全 文 ：·1214· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第8期2006年8月
成，进而抑制了肿瘤的生长和转移。
现代医学认为，肿瘤的侵袭与转移是一个多因
素参与、多步骤的复杂过程。抗血管生成仅是刍工鱼软
骨多糖抑制肿瘤生长和转移的机制之一，本课题组
将进一步筛选对红鱼软骨多糖敏感瘤株，并深入探
讨其抗肿瘤作用机制。
References：
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樟柳碱在Beagle犬血清中的药动学研究
黄 萤1’2，只德广2，徐为人2，刘昌孝2
(1．。中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所，天津300192；2．天津药物研究院
天津药代动力学与药效动力学省部共建国家重点实验室，天津300193)
摘 要：目的 建立高效液相色谱一质谱联用(LC—MS)测定Beagle犬血清中樟柳碱的分析方法。方法采用沉淀
及萃取相结合的方法提取样品，LC—MS分析方法，选择负离子测定模式，测定Beagle犬单剂量iv樟柳碱0．2rag／
kg后樟柳碱的血药浓度。结果该方法线性、回收率和重现性良好，批内、批间变异系数均在10％以内，样品提取
后24h内稳定，灵敏度可达到1ng／mL，出峰时间为3．1min，C⋯为(145．07±32．63)ng／mL，t一为(0．04±
0．06)h，AUC(o⋯为(361．10士26．01)mg·h／mL，CL为(5．56±0．41)L／h，ti／2为(1．67±0．34)h，Vd为
(13．39±3．05)L。结论此方法简便、快速，专属性强，灵敏度高，能够准确测定血中氢溴酸樟柳碱，有实际意义。
关键词：樟柳碱；高效液相色谱一质谱联用；药动学；血药浓度
中图分类号：R285．61 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)08—1214一04
PharmaeokinetiesofanisodineinBeagledogsserumbyLC—MS
HUANGYin91”，ZHIDe—guan92，XUWei—ren2，LIUChang—xia02
(1．InstituteofRadiationMedicine，ChineseAcademyofMedicalScienceandPekingUnionMedicalCo lege，Tianjin
300192，China；2．TianjinStateK yLaboratoryofPharmacokineticsandPharmacodynamics，
TianjinInstituteofPharmaceuticalResearch，Tianjin300193，China)
Keywords：anisodine；LC—MS；pharmacokinetics；drugconcentration
莨菪类药物樟柳碱(anisodine)是从茄科植物
山莨菪Anisodustanguticus(Maxim．)Pascher根
中提取得到的一种生物碱，为M胆碱受体阻断剂，
其化学结构和东莨菪碱相似，药理作用类似于阿托
品类化合物，具有较强的中枢和外周抗胆碱活性，也
有解除血管痉挛，改善微循环，解痉、平喘、抑制唾液
分泌，散瞳，对抗有机磷中毒等作用，其毒性比同类
药物山莨菪碱、阿托品、山莨菪低[1]。目前临床上主
要用氢溴酸樟柳碱治疗眼部缺血性疾病、视神经病
变及全身性血管病的眼底病变[2~4]。由于樟柳碱的
剂量低，导致用药后血药浓度极低，目前已报道的樟
柳碱的分析方法有高效液相色谱法[5’6]、高效毛细管
收稿日期：2006—01—25
电泳法、导数光谱法等口墙]，但这些方法均无法准确
地对其进行检测。本实验以LC—MS研究了Beagle
犬血清中樟柳碱的测定方法，同时研究了Beagle犬
iv后的药动学过程。
1材料
1．1试剂：甲醇，南开大学精益教育技术装备公司；
乙腈，天津市康科德科技有限公司；去离子水，天津
半导体研究所；三氯乙酸(TCA)，如皋市化学试剂
厂；三乙胺，天津市化学试剂批发公司产品；生理盐
水，大冢制药有限公司。
1．2 试验药品：氢溴酸樟柳碱(以下简称樟柳碱)
由北京紫竹药业有限公司提供；样品用前以生理盐
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第8期2006年8月·1215·
水配制成适当质量浓度用于iv给药。水杨酸(内标)
