1 ,赵志莲2 ,刘光明1 3
(11 云南省大理学院药学院 ,云南 大理 　671000 ; 21 大理农业学校 ,云南 大理 　671003)
摘 　要 :目的 　研究 B5 培养基主要成分对云南红豆杉 Tax us y unnanensis 细胞生长和产生 102去乙酰巴卡亭 Ⅲ的
影响。方法 　利用植物组织培养技术结合 HPLC 分析手段 ,通过改变 B5 培养基中 CaCl2 、Na H2 PO4 、(N H4 ) 2 SO4
和 KNO3 的质量浓度 ,研究其对云南红豆杉细胞生长及 102去乙酰巴卡亭 Ⅲ量的影响。结果 　试验组与对照品相
比 ,B5 培养基中高质量浓度的 Na H2 PO4 能够显著促进云南红豆杉细胞生长 ,CaCl2 、(N H4 ) 2 SO4 和 KNO3 浓度对
细胞生长无显著影响 ;B5 培养基中低质量浓度的 CaCl2 、Na H2 PO4 、(N H4 ) 2 SO4 和 KNO3 能够显著促进 102去乙酰
巴卡亭 Ⅲ合成与释放。结论 　B5 培养基中 Na H2 PO4 为 300 mg/ L 时 ,能够显著促进云南红豆杉细胞生长 ,细胞生
长量是对照的 112 倍 ,CaCl2 、(N H4 ) 2 SO4 和 KNO3 分别在 75～300、134～268 和2 500～5 000 mg/ L 对细胞生长无
显著影响 ;B5 培养基中 CaCl2 、Na H2 PO4 、(N H4 ) 2 SO4 和 KNO3 的质量浓度分别为 75、75、3315、625 mg/ L 时 ,能够
显著促进细胞中 102去乙酰巴卡亭 Ⅲ合成与释放 ,102去乙酰巴卡亭 Ⅲ的量分别是对照的 115、114、214 倍。
关键词 :云南红豆杉 ;细胞生长 ;102去乙酰巴卡亭 Ⅲ;培养基
中图分类号 :R28216 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 1021644203
　　102去乙酰巴卡亭 Ⅲ(102deacetyl baccatin Ⅲ,
简写为 102DAB Ⅲ) [ 1 ]是从红豆杉短枝叶中分离、提
取得到的一种紫杉烷二萜类化合物 ,不但自身有抗
癌活性 ,而且是生物合成与化学半合成紫杉醇和多
烯紫杉醇的重要前体化合物 ,在解决临床治疗和科
学研究用紫杉醇和多烯紫杉醇的药源问题中起着不
可替代的作用。自从 1991 年 Christen 等[2 ] 获得红
豆杉细胞培养的第一个专利以来 ,红豆杉细胞培养
生产紫杉醇成为植物组织培养生产次生代谢产物研
究的热点之一。虽然这方面的报道很多[ 3～5 ] ,笔者
在云南红豆杉 T ax us y unnanensis Cheng et L1 K1
Fu[6 ]细胞培养过程中发现 ,细胞培养物中 102DAB
Ⅲ的量高达千分之一以上 ,比天然云南红豆杉植物
枝叶中的量高 5～8 倍 ,所以提高红豆杉细胞培养物
中 102DAB Ⅲ的量比提高紫杉醇的量更容易。通过
红豆杉细胞培养生产 102DAB Ⅲ,再经过化学半合
成生产紫杉醇和多烯紫杉醇 ,是一条不破坏红豆杉
野生植物资源基础上能实现资源再生利用的有效途
径。因此 ,本实验主要研究了 B5 培养基中 CaCl2 、
Na H2 PO4 、(N H4 ) 2 SO4 和 KNO3 的质量浓度对云南
红豆杉细胞生长和 102DABⅢ合成与释放的影响。
1 　材料与方法
111 　仪器与试剂 :美国惠普公司 Agilent 1100 高效
液相色谱仪 ,赛样台式计算机 (Agilent ChemStation
色谱工作站) 。SY8200 T 超声波清洗器 (上海声源
超声波仪器设备有限公司) ,AB104 电子天平 (瑞士
Mettletoledo 公司) 。
102DAB Ⅲ对照由 Sigma 公司提供 (质量分数 >
99 %) ;高效液相用水为三重蒸馏水、乙腈和甲醇均
为色谱纯 ;其余试剂为分析纯。
112 　材料 :供试材料云南红豆杉 T1 y unnanensis
Cheng et L1 K1 Fu 细胞株 T YN06 ,为本课题组从
云南红豆杉生长点诱导而来的一个普通细胞系。
113 　诱导试验[ 7 ] : CaCl2 质量浓度以 B5 培养基标
准量为对照 ,分别设为标准量的 1/ 4、1/ 2、2、4 倍 4
个水平 ;Na H2 PO4 质量浓度以 B5 培养基标准量为
对照 ,分别设为标准量的 1/ 4、1/ 2、2、4 倍 4 个水平 ;
