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Callus growth and adventitious root induction in Bupleurum chinense

柴胡愈伤组织生长和不定根诱导的研究



全 文 :中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月·275·
低,导致无扩增;酶量过高,使非特异性产物增加。当
酶用量为0.5U时扩增产物较少,在1.O~2.0U时
扩增条带逐渐清晰稳定;当酶用量达4.0U时产物弥
散(图6)。因此,Taq聚合酶的用量为1.5U最佳。
2.6 预变性时间及延伸时间SRAP扩增的影响:
本实验预变性和延伸时间对SRAP反应的影响进
行了考察,结果表明预变性时间和延伸时间对扩增
结果无太大影响,延伸时间在1~10min,变性时间
在1~5min扩增条带无太大差异。从缩短实验周期
和节约成本考虑,最终选择预变性2min,延伸5
min(图7、8)。
3讨论
本实验最终以青牛胆DNA为材料,建立了重
复性好、分辨率高的SRAP反应体系,即在25肛L反
应体系中,模板DNA质量浓度为10ng/t-L,2.5弘L
的10倍Buffer(M92+free)缓冲液,MgCl22.5
mmol/L,dNTPs为0.25rnmol/L,引物1.0弘mol/
L,Taq酶1.5U;扩增程序为:94℃预变性2min、
94℃变性1min、35℃复性1min、72℃延伸1
min、5个循环;94℃变性1min、50℃复性1min、
72℃延伸5min、35个循环。
对青牛胆SRAP扩增最为敏感的因素是
M92+,dNTPs,TaqDNA聚合酶浓度,而模板适宜
浓度范围较宽,5~70ng均有良好扩增,引物浓度
要求也不高,这与武志朴等对小麦H3及任羽等[53对
辣椒的研究结果是一致的。扩增前5个循环退火温
度为50℃,保证反应稳定可重现性。
SRAP是对ORFs进行扩增,对基因相对较少
的着丝粒附近及端粒的扩增较少,如结合可扩增这
些区域的SSR标记,可获得覆盖整个基因组的连锁
图。在遗传多样性研究中,SRAP比AFLP更能反映
表型的多样性及进化史[6],且比AFLP操作简单,省
去了酶切,连接等烦琐的步骤,在药用植物种质资源
评价等方面具有广泛的应用前景。
SRAP技术是基于PCR的一种分子标记方法,
是针对生物体基因组进行分析,亲缘关系越近的生
物基因相似性越大,故推断本实验优化所得的反应
条件对防己科青牛胆属及亲缘关系相近的其他植物
同样适用。
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柴胡愈伤组织生长和不定根诱导的研究
姚智1,高文远¨,李克峰1,PAEKKee—yoeup2
(1.天津大学药物科学与技术学院,天津300072;2.ResearchCenterfort eDevelopmentofAdvancedHorticultural
Technology,ChungbukNationalUniversity,Cheongju361—763,Chungbuk,Korea)
摘要:目的探讨柴胡愈伤组织生长和其不定根诱导的适宜培养条件。方法 以无菌苗为外植体诱导获得愈伤
组织后,对不同种类和不同质量浓度的生长素进行实验,并对光和温度对柴胡愈伤组织生长和其不定根诱导的影
响进行了研究。结果 柴胡的愈伤组织适宜于在MS+NAA4mg/L+KT0.2mg/L培养基或MS+NAA2rag/
L+KT0.2mg/L培养基上继代培养。诱导其不定根时宜采用的培养基为MS+JBA2mg/L+KT0。2mg/L。25
℃条件下,黑暗培养既有利于柴胡愈伤组织的生长又有利于其不定根的诱导。结论 比较适宜于柴胡愈伤组织生
长的生长素为NAA,而有利于不定根诱导的生长素为IBA。温度对愈伤组织的生长影响非常明显,光照是其发根
的限制因素。
收稿日期:2006—04—10
基金项目:国家中医药管理局中医药科学技术研究专项(04—05ZPl0)
*通讯作者高文远Tel:(022)87401895
万方数据
·276· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2,El
关键词:柴胡;愈伤组织;不定根
中图分类号:R282.1 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2007)02—0275—04
CallusgrowthandadventitiousrootinductioninBupleurumchinense
YAOZhil,GAOWen—yuanl,LIKe—fen91,PAEKKee—yoeup2
(1.TheCollegeofPharmaceuticsandB otechnology,TianjinUniversity,Tianjin300072,China;2.Research
CenterfortheDevelopmentofAdvancedHorticulturalTechnology,ChungbukNational
University,Cheongju361—763,Chungbuk,Korea)
Keywords:BupleurumchinenseDC.;callus;adventitiousroot
柴胡BupleurumchinenseDC.为常用药用植
物,其根具有重要的药用价值,除了作为中医处方用
药外,已经开发了多种中成药,如柴胡滴丸、柴胡舒肝