由天津药物研究院合成室提供，批号20030516。
1．3 仪器：NL一2000TPA分析天平，旧本岛津公
司；TGL一16B高速台式离心机，上海安亭科学仪器
厂；XW一80A型涡旋混和器，上海精科实业有限公
司；2695液一质联用仪，美国Waters公司。
1．4动物：雄性Beagle犬，体重8～10kg，由上海
新冈动物场提供，合格证书：沪动合格证字118号饲
育环境及设施，沪动合格证字119号实验用犬质量。
2方法
2．1樟柳碱的HPLC法测定
2．1．1 色谱条件：流动相，乙腈一0．1％甲酸(30：
70)；体积流量0．2mL／min；柱温30℃；固定相，C，。
柱(100mm×3．0mm，5肛m)；Waters2695液一质
联用仪，采用ESI源电喷雾离子化，选择负离子模
式，毛细管电压：300kV；碰撞电压：20V，分离电
压：4V，氮气体积流量为300L／h；离子源温度105
℃；进样量10弘L，樟柳碱m／z181．0，保留时间3．1
min；内标水杨酸m／z137．0，保留时间为6．1min。
2．1．2血样处理：取0．475mL血清样品加入25
牡L水杨酸乙醇溶液，混匀，加入1mol／LNaOH溶
液50弘L，混匀，静置3h，加入1mol／L盐酸100
弘L，放置10min，加1mL乙腈，振摇，离心，取上清
液以2mL醋酸乙酯提取，振摇，离心，取上层有机
相2mL，氮气吹干，以50弘L流动相复溶，10弘L
进样。
2．1．3标准曲线的制备：于0．45mL空白犬血清
中加入不同质量浓度的樟柳碱对照品溶液25肛L，
水杨酸溶液25弘L，得到终质量浓度为0、1、2、5、
10、50、100、500ng／mL樟柳碱和终质量浓度为100
ng／mL水杨酸的标准血清样品，重复操作，每个质
量浓度水平做5管样品。血样处理同上。
2．1．4 回收率试验：于0．45mL空白血清中加入
不同质量浓度的樟柳碱对照品溶液25肛L，水杨酸
溶液25肛L，得到终质量浓度为2、10、100ng／mL
樟柳碱和终质量浓度为100ng／mL的水杨酸标准
血清样品，每个质量浓度重复5个样品，同上法测
定。与所用初始质量浓度的常用液比较计算回收率。
2．1．5精密度试验：于0．45mL空白血清中加入
不同质量浓度的樟柳碱对照品溶液25肛L，水杨酸
溶液25弘L，得到终质量浓度为2、10、100ng／mL
樟柳碱和终质量浓度为100ng／mL水杨酸的标准
血清样品，每个质量浓度重复5个样品，同上法测
定，重复3批，计算批内、批间差异。
2．1．6样品稳定性试验：于0．45mL空白血清中加
入不同质量浓度的樟柳碱对照品溶液25肛L，水杨酸
溶液25肛L，得到终质量浓度为2、10、100ng／mL的
樟柳碱和终质量浓度为100ng／mL水杨酸的标准血
清样品，同上法每个质量浓度在试验过程中测定3次
(o、12、24h)，计算各测定值之间的差异。
2．1．7冻融稳定性：于0．90mL空白血清中加入
不同质量浓度的樟柳碱对照品溶液50弘L，水杨酸
溶液50肚L，得到终质量浓度为2、10、100ng／mL
樟柳碱和终质量浓度为100ng／mL的水杨酸的标
准血清样品，将以上样品分为两份，一份立即提取，
另一份冷冻保存，至24h后，取出进行同样的提取
操作，比较冻融前后的差异。
2．2血样采集及保存：雄性Beagle犬6只，禁食
12h，iv0．2mg／kg樟柳碱。于药后0、1、10、20、30、
45min和1、1．5、2、3、4、6、8、10h自肘静脉采3
mL全血，分离血清，冷冻保存至测定。
2．3数据处理：按上述方法处理测定后，计算不同
时间下的血药浓度和药代参数，达峰时间(￡⋯)和
峰浓度(C。。；)以实测值计算，末相消除速率(愚。)
以末相对数血药浓度时间曲线的直线部分拟合，末
相消除半衰期(t。／。)以0．693除以愚。计算，表观分
布容积Eva一剂量／(AUC×矗。)]，AUC。。以梯形法
计算，总清除率(CL)一剂量／AUC。
3 结果
3．1方法学验证
3．1．1方法特异性：氢溴酸樟柳碱的结构中有一个
碱性氮和酯键，一方面酯键在体内很容易水解，另一
方面，由于分子极性较大，需要碱化提取，在碱化过
程中分子也容易水解，这些因素容易造成原型药测
定的误差较大，在预试验中发现，樟柳碱在碱性条件
下放置一定时间后能定量水解产生一个酸和一个碱
性分子。用液一质联用测定樟柳碱的酸性碎片分子，
特异性较好，采用二级负离子测定，其m／z181碎片
离子吸收较强，能够准确、专一地测定出血清样品中
樟柳碱的浓度，图l给出了方法学特异性图谱。
3．1．2标准曲线：以测得的各标准血清样品的樟柳