(N H4 ) 2 SO4 和 KNO3 质量浓度以B5 培养基标准量
为对照 ,分别设为 (N H4 ) 2 SO4 标准量、KNO3 标准
量、(N H4 ) 2 SO4 和 KNO3 标准的 1/ 4、( N H4 ) 2 SO4
和 KNO3 标准量的 1/ 2、(N H4 ) 2 SO4 和 KNO3 标准
量的 2 倍、(N H4 ) 2 SO4 和 KNO3 标准量的 4 倍 6 个
水平。基本培养基均为 :B5 + 2 , 42D 110 mg/ L +
KT 011 mg/ L 、蔗糖 30 g/ L ,p H 值为 518 的液体培
养基。按实验设计在培养基配制时分别添加不同质
量浓度的物质 ,培养容器为 250 mL 玻璃三角瓶 ,每
瓶加入 100 mL 培养液 ,120 ℃高压灭菌 15 min ,每
瓶接种新鲜细胞 1010 g ,每个处理设 5 次重复。培
·4461· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
3 收稿日期 :2008212215　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :云南省教育厅科研基金资助项目 (06J316C)
作者简介 :李海峰 (1971 —) ,男 (白族) ,云南大理人 ,副教授 ,硕士 ,从事药用植物细胞培养及次生代谢产物的研究工作。　
Tel :13170764216 　E2mail :lihfzh888 @sina1com
养条件均为 25 ℃暗培养 ,摇床转速 120 r/ min。
114 　细胞生长量的测定 :各试验培养 30 d 后收集
细胞 ,蒸馏水洗涤 ,在 50 ℃下真空干燥至恒重 ,进行
细胞生长量 (细胞生长量 = 最终收获细胞干质量 -
接种细胞干质量)测定。每个处理重复测定 5 次 ,所
得数据用 SPSS1310 统计软件进行差异显著性多重
(Duncan)分析。
115 　102DAB Ⅲ的提取和测定 :102DAB Ⅲ的提取和
测定按照李海峰等[8 ]建立的方法进行。精密称取真
空干燥至恒重的样品粉末 015 g 到 100 mL 量瓶中 ,
加入 20 mL 甲醇 ,超声处理 30 min ,浸泡 24 h ,滤
过 ,滤渣分别用 10 mL 甲醇按此步骤重复处理 2
次 ,合并 3 次提取的滤液 ,水浴浓缩 ,加入醋酸乙酯2
5 % Na HCO3 (1 ∶1) 40 mL 萃取 ,收集醋酸乙酯层 ,
水层再分别用 10 mL 醋酸乙酯萃取两次 ,合并 3 次
萃取的醋酸乙酯层 ,水浴挥干溶剂 ,用 5 mL 甲醇定
容 ,0145μm 滤膜滤过 ,滤液供高效液相色谱分析
用。色谱条件 : C18 色谱柱 ( 250 mm ×416 mm ,
5μm) ,流动相甲醇2乙腈2水 (42 ∶13 ∶45) ,检测波
长 234 nm ,体积流量 110 mL/ min ,柱温 32 ℃,进样
量 10μL , H PL C 测定 102DAB Ⅲ量 (干物质量) ,色
谱图见图 1。每个处理重复测定 3 次 ,所得数据用
SPSS1310 统计软件进行差异显著性多重 (Duncan)
分析。
t/ min3 210DAB Ⅲ
图 1 　102去乙酰巴卡亭 Ⅲ对照品( A)和样品( B)色谱图
Fig11 　HPLC Chromatograms of 102deacetyl baccatin Ⅲ
reference substance ( A) and sample ( B)
2 　结果与分析
211 　CaCl2 对云南红豆杉细胞生长和 102DAB Ⅲ形
成的影响 :如表 1 所示 ,B5 培养基中 CaCl2 质量浓
度在 75～300 mg/ L 对细胞生长无显著影响。但
是 ,CaCl2 对 102DAB Ⅲ合成与释放有较大影响 ,质
量浓度为 75 mg/ L 时 ,能够显著促进 102DAB Ⅲ合
成与释放 ,达到01701 3 mg/ L ,是对照的 115 倍 ;
CaCl2 质量浓度过高或过低都不利于 102DAB Ⅲ合
成与释放。因此 ,从细胞生长和 102DAB Ⅲ合成与
释放来分析 , B5 培养基中 CaCl2 质量浓度以 75
mg/ L为宜。
表 1 　CaCl2 质量浓度对云南红豆杉细胞生长
和 102脱乙酰巴卡亭 Ⅲ质量分数的影响
Table 1 　Effect of various concentration of CaCl2
