全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月·1193·
activecaspase一3cancausemembraneblebbing，
disassemblyofthecellstructureandDNAfrag—
mentation，whicheventuallyleadtoeelldeath．
Someinitiatorcaspases，suchascaspase9，canac—
tivateprocaspase3，whichthencancleavethecel—
lularsubstratesne dedfortheorchestrationof
apoptosisandforma“wheelofdeath’，[8_10|．Recent
datahaveshownthatapoptosis，especiallythcas—
pase—mediatedcelld ath，playsanimportantrole
inthetiology，pathogenesis，andtherapyofava—
rietyofhematologicalmalignanciessuchasacute
leukemia，andcytotoxiceffectsofmostanti—
leukemiadrugsarebasedoninductionofapopto—
sis[11|．A11thesetudiesndicatethatinductionof
apoptosismaybeaindexfornewantitumordrug
selectionandanimportantmethodofassesement
fortheclinicaleffectivenessofmanyanti—leukemia
drugs[12|．
Insummary，theresultsdemonstratehatori—
donincaninduceapoptosisinNB4cellsviactiva—
tionofcaspase一3。Thisindicatesthatoridoninmay
beanimportantpotentialanti—leukemiareagents．
Acknowledgments：Wethankhemembersof
ourlaboratoriesfortheirnsightandechnicalsup-
port．
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雷公藤甲素对胶原诱导的关节炎大鼠关节局部热休克蛋白
和主要组织相容性复合体I类分子表达的影响
涂胜豪，胡永红，曾克勤，张明敏，赖先阳，张玮琛
(华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合科，湖北武汉430030)
摘要：目的观察雷公藤甲素对胶原诱导的关节炎大鼠关节局部热休克蛋白(HSPs)和主要组织相容性复合体
I类分子(MHC—I)表达的影响。方法建立胶原诱导的关节炎大鼠模型，雷公藤甲素按40卜g／kgim给药，运用
逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)和免疫酶组织化学染色的方法，观察大鼠关节滑膜细胞和软骨细胞HSP60、
HSP70和MHC—I类分子的表达情况。结果与正常对照组相比，模型组大鼠关节滑膜细胞及软骨细胞HSP60、
HSP70和MHC—I类分子的表达均显著增高(P<0．05)，与模型组相比，雷公藤甲素可以下调关节炎大鼠关节局
部HSP60、HSP70和MHC—I类分子的表达(P<0．05)。结论降低关节炎大鼠关节局部软骨细胞和滑膜细胞异
常表达的HSPs与MHC—I类分子的表达，可能是雷公藤甲素治疗类风湿关节炎(RA)的作用机制之一。
收稿日期：2004—12—29
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30070961)
作者简介：涂胜豪(1965一)，男，湖北武汉人，硕士，华中科技大学同济医学院附属同济医院副教授，硕士生导师，主要从事中西医结合治
疗风湿病研究。Tel：(027)83663379E—mail：shtu@tjh．tjmu．edu．cn
万方数据
·1194· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月
关键词：雷公藤甲素；胶原诱导的关节炎；类风湿关节炎；热休克蛋白；主要组织相容性复合体
中图分类号：R286．1l 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)08—1193—04
Effectsoftriptolideonexpressionofheatshockproteinsa dmajorhiscompatibility—I
