全 文 ：4　讨论
　　SA 是细胞膜上糖蛋白和糖脂链末端的残基,
广泛分布于哺乳动物细胞 (包括红细胞) 膜表面,
为细胞负电荷的主要来源,亦为细胞膜受体的重要
成分 [ 3, 4] , 参与细胞分化, 癌细胞的转移, 细胞的识
别、黏附和接触抑制等生理过程。因此, 细胞膜上
SA 含量的改变将导致细胞内一系列生物学变化。
同时 SA 也是红细胞 C3b 受体 ( CR1) 的重要成
分,除红细胞外,机体的其他组织细胞膜上也存在一
定水平的 SA。研究发现随着肿瘤的生长, 腹水和血
清中 SA 水平增加, 并与肿瘤的生长和类型呈相关
性,细胞膜表面 SA 水平与肿瘤的恶性程度有关。肿
瘤细胞比正常细胞更易产生 SA [ 5]。研究表明 SA 在
肿瘤的病理过程中具有“抗识别作用”,许多癌化的
细胞的表面富含 SA 黏蛋白 [ 6, 7] ,其水平高达膜上蛋
白总水平的 0. 5% ,而在正常细胞表面,这类成分没
有或很少,因此认为这是癌细胞逃避免疫攻击的机
制,并且和癌细胞的转移有关 [ 8]。将癌细胞分离出
来, 用唾液酸苷酶除去细胞表面的 SA, 再注入体
内,结果导致体内原有的癌细胞解体或消失 [ 9]。本实
验结果表明龙葵碱使荷瘤小鼠肿瘤细胞膜上 SA 水
平明显降低。由此推测龙葵碱可能属抗肿瘤药物中
的代谢药, 主要影响 DNA 的合成, 文献报道可与
DNA 结合的药物和一些抗代谢药可抑制肿瘤产生
SA [ 9]。其机制是直接与 DNA 结合而影响 DNA 合
成酶,进而影响 SA 的合成。
细胞膜 SA 水平与细胞膜活性密切相关,因此
进一步研究对肿瘤细胞膜活性的影响就显得非常重
要。细胞膜在等渗溶液中能重新封闭起来, 恢复对大
分子和阳离子的通透屏障,形成封闭影泡。测定红细
胞膜重新封闭能力的指标即封闭度。实验结果表明:
龙葵碱与环磷酰胺均可明显降低 H 22小鼠肿瘤细胞
膜封闭度,提示细胞膜活性降低,其结果有可能导致
肿瘤细胞的解体和死亡。
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银耳多糖对小鼠脾脏淋巴细胞蛋白激酶 C活性的影响
胡庭俊, 梁纪兰,程富胜,陈炅然X
(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 农业部新兽药工程重点开放实验室, 甘肃 兰州　730050)
摘　要:目的　观察银耳多糖 ( T PS) 体外对小鼠脾脏淋巴细胞蛋白激酶 C ( PKC) 活性的影响, 探讨 TPS 对免疫细
胞信息传递系统的效应。方法　应用反向离子对高效液相色谱法测定小鼠脾脏淋巴细胞 PKC 活性。结果　T PS 能
促进体外培养的小鼠脾脏淋巴细胞 PKC 活性。结论　TPS 的免疫调节作用与淋巴细胞的信号传导系统密切相关。
关键词: 银耳多糖; 淋巴细胞; 蛋白激酶 C
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 01 0081 04
·81·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 36 卷第 1 期 2005年 1月
X 收稿日期: 2004-04-15基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 39970556)作者简介:胡庭俊( 1965—) ,男,博士,研究员,主要从事中药免疫药理研究工作。
T el: ( 0931) 2651548　E-m ail : hu tin gjun@ ivdc. gov. cn
Effect of Tremella polysaccharides on protein kinase C activity in murine spleen lymphocytes
HU Ting-jun, LIAN G Ji-lan, CHENG Fu-sheng, CHEN Jiong-ran
( Key Labor ator y of New Anima l Medicine P ro ject, L anzhou Institute o f Animal Science and Veter inar y Pha rmaceutics,
Chinese Ag riculture Academy o f Sciences, M inistr y o f Ag ricultur e, L anzhou 730050, China )