碱的峰面积与内标峰面积的比值(A)对其质量浓
度(C)作直线回归，所得标准曲线为C一1075．434
A+1．528(r一0．998)，检测灵敏度为1ng／mL，线
性范围为1～500ng／mL。
3．1．3 回收率试验：2、10、100ng／mL的3个质量
浓度的标准血清样品各5个复管，测得的响应值与同
质量浓度的樟柳碱标准样品水溶液测得的结果相比
万方数据
·1216· 中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs笫37卷第8期2006年8月
所得的回收率分别为67．5％、89．5％、84．6％，平均
回收率为(80．5±12．2)％，RSD在20％以内。
3．1．4批内变异系数和批间变异系数：樟柳碱批
内、批间测定的准确性和重现性较好，血样比较稳
定，血清中樟柳碱质量浓度的RSD在10％以内。
B
0．04 3P 硼
—．．—．．．J、、．．．．．．—．．J‘、．．-．．．．．．．一一⋯⋯r⋯，I，，t。r—1P—7r”1””T11r—
Z0 4．0 ∞ &0
3．1．5 24h内样品稳定性：樟柳碱血清样品比较
稳定，不同时间的测定过程中高、中、低3个质量浓
度RSD在15％以内。
3．1．6冻融稳定性：2、10和100ng／mL3个质量
浓度的标准血清样品，冷冻24h前后的测定结果表
b-A
2铂
．．．．．。．．．．．．。fL、．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．一_’T””r——T”11”r—1’1r”””—一
20 4．0 60 80
—丽—万飞矿F 一三一—焉■—矿啊o
t|min
A—m／z151樟柳碱二级特征离子峰；B—m／z93内标水杨酸二级特征离子峰
A—secondarych acteristicionpeakofm／z151anisodineB—secondarycharacteristicionpeakofmfz93internalstandardsalicylicac d
图1 空白血清(a)、空白血清+樟柳碱+水杨酸(b)和Beagle犬iv樟柳碱2h血样(c)质谱图
Fig．1Masschromatogramofblankserum(a)，blankserum+anisodine+salicylicacid(b)，andserum
obtainedfromBeagledogs2hafterivanisodineatsingledoseof0．2mg／kg(c)
明，冷冻前后的量没有明显变化，RSD在15％以
内，因此血样的冷冻保存是合理的。
3．2樟柳碱血药浓度测定及药动学参数：6只Bea—
gle犬iv樟柳碱后，测得血中樟柳碱药时曲线见图
2。以每只动物的血药浓度时间数据计算药代参数，
结果见表1。
f
皇
岛
晕
蜊
避
黼
鲁
表1樟柳碱iv给药后药动学参数(一一6)0
Table1 Pharmacoklneticparametersofiv
anisodineInBeagledogs(辟一6)
4讨论
研究发现，樟柳碱在体内会部分水解，而此测定
方法是利用原型药物的体外完全水解产物来间接测
定原型药的血药浓度，所以该方法只能反映代谢产
物及原型药的整体代谢过程，而并不能准确地反映
原型药的代谢过程。
根据樟柳碱的紫外吸收波的峰形和响应值发
现，其最大吸收波长为210nm，正好位于末端吸收
|，h
图2樟柳碱iv给药后的Beagle犬血清樟柳碱药时曲线
Fig．2Meanserumconcentration—timecurveofanisodine
inBeagledogsobservedafterivadministration
atsingledoseof0．2mg／kg
位置，HPLC检测易受杂质干扰，难以进行专属、灵
敏的测定，而且樟柳碱剂量低，一般的检测技术很难
满足给药后血药浓度的测定要求。经研究发现，樟柳
碱在碱性条件下水解所生成的m／z181片段，采用
二级负离子测定，吸收较强，本实验使用LC—MS测
定Beagle犬血清中氢溴酸樟柳碱。研究结果表明：
使用该方法灵敏度可达到1ng／mL，出峰时间为
3．1rain，线性、回收率和重现性良好，批内、批间变
异系数均在10％以内，样品提取后24h内稳定，血
样保存方法不会影响样品的量，说明该方法可靠性
较好。因此，使用LC—MS测定Beagle犬血清中樟
柳碱的浓度，可大大提高专属性、灵敏度及分析速度
m
啪
∞
伯
万方数据
中草115ChineseTraditionalandHerbalDrags第37卷第8期2006年8,El·1217·