moleculeinsynoviocytesandchondrocytesofcollagen—inducedarthritisrat
TUSheng—hao，HUYong-hong，ZENGKe-qin，ZHANGMing—min，LAIXian—yang，ZHANGWei—chen
(DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine，TongjiHospital，TongjiMedicalCo lege，
HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheffectsoftriptolideonthe xpressionofheatshockproteins
(HSPs)andm jorhistocompatibility—I(MHC—I)moleculeinsynoviocytesandchondrocytesofcollagen—
inducedarthritisrats．MethodsThexperimentalWistarratmodelofcollagen—inducedarthritiswaes—
tablished．Theratsintriptolidegroupwereadministeredwithtriptolideat40／卫g／kgbyim．Theexpres—
sionofHSP60。HSP70，andMHC—ImoleculeinsynoviocytesandchondrocyteswasdetectedbyRT—PCR
andimmunohistochemicalstaining．ResultsTocomparewithnormalgroup。theexpressionofHSPsand
MHC—Imoleculeincreasedremarkablyinsynoviocytesandchondrocytesofmodelrats(尸<0．05)．Trip—
tolidecouldreducethexpressionofthesemoleculesininflammatoryjointsrats(P<0．05)．Conclusion
Triptolidemayplayitscurativeroleviadown—regulatingthexprssionofHSPsandMHC—Imoleculein
synoviocytesandchondrocytesofrh umatoidarthritis(RA)．
Keywords：triptolide；collagen—inducedarthrit s；rh umatoidarthritis(RA)；heatshockproteins
(HSPs)；majorhistocompatibility(MHC)
异常的自身免疫过程可能是类风湿关节炎
(rheumatoidrthritis，RA)发病机制之一。热休克
蛋白(heatshockproteins，HSPs)是一种应激蛋
白，广泛存在于人、动物、微生物和植物细胞内。
HSPs同源保守序列及其特定的结构、功能与风湿
性疾病、感染性自身免疫过程相关[1’2]。许多研究显
示，RA的发生与主要组织相容性复合体(MHC)
密切相关[3]。因此，通过恢复RA患者异常表达的
HSPs和MHC至正常水平，可能是药物发挥治疗
作用的环节之一。雷公藤药用部位为卫矛科植物雷
公藤TripterygiumwilfordiiHook．f．的根，具有
抗炎、免疫抑制、抗肿瘤和抗生育等多种药理作用，
是临床治疗RA的有效药物之一。雷公藤甲素是雷
公藤的有效药理成分之一。以往研究往往局限于雷
公藤及其有效成分对T、B细胞增殖、细胞因子的表
达和凋亡的影响，而忽视了对T、B细胞活化增殖的
始动环节影响的探讨。本实验通过建立胶原诱导的
关节炎大鼠模型，观察雷公藤甲素对大鼠关节局部
HSPs和主要组织相容性复合体一I(majorhisc m—
patibility—I，MHC—I)类分子表达的影响，以进一
步探讨雷公藤治疗RA的可能机制。
1材料与方法
1．1动物：清洁级健康雄性Wistar大鼠，购于华中
科技大学同济医学院实验动物中心，体重130～150
g，正常饮食。
1．2试剂：雷公藤甲素(福建省医学科学研究所提
供，质量分数98．50A以上)，牛Ⅱ型胶原
(Chondrex)，完全弗氏佐剂(Sigma)，抗HSP60抗
体(中山公司)，抗HSP70抗体(中山公司)，抗
MHC—1分子抗体(Harlan)，逆转录试剂盒(Fer—
mentas)，DNA聚合酶(Fermentas)，免疫组化染色
试剂盒(中山公司)，浓缩型DAB显色试剂盒(中
山公司)，苏木素染液(中山公司)。
1．3仪器：图像分析仪，显微镜，电热恒温孵育箱，
PCR仪，垂直板电泳仪，紫外分光光度仪，凝胶电泳
成像系统等。
1．4造模、评估和给药：从50只大鼠中随机选10
只作为正常对照，其余用于造模。参照文献方法[4]配
制Ⅱ型胶原乳剂，沿大鼠背部及尾根部分5点皮内
注射，每点0．05mL，15d后分两点皮内激发注射。