Key words : T remella poly saccharides ( TPS) ; lymphocy tes; protein kinase C ( PKC)
　　银耳 T remel la f ucif ormis Ber k. 为多隔担子菌
纲的高等真菌,作为高级补品已有悠久历史,能益气
滋阴、润肺生津。银耳多糖 ( TPS) 是银耳的主要活
性成分。近年来发现其具有抑瘤、抗放、升白等作用,
并能提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力[ 1] ,增强刀
豆素 A ( ConA) 诱导的正常小鼠和老年小鼠脾细
胞增殖反应, 促进小鼠脾脏淋巴细胞产生白细胞介
素-2 ( IL-2) [ 2]。T PS 在一定的剂量范围内可以剂量
依赖性增加脾细胞内游离钙离子的浓度, 并与
ConA 有协同作用 [ 3]。为了进一步探讨 T PS 对免疫
细胞信息传递系统的效应和免疫调节作用机制,本
实验用反向离子对高效液相色谱 ( RP-HPLC) 法,
观察 T PS 对小鼠脾脏淋巴细胞 PKC 活性的影响。
1　材料与方法
1. 1　动物:昆明种小鼠,购于中牧股份有限公司兰
州生物药厂实验动物室, 8周龄, 体重 18～22 g ,雌
雄兼用。
1. 2　药品: TPS 从固体培养的银耳孢子中分离获
得,由甘露糖、岩藻糖、葡萄糖、木糖和少量的糖醛酸
组成, 摩尔比为 3. 93∶1. 0∶1. 77∶1. 5,以 A ( 1-3)
连接的甘露糖为主链, 与岩藻糖、葡萄糖、木糖和糖
醛酸侧链相连接而成,相对分子质量为 5. 6×105。
配成 0. 1% 水溶液, 9. 806 65×105 Pa 灭菌 15 min
备用。
1. 3　仪器及试剂: 800 高效液相色谱仪, Waters 公
司。RPMI-1640 培养基, Diolein, AT P, 组蛋白
( Histone) , Tris, PMSF, T ritone X100, DT T,
Apr ot inin, TPA ( 12-O-tet radecanoyphorbol 13-
acetate) 均 购自 Sigma 公 司。Surose, CaCl2,
KH2PO 4, M gCl2 均为国产分析纯, 甲醇 (光谱纯) ,
购自上海生物工程有限公司, IPR-A 离子对试剂
(四丁基磷酸铵) , 天津化学试剂有限公司出品。
1. 4　小鼠脾淋巴细胞的体外培养及药物处理: 无菌
取小鼠脾脏, 置 100 目尼龙网上, 加 Hankøs 液研
磨,冲洗,收集细胞悬液, 2 000 r/ m in 离心 5 min,弃
去上清液, 用 0. 15 mol / L NH4Cl-Tris 溶解红细胞
后,加 Hankøs液洗涤 3次至悬液澄清。经台盼蓝染
色, 细胞存活率 95% 以上, 调整细胞浓度为 8×
10
6
/ mL。接种细胞悬液 1. 0 mL 于 24 孔培养板, 于
37 ℃, 5%CO 2培养 24 h。各实验组每孔分别加入
0. 1% TPS, 使其终浓度分别为 25, 50, 100, 200
mg/ L。阳性对照组加入 TPA, 使其终浓度为 100
ng / mL。空白对照组为 RPM I-1640培养液, 继续培
养 24 h 收集细胞。各组均设 6个平行孔,实验重复
3次。
1. 5　脾细胞 PKC 制备:收集各组细胞, 1 500 r/ m in
离心 10 m in, 沉淀中加入 PKC 提取液, 每孔 0. 5
mL,于冰浴下超声粉碎,离心去除碎片和胞核,得上
清液即为胞浆和膜性组份,测定 PKC 总活力。PKC
提取液内含 T ris-HCl ( pH 7. 4) 20 mmol / L , DTT
2 mmo l/ L , EDT A 2 mmol/ L , Aprot inin 50 Lg /
mL, PMSF 1 mmol/ L , Suro se 200 mmol / L。
1. 6　PKC 的活性测定
1. 6. 1　酶蛋白水平测定:用紫外分光光度法测定酶
蛋白的水平。
1. 6. 2　PKC 反应体系: PKC 反应体系中包括 PKC
反应液和酶液 (按蛋白水平计) , 反应总体积为
1 mL。PKC 反应液内含: T ris-HCl ( pH 7. 4) 20
mmol / L , DTT 1 mmol/ L , PS 100 Lg/ mL, DG 10