on cell growth and 102deacetyl baccatin
Ⅲcontent of T1 yunnanensis
CaCl2/
(mg ·L - 1)
细胞生长量/ g
102脱乙酰巴卡亭Ⅲ/
(mg ·g - 1)
371 5 　 01 430 7 ±01005 7 c 01 159 4 ±01000 6 d
75 01 612 0 ±01043 6 a 01 701 3 ±01003 5 a
150 (CK) 　 01 598 7 ±01014 1 a 01 483 6 ±01002 6 b
300 01 626 6 ±01015 0 a 01458 2 ±01 002 7 c
600 01 509 8 ±01016 3 b 01 153 8 ±01003 3 d
　　不同字母表示差异显著 ,下表同。
　　Different letters wit hin columns represent significant differ2
ences , following tables are same
212 　Na H2 PO4 对云南红豆杉细胞生长和 102DAB
Ⅲ形成的影响 : 如表 2 所示 , B5 培养基中随着
Na H2 PO4 质量浓度升高细胞生长量逐渐增加 ,当
Na H2 PO4 为 300 mg/ L 时 ,细胞生长量达到最高 ;
Na H2 PO4 质量浓度再升高 ,细胞生长量呈递减趋
势。102DAB Ⅲ的量随着 Na H2 PO4 质量浓度的升
高而降低 ,当 Na H2 PO4 为 75 mg/ L 时 ,能够显著促
进 102DAB Ⅲ合成与释放 ,量达到最高 ,是对照的
114 倍 ;Na H2 PO4 过低时 ,不适宜 102DAB Ⅲ合成与
释放。因 此 , B5 培 养 基 中 适 宜 细 胞 生 长 的
Na H2 PO4 为 300 mg/ L ,适宜 102DAB Ⅲ合成与释
放的质量浓度为 75 mg/ L 。
表 2 　Na H2 PO4 质量浓度对云南红豆杉细胞生长
和 102脱乙酰巴卡亭 Ⅲ质量分数的影响
Table 2 　Effect of various concentration of Na H2 PO4
on cell growth and 102deacetyl baccatin Ⅲ
content of T1 yunnanensis
Na H2 PO4/
(mg ·L - 1)
细胞生长量/ g
102脱乙酰巴卡亭Ⅲ/
(mg ·g - 1)
371 5 　 01 440 8 ±01004 8 e 01 107 3 ±01008 1 e
75 01 518 2 ±01008 1 d 01 659 8 ±01001 4 a
150 (CK) 　 01 598 7 ±01014 1 b 01 483 6 ±01002 6 b
300 01 728 6 ±01007 2 a 01459 1 ±01 007 9 c
600 01 540 7 ±01002 5 c 01 235 3 ±01003 4 d
213 　(N H4 ) 2 SO4 和 KNO3 对云南红豆杉细胞生长
和 102DAB Ⅲ形成的影响 :如表 3 所示 ,B5 培养基只
添加 (N H4 ) 2 SO4 时 ,有利于 102DAB Ⅲ合成与释放 ,
但是对细胞生长有明显的抑制作用 ;B5 培养基只添
加 KNO3 时 ,对 102DAB Ⅲ合成与细胞生长都有明
显的抑制作用。随着 (N H4 ) 2 SO4 和 KNO3 质量浓
度升高 ,细胞生长量逐渐增加 , ( N H4 ) 2 SO4 为 268
mg/ L 、KNO3 为5 000 mg/ L时 ,细胞生长量达到最
高 ; (N H4 ) 2 SO4 和 KNO3 质量浓度过高或过低都不
·5461·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
适宜细胞生长。随着 (N H4 ) 2 SO4 和 KNO3 质量浓
度升高 ,102DAB Ⅲ的量逐渐降低 ,当 (N H4 ) 2 SO4 为
3315 mg/ L 、KNO3 为 625 mg/ L时 ,能显著促进 102
DAB Ⅲ合成与释放 ,质量分数高达 11149 mg/ g ,是
对照的 2 倍。因此 ,适宜细胞生长的 (N H4 ) 2 SO4 为
268 mg/ L 、KNO3 为5 000 mg/ L ,适宜 102DAB Ⅲ合
成与释放的 ( N H4 ) 2 SO4 为 3315 mg/ L 、KNO3 为