正常对照组予以生理盐水同法注射。初次免疫30d
后参照关节炎指数评分标准[51对造模效果进行评
估，评分达4分以上的大鼠被用于继续实验。将造模
成功的大鼠随机分为两组，每组10只，分别为模型
组和雷公藤甲素组。将雷公藤甲素用5％丙二醇配
制成注射液，其中含雷公藤甲素100tlg／mL。正常
对照组、模型组和雷公藤甲素组大鼠分别以生理盐
水、5％丙二醇液和雷公藤甲素注射液，按0．04
mL／100g(雷公藤甲素剂量为40／,g／kg，预试验结
果表明此剂量为最佳剂量)后腿im给药。每3天用
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月·1195·
药1次。
1．5 取材：用药30d后，将大鼠称重，用2％戊巴
比妥钠ip麻醉，仰位固定，打开膝关节腔，取滑膜组
织，置10％中性甲醛中固定，用于石蜡切片的制
备。同法取另外一侧滑膜，用无酶锡箔纸包裹，置冻
存管液氮冻存，用于RT—PCR。取大鼠右侧踝关节，
去掉皮肤与肌肉，置10％中性甲醛中固定24h，然
后转入脱钙液甲酸一甲醛一三蒸水(20：5：75)中脱
钙，每3天更换一次脱钙液，脱钙30d后，石蜡包
埋，切片。
1．6 滑膜组织HSP60、HSP70mRNA的RT—
PCR：按TRIZOL试剂说明书提取总RNA，按逆转
录试剂盒说明书进行逆转录反应，按Taq酶说明进
行PCR反应，各引物(上海生工合成)序列为：
HSP60上游引物为5，_CAAATGAAGAAGC—
TGGGGATGGCA一37，下游引物为5’一GAGCAGG—
TACAATGGACTGAACAC一37，扩增片断长度为
467bp；HSP70上游引物为57一TGCTGACCAA—
GATGAAG一37，下游引物为 57AGAGTC—
GATCTCCAGGC一37，扩增片断长度为491bp；
口-actin上游引物为 5’CATTTCCGGTG—
CACGATG—GAG一37，下游引物为5-GCCATCCT—
GCGTCTGGACCTG一37，扩增片断长度为599bp。
反应条件分别为HSP60：94℃，30S；60℃，30S；
72℃，90S；共33个循环；HSP70：95℃，60S；
55℃，60S；72℃，60S；共30个循环；肛actin：
94‘C，30S；60C，60S；68‘C，120S；共30个循
环。扩增产物在1．5％琼脂糖凝胶中电泳，凝胶电
泳成像系统分析。
1．7滑膜细胞HSP60、HSP70及MHC—I和踝关
节软骨MHC—I的S—P免疫组织化学染色：石蜡切
片常规脱蜡，脱水。PBS(pH7．4)洗3次，每次3
min，滴加3％双氧水一甲醇溶液，37℃温箱孵育15
min。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，0．01mol／L枸
椽酸缓冲液(pH6．o)微波抗原修复30min。PBS
洗3次，每次3min，滴加二抗动物的血清，37℃温
箱孵育15min，倾去血清(勿洗)。滴加一抗
(HSP60、HSP70的稀释度分别为1：200，MHC—I
的稀释度为1：1000)，4℃孵育过夜。阴性对照用
PBS代替一抗。PBS洗3次，每次3min，滴加生物
素化的二抗，37+C温箱孵育45min。PBS洗3次，每
次3min，滴加链霉素一辣根过氧化物酶标记的三抗，
37℃温箱孵育45min。PBS洗3次，每次3min，
DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化液分化，脱水、
透明、中性树胶封片。图像分析仪进行图像分析。
1．8统计学分析：结果以z±S表示，组间差异采用
方差分析F检验，由SPSSll．5统计软件进行统计
分析。
2结果
2．1 RT—PCR结果：模型组大鼠滑膜细胞HSP60
和HSP70的mRNA表达量较正常对照组和雷公
藤甲素组均明显升高(P雷公藤甲素组之间差异无显著性(P>0．05)。
HSP60电泳条带见图1一A；HSP70电泳条带见图
1一B，平均灰度值比较见表1。
1-DNAMarker2-正常对照组3一模型组 4一雷公藤甲素组
1-DNAMarker2-normalcontrolgroup
3-modelgroup4 triptolidegroup
图l大鼠滑膜细胞HSP60(A)和HSP70(B)的
mRNART—PCR扩增结果
Fig．1ResultsofRT—PCRofHSP60(A)andHSP70(B)
mRNAinsynoviocytesofrats
表1大鼠滑膜细胞中HSP60和HSP70mRNA的
表达(x±S，n一20)
Table1 ExpressionofHSP60andHSP70mRNA
insynoviocytesofrat (z土s，n一20)
组别 剂量／(tLg·kg_1)HSP60HSP70
与正常对照组比较：’P。P<0．05VSnormalcontrolgroup：△P2．2 滑膜细胞HSP60和HSP70免疫组织化学染
色结果：棕黄色阳性表达部位位于细胞浆。模型组阳