Lg / mL, M gCl2 10 mmol/ L , CaCl2 1 mmo l/ L ,
Histone mg / mL, AT P 1 mmo l/ L。
1. 6. 3　PKC 酶促反应: 将 PKC 反应液混匀, 30 ℃
预热 5 min,加入酶液起始反应,反应开始后于 30 ℃
水浴摇床中准确保温 10 m in,立即置沸水浴中 1 m in
终止反应; 冷却后离心除去蛋白沉淀,上清液中加入
1 mL 氯仿-甲醇 ( 2∶1) 混合液,振荡 1 m in, 以抽提
脂溶性物质,再 2 000 r/ min 离心 10 min,吸取水层,
其中含有 AT P、ADP 和 AMP。重复前步骤处理 1
次,合并提取液,用于 PKC 活性测定。
1. 6. 4　PKC 活性测定:用 RP-HPLC 法测定。色谱
条件: C18柱; 流动相:甲醇-0. 04 mol/ L 磷酸二氢钾
( 20∶80,内含 5 mmol / L IPR-A, pH 7. 0) ;检测波
长 259 nm, 流速 0. 8 mL/ min, 柱温: 27 ℃, 进样量
20 LL。以底物 AT P 消耗量反映 PKC 的活性。
1. 6. 5　PKC 酶活力定义: 一个酶活力单位相当于
每分钟使 Histone 磷酸化而消耗 AT P 1 nmo l所需
·82· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 36 卷第 1 期 2005年 1月
的酶量。
1. 6. 6　AT P 标准曲线: 准确称取 ATP 标准品,用
双蒸水配成 1 mg / mL 的标准储备液, 测定时以
Tr is-HCl ( pH 7. 4) 代替酶液,稀释成不同浓度的
标准工作液。以标准品的进样量 ( X ) 对峰面积积分
值 ( Y ) 进行线性回归, 其回归方程为 Y= 80 312+
355 954 X , r= 0. 984 6。
2　结果
2. 1　RP-HPLC 法测定 AT P 标准品及样品的色谱
图:见图 1。
2. 2　TPS 对小鼠脾脏淋巴细胞 PKC 活性的影响:
见图 2。
1-AMP　2-ADP　3-AT P
图 1　ATP 标准品 (A)、样品 (B) 及对照品 (C) 色谱图
Fig. 1　Chromatogram of ATP standard substance (A) , sample (B) , and ref erence substance (C)
与对照组比较: * * P < 0. 01　* * * P< 0. 005
* * P < 0. 01　* * * P < 0. 005 v s con tr ol gr ou p
图 2　TPS在体外对小鼠脾脏淋巴细胞 PKC 活性的影响
Fig. 2　Ef fect of TPS on PKC activity in murine
spleen lymphocytes in vitro
3　讨论
　　胞外信号分子如激素、神经递质、细胞因子、一
些药物分子等通过与膜特异受体或配体结合,活化
蛋白激酶[ 4]。PKC 是一种 Ca2+ 和磷脂依赖性激酶,
被激活后,广泛参与由肌醇磷脂信使系统介导的生
理生化效应, 是多种细胞反应 (如增殖或分化等)
的早期变化之一[ 5] ,因此通过测定细胞内 PKC 活性
的变化,可反映药物对细胞内信息传递的影响。
　　ATP 在 PKC 反应体系中作为提供磷酸的物
质,使底物磷酸化, 同时降解为 ADP 和/或 AMP,
其中 AT P 的消耗量与 PKC 的活力成正比,由此可
通过测定体系中 ATP 的消耗量来确定 PKC 的活
力。TPA 为一种蛋白激酶激活剂, 本实验选择该药
作为阳性对照。本研究证明 TPS 能引起小鼠脾脏淋
巴细胞 PKC 活性明显升高, 揭示其免疫增强作用
与活化 PKC 有关。
　　在多糖对动物免疫细胞的信号转导方面, 李明
春等就灵芝多糖 ( GLB7) 对小鼠腹腔巨噬细胞信号
转录过程的影响进行了深入研究,证实 GLB7能增
强小鼠巨噬细胞的吞噬功能, 引起小鼠巨噬细胞
[ Ca
2+
] 和 pH 升高, 增加巨噬细胞内三磷酸肌醇
( IP 3) 和二酰基甘油 ( DAG) 以及 cAMP 和 cGMP
的生成, 在转录水平促进小鼠巨噬细胞分泌细胞因
子并影响其蛋白激酶活性 [ 6, 7]。枸杞多糖可剂量依赖
性地升高淋巴细胞内 cAMP 和 cGMP 水平, 并增
加 ConA 活化的小鼠脾淋巴细胞膜 PKC 活性[ 8]。