等，有实际意义。
本实验采用了先沉淀后萃取的提取方法，能够
更加有效地去除样品中的杂质，排除干扰，且方法简
便、易行，回收率较高，能满足LC—MS测定的要求。
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川芎当归提取物对血管平滑肌细胞MAPK信号通路
与周期蛋白的调控效应
李淑颖1，侯永忠2，葛志强2+
(1．天津大学校医院，天津300072；2．天津大学制药工程系，天津300072)
摘要：目的揭示川芎当归提取物(ELCAS)抑制血管平滑肌细胞增生的分子机制。方法以体外培养的原代
大鼠血管平滑肌细胞为研究对象，应用Westernblot方法检测不同质量浓度ELCAS对血管平滑肌细胞内的
ERK、JNK、p38磷酸化水平的影响，以及周期蛋白CyclinD1和细胞周期抑制子p21的表达情况。结果ELCAS
能显著抑制ERK、JNK和p38的磷酸化以及血清诱导的CyclinD1蛋白的表达，并表现出良好的浓度依赖性；同时
ELCAS能剂量依赖性地促进细胞内周期蛋白抑制子p21过表达，并抑制pRb磷酸化水平和CyclinD1蛋白表达。
结论ELCAS可通过抑制MAPK信号通路以及对周期蛋白的调控来抑制血管平滑肌细胞增生。
关键词：川芎；当归；周期蛋白CyclinD1；血管平滑肌细胞
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)08—1217—05
EffectofextractsofLigusticumchuanxiongandAngelicasinensisonMAPK
pathwayandcycleproteinsinvascularsmoothmusclecells
LIShu—yin91，HOUYong—zhon92，GEZhi—qian92
(1．HospitalofTianjinUniversity，Tianjin300072，China；2．DepartmentofPharmac u icalEngineering，
TianjinUniversity，Tianjin300072，China)
Keywords：LigusticumchuanxiongHort．；Angelicasinensis(Oliv．)Diels；cycleproteinsCy linD1；
vascll】arsmoothmusclecal】
J1f芎与当归是著名的对药，以川1芎和当归等剂
量构成的复方称之为“佛手散”。临床上主要以滴丸
和软胶囊形式用于治疗心、脑血管疾病，并具有显著
的疗效。近来研究发现复方川芎当归能明显缩小缺
血再灌注脑组织梗死范围，显著减轻病理损伤程度，
抵抗脑神经细胞坏死‘1。。该复方对实验性心肌损伤
有明显的减轻和改善作用，并显著地增强心肌的存
活率。在对复方的有效物质探索方面，近年的研究表
明川芎当归的活性物质主要为阿魏酸、挥发油和川
芎嗪。阿魏酸和挥发油是川芎当归中共有的化学成
收稿日期：2005—12-25
基金项目：国家自然科学基金重点项目(20236040)
作者简介：李淑颖(1962一)，女，河北邢台人，主管技师，研究方向为药理学。
*通讯作者葛志强Tel：(022)27403888E—mail：gezhiq@eyou．com
万方数据
樟柳碱在Beagle犬血清中的药动学研究
作者： 黄莹， 只德广， 徐为人， 刘昌孝， HUANG Ying， ZHI De-guang， XU Wei-ren， LIU
Chang-xiao
作者单位： 黄莹,HUANG Ying(中国医学科学院,中国协和医科大学放射医学研究所,天津,300192;天津药
物研究院天津药代动力学与药效动力学省部共建国家重点实验室,天津,300193)， 只德广
,徐为人,刘昌孝,ZHI De-guang,XU Wei-ren,LIU Chang-xiao(天津药物研究院天津药代动力
学与药效动力学省部共建国家重点实验室,天津,300193)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(8)
被引用次数： 1次

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引证文献(1条)
1.吴恒.陈礼明.张善堂 高效液相色谱在中药研究中的应用[期刊论文]-安徽医药 2009(8)


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