性染色强度明显高于正常对照组(P公藤甲素组(P计结果见表2。
2．3 滑膜细胞和踝关节软骨细胞MHC—I的S—P
法染色结果：阳性表达部位位于细胞膜和细胞浆，以
细胞膜为主。模型组阳性染色强度明显高于正常对
照组(P结果见表2。
3讨论
类风湿关节炎(RA)是一种以滑膜增生、软骨
降解和骨质破坏为特征的慢性炎症性关节病，其病
万方数据
·1196· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月
表2大鼠滑膜细胞和软骨细胞HSP60、HSP70与MHC—I类分子的免疫组织化学染色结果(工±s，n=20)
Table2 ResultsofimmunohistochemicalstainingofHSP60，HSP70，andMHC—Imolecule
insynoviocytesandchondrocytesofrat (；±s，n=20)
与正常对照组比较：。P。P因仍不很明了。炎性细胞因子(如IL一1、TNF—a等)
的过度表达被认为是疾病迁延发展的关键因素，但
是，引起这些细胞因子表达失调的原因至今不清。研
究表明，RA发病过程中，活化的巨噬细胞和淋巴细
胞等免疫应答细胞表达炎性细胞因子上调。而引起
这些免疫细胞活化、增殖的因素多样口]。尽管感染因
素被认为是病因之一，然而迄今为止还未找出明确
的病原体，进一步研究发现，感染过程引起机体应答
产生反应蛋白，HSPs便是其中之一。由于它们与人
体某些正常组织蛋白可能拥有结构相似的抗原表
位，能通过交叉反应改变宿主自身免疫和自身耐受
间平衡，使机体产生异常免疫应答，同时，自身免疫
细胞通过识别HSPs而活化，从而分泌大量细胞因
子，导致RA的发生与发展。
在RA中引起自身免疫性细胞活化的原因与
具体的机制至今尚不清楚。大量研究表明，自身抗原
参与了疾病的发生与发展[7]。体内抗原提呈途径主
要有两条，即溶酶体提呈途径(MHC一Ⅱ类分子途
径)和胞质溶胶提呈途径(MHC—I类分子途径)。
MHC—I类分子提呈的抗原大多是内源性抗原，热
休克蛋白(HSP70、HSP90等)参与抗原肽的转运。
目前，国内外学者正致力于新的自身抗原的寻
找。尽管广泛表达于体内有核细胞的MHC—I类分
子尚未被认为是一种潜在的自身抗原，但是，这种抗
原的过度表达可能是一种危险因素。本实验中观察
到模型组大鼠滑膜细胞和软骨细胞的MHC—I类分
子的表达明显增加，表明炎性关节内过度表达的
MHC—I类分子可能与关节炎之间存在着某种联
系，有关机制尚待进一步的研究。近年来有很多关于
HSP60和HSP70与自身免疫反应及自身免疫疾病
如反应性关节炎、RA、Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化等
的关系的研究报道[1]。这些研究认为HSPs在调节
自身免疫反应及引发自身免疫疾病的发生中起着非
常重要的作用。本实验从mRNA和蛋白质水平加
以研究，结果观察到HSPs的表达显著升高。胶原诱
导的关节炎大鼠模型是复制RA最为理想的动物
模型。因此，实验结果可能提示，一方面MHC—I类
分子和HSPs表达的上调增强了细胞抗原提呈的能
力，从而导致了自身反应细胞的异常活化，RA的发
生；另一方面，体内确实存在能够直接识别MHC—I
类分子和HSPs而活化的自身免疫细胞，如73T细
胞等旧j。
通过恢复RA患者异常表达的HSPs和MHC
于正常水平，可能是药物发挥治疗作用的途径之一。
雷公藤是临床治疗RA的有效药物。到目前为止，
已从雷公藤中分离出70多种成分[9]，包括生物碱、
二萜类、三萜类、倍半萜、苷类、有机酸和卫矛醇等，
但仅对其中部分单体的化学成分进行了研究。雷公
藤甲素是被研究得最为系统和全面的单体成分。本
实验首次探讨雷公藤甲素对关节局部HSPs和
MHC—I类分子表达的影响。结果发现，雷公藤甲素
可以有效地下调模型大鼠关节滑膜和软骨细胞
HSP60、HSP70和MHC—I类分子的表达。因此有
可能通过这条途径，雷公藤甲素抑制了体内自身反
应性细胞的活化，从而达到治疗RA的目的。但其
具体机制有待进一步探讨。
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雷公藤甲素对胶原诱导的关节炎大鼠关节局部热休克蛋白和
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作者： 涂胜豪， 胡永红， 曾克勤， 张明敏， 赖先阳， 张玮琛， TU Sheng-hao， HU Yong-
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作者单位： 华中科技大学同济医学院附属同济医院,中西医结合科,湖北,武汉,430030
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
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