T PS 是银耳的重要有效成分,具有激活人单核细胞
产生 IL-1、IL-6和肿瘤坏死因子 ( T NF) 的作用[ 9] ,
能显著抑制肿瘤生长 [ 10] ,可促进 ConA 诱导的脾淋
巴细胞产生 IL-2[ 11]。本研究中, 体外培养的小鼠脾
淋巴细胞在加入 T PS 后的色谱图显示 AMP 峰值
升高, ATP 峰值下降。而空白对照组与标准品组的
色谱图基本一致。结果表明, T PS 作为外源性信号
分子,与脾淋巴细胞表面的特异性受体结合, 活化细
胞膜 PKC,并引起级联反应,使细胞内一系列蛋白质
级联磷酸化,最后将胞外信号传递到细胞核, 活化核
内转录因子,引起基因表达,调节免疫细胞的功能。
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重组水蛭素抗大鼠大脑中动脉血栓形成作用
周　琴, 任开环,韩国柱X ,李卫平
(大连医科大学 药理教研室,辽宁 大连　116027)
　　脑血栓的发病率很高, 引起的后果相当严重,抗
脑血栓药物是当前研究的热点。近年,国内外对重组
水蛭素 ( recombinant hirudin, rH )——一种由 65
个氨基酸组成的高效、特异的凝血酶抑制剂的研发
取得了令人瞩目的进展 [ 1]。本研究组曾对国产 rH
的药效学和药动学进行了较深入的研究[ 2, 3] ,证明其
具有强大的抗凝、抗弥漫性血管内凝血 ( DIC) 以及
抗动静脉血栓形成作用。但有关其对脑动脉血栓形
成的影响,迄今未见报道。本研究利用化学法建立血
栓模型以评价 rH 的抗大脑中动脉血栓形成作用。
1　材料与方法
1. 1　动物: SD 大鼠, 280～300 g,雄性,大连医科大
学动物中心提供。
1. 2　受试药品与试剂: rH ,大连高新生物制药有限
公司提供, 批号 010805, 纯度> 99% , 抗凝效价
16 000 AT U/ mg, 相对分子质量 7 000, 经鉴定为
N-Ile
1-Thr
2-63-desulfato-hir udin; 肝素, 北京奥博
星技术责任有限公司产品, 批号 20010513;三氯化
铁 ( FeCl 3) , 北京市朝阳区通惠化工厂, 分析纯, 批
号 950220; 红四氮唑 ( T TC ) , 北京化工厂, 批号
20020809。
1. 3　动物分组: SD 大鼠 78 只, 随机分成两大组。
第一大组再分为 6 组, 每组 10 只。大脑中动脉
( MCA) 血栓形成模型组 ( iv 生理盐水, 以 FeCl3造
模)、假手术组 (除不用 FeCl3外, 其余步骤同其他
组)、高、中、低剂量给药组 (分别 iv rH 1. 0、0. 5、
0. 25 mg/ kg , FeCl3造模) 和阳性药对照组 ( iv 肝素
500 U / kg, FeCl 3造模)。第二大组亦再分为 6组, 每
组 3只, 组别同第一大组, 于术后立即取脑,作病理
检查。
1. 4　MCA 血栓形成模型制备:仿文献方法 [ 4]。各
组均于给药或生理盐水后 10 m in 造模。大鼠用
12% 水合氯醛 ( 250 mg / kg, ip) 麻醉,按 Tamura
等方法[ 5]暴露右侧位于嗅束及大脑下静脉之间的一
段 MCA, 置一小片塑料薄膜保护血管周围脑组织,
将吸有 50% FeCl3溶液 5 LL 的小片定量滤纸片贴
在该段 MCA 上,持续 30 m in 后去掉滤纸片, 生理
盐水冲洗局部组织, 逐层缝合,回笼饲养。
1. 5　行为学评分: 于术后 24 h 按文献方法对动物
行为学进行评分[ 4]。满分为 11分, 分数越高, 动物的
行为学障碍越严重。动物行为学评分采用盲法评分。
1. 6　梗死范围测定:术后 24 h, 将大鼠断头取脑,
去掉嗅球、小脑和低位脑干,生理盐水冲洗后做冠状
切片 5 片, 置 0. 2% T TC 溶液中, 37 ℃ 孵育 30
m in。正常脑组织被染成红色,梗死组织成苍白色。
将脑平片照相后,采用 Image-Pro plus 软件分析系
·84· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 36 卷第 1 期 2005年 1月
X 收稿日期: 2004-04-12作者简介:周　琴( 1957—) ,女,辽宁大连人,实验师,主要从事心脑血管药理学的研究。
* 通讯作者　Tel: ( 0411) 84720229　E-m ail : hgzhx2236@ sin a. com