625 mg/ L 。
表 3 　( NH4 ) 2 SO4 和 KNO3 质量浓度对云南红豆杉细胞
生长和 102脱乙酰巴卡亭 Ⅲ质量分数的影响
Table 3 　Effect of various concentration of ( NH4 ) 2 SO4
and KNO3 on cell growth and 102deacetyl
baccatin Ⅲcontent of T1 yunnanensis
(N H4 ) 2 SO4 /
(mg ·L - 1 )
KNO3 /
(mg ·L - 1 )
细胞生长量/ g
102脱乙酰巴卡亭 Ⅲ/
(mg ·g - 1 )
134 0 01068 8 ±01 001 9 e 01 429 9 ±01043 1 d
0 2 500 01129 0 ±01 049 4 d 01 175 4 ±01012 7 e
331 5 625 01 256 9 ±01 010 7 c 11 149 0 ±01006 2 a
67 1 250 01405 5 ±01 014 7 b 01 804 9 ±01102 0 b
134 (C K) 2 500 (CK) 01598 7 ±01 014 1 a 01 483 6 ±01002 6 c
268 5 000 01623 5 ±01 010 4 a 01 184 2 ±01002 6 e
536 10 000 01139 1 ±01 049 9 d 01078 1 ±01 001 8 f
3 　讨论
钙、磷和氮是植物组织培养基中的大量元素 ,在
植物组织培养过程中具有重要的生理作用[ 9 ] ,对植
物组织生长和分化具有重要的影响 ,但是 ,有关培养
基中钙、磷和氮对植物细胞培养次生代谢产物量的
影响研究较少。从本实验的结果可知 :B5 培养基中
氯化钙在较大质量浓度范围内 (75～300 mg/ L ) 对
云南红豆杉细胞生长没有显著影响 ;低质量浓度的
氯化钙 (75 mg/ L) 能显著促进 102DAB Ⅲ形成与释
放 ,主要原因可能是在红豆杉细胞培养过程中低质
量浓度的 Ca2 + 更能激活参与 102DAB Ⅲ合成酶的活
性 ,其次低质量浓度的 Ca2 + 更容易与钙调素结合作
为第二信使 ,诱导与植物抗病毒有关基因组的启动 ,
从而能够促进植物细胞产生与抗病毒有关的次生代
谢产物 ,因此 ,能够显著促进红豆杉细胞中与抗病毒
有关的次生代谢产物 102DAB Ⅲ合成与释放。B5 培
养基中磷酸二氢钠质量浓度较高 (300 mg/ L) 时 ,有
利于云南红豆杉细胞生长 ,这与胡萍等[ 10 ] 在悬浮培
养过程中磷的补加对南方红豆杉细胞生长和细胞活
力没有显著影响的研究结果相反 ;磷酸二氢钠质量
浓度 (75 mg/ L)较低时 ,能够促进 102DAB Ⅲ合成与
释放 ,主要原因可能是 102DAB Ⅲ生物合成的第一
步是由二甲基丙烯基焦磷酸合成香叶基焦磷酸开
始 ,适宜浓度的磷酸二氢钠在 102DAB Ⅲ生物合成
过程中起着重要作用。B5 培养基中氮源对云南红
豆杉细胞生长和 102DAB Ⅲ合成有重要影响 :铵态
氮 ( N H4 + ) 有利于 102DAB Ⅲ的合成 , 硝态氮
(NO3 - )有利于细胞生长。陈永勤等[11 ] 的研究也发
现 :提高培养基中 N H4 + 浓度 ,能够显著提高红豆杉
细胞培养物中紫杉醇的量 ,提高培养基中 NO3 - 浓
度有利于愈伤组织的生长。培养基中硫酸铵 (268
mg/ L)和硝酸钾 (5 000 mg/ L ) 较高时 ,有利于 102
DAB Ⅲ合成与释放 ;培养基中硫酸铵 (3315 mg/ L )
和硝酸钾 (625 mg/ L ) 较低时 ,有利于 102DAB Ⅲ合
成与释放。
从本实验结果与讨论可知 : B5 培养基中
Na H2 PO4 、CaCl2 、( N H4 ) 2 SO4 和 KNO3 质量浓度
分别在 300、75～300、134～268、2 500～5 000 mg/
L 有利于细胞生长 ;B5 培养基中 Na H2 PO4 、CaCl2 、
(N H4 ) 2 SO4 和 KNO3 分别为 75、75、3315、625 mg/
L 时 ,最有利于 102DAB Ⅲ合成与释放。而有关 B5
培养基中这 4 种物质具体的作用机制及其协同作用
效果 ,有待进一步的深入研究。
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