丸、柴胡口服液等,用药量逐年增长。组织培养技术,
特别是大规模工业化培养技术,对解决药用植物资源
紧张的现状具有重要意义[1]。将组织培养技术和中药
材GAP栽培技术结合起来,对中药材资源的可持续
利用非常重要。药用植物大规模不定根培养技术的工
业化,已经在韩国高丽参上取得了成功,培养的规模
已经达到了20t[引,这些技术对我国许多药材的培
养,特别是根类药材具有重要的参考意义。为此,本实
验室对柴胡不定根的培养进行了尝试。
1材料与方法
1.1材料:柴胡B.chinenseDC.种子采自中国医
学科学院药用植物研究所,经本院高文远教授鉴定。
1.2 柴胡愈伤组织的诱导和继代培样:选取饱满的
柴胡种子,流水冲洗4h,用1%次氯酸钠消毒10
rain,无菌水清洗后,接种于MS无植物生长调节剂
的固体培养基上,20℃黑暗培养,20d后获得无菌
苗。待无菌苗生长到3~5cm时,接种到MS+
2,4-D2mg/L+KT0.2mg/L的固体培养基上诱
导愈伤组织,30d左右获得柴胡的愈伤组织。愈伤
组织在相同的培养基上每25d左右进行继代培养。
这些愈伤组织用于本实验研究。
1.3不同生长素对柴胡愈伤组织生长和不定根诱
导的影响研究:共采用12种含有不同生长素的培养
基。编号为B1~B12,见表1。培养在培养皿中进行,
培养皿直径9.5cm,高4.5cm。培养室温度为23
℃,黑暗培养,培养时间为25d,检测柴胡愈伤组织
的生长速率,并统计愈伤组织中发出的不定根的数
量。每种处理重复10次。
1.4 培养的物理环境对柴胡愈伤组织生长和不定根
诱导的影响研究:主要实验温度和光照对柴胡愈伤组,
织生长和不定根诱导的影响。采用的培养基为MS+
表1培养基中的不同植物生长调节剂实验
Table1 Experimentsofvariousplantgrowth
regulatorsinMSmedia
培养基中的不同植物生长调节剂/(mg·L_1)
MS+1NAA+O.2KT
MS+2NAA+O.2KT
MS+4NAA+0.2KT
MS+8NAA+0.2KT
MS+1IAA+0.2KT
MS+2IAA+0.2KT
MS+4IAA+0.2KT
MS+8IAA+0.2KT
MS+1IBA+0.2KT
MS+2IBA+0.2KT
MS+4IBA+0.2KT
MS+8IBA+0.2KT
NAA4mg/L+KT0.2mg/L固体培养基。培养在
培养皿中进行,培养皿直径9.5cm,高4.5cm。设下
列5种处理:A黑暗25oC;B日光25℃;C紫色光
13℃;D蓝色光20oC;E蓝色光25℃。培养时间为
25d,检测柴胡愈伤组织的生长速率,并统计愈伤组
织中发出的不定根的数量。每种处理重复10次。
2结果与分析
2.1 不同生长素对柴胡愈伤组织生长和不定根诱
导的影响:图1显示了不同生长素对柴胡愈伤组织
生长的影响,图2显示了不同生长素对柴胡不定根
诱导的影响。
从图1中可以看出,NAA比较适合于柴胡愈伤
;f 工
萋;}自.囵。匿i.自。自。自;宙。宙。自。囱。自。自。
堑m酏鼬m髓舶邯腿鼬酊m
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万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月·277·
B1~B12:对应于表1中的不同培乔基
B1一B12:Differentmediaaccordingtotable1
图2不同生长素对柴胡不定根诱导的影响 .
Fig.2Effectsofvariousplantgrowthregulatorson
adventitiousrootinductioninB.chinense
组织的生长,IAA和IBA的效果相差不多。从各种
培养基来看,MS+NAA4mg/L+KT0.2mg/L
培养基最适宜于愈伤组织的生长,其次为MS+
NAA2mg/L+KT0.2mg/L培养基,另外3种培
养基MS+IAA4mg/L+KT0.2mg/L,MS+IAA
8mg/L+KT0.2mg/L,MS+IBA8mg/L+KT
0.2mg/L的效果也不错。但从愈伤组织的外观来
看,NAA条件下生长的愈伤组织状况较好。
从图2中可以看出,IBA比较适合于不定根的
诱导,诱导出的不定根状况较好,颜色黄白,生长迅
速。其次为IAA,较高质量浓度的IAA对柴胡不定
根的诱导效果较好。而NAA不适于不定根的诱导。
比较适宜于柴胡诱导不定根的培养基为:MS+IBA
2mg/L+KT0.2mg/L,MS+IBA1mg/L+KT
0.2rng/L和MS+IAA8mg/L+KT0.2mg/L。
因此,比较适宜于柴胡愈伤组织生长的生长素
为NAA,而有利于不定根诱导的生长素为IBA。柴
胡的愈伤组织适宜于在MS+NAA4mg/L+KT
0.2mg/L培养基或MS+NAA2mg/L+KT0.2
mg/L培养基上继代培养。诱导其不定根时宜采用
的培养基为MS+IBA2mg/L+KT0.2mg/L,
MS+IBA1mg/L+KT0.2mg/L或MS+IAA8
mg/L+KT0.2mg/L。
2.2培养的物理环境对柴胡愈伤组织生长和不定
根诱导的影响:图3显示了培养的物理环境对柴胡
愈伤组织生长和不定根诱导的影响。可以看出,温度
对愈伤组织的生长影响非常明显,而黑暗和不同光
照条件对愈伤组织的生长影响不大,如25℃条件
下,无论是黑暗,还是普通光照射或者蓝光照射,愈
伤组织的生长都很好。而在13℃和20℃条件下生
长的愈伤组织明显生长慢,长势不好。20~25℃的
温度环境比较适宜于柴胡愈伤组织的生长。
对于柴胡不定根的诱导来说,光照是其发根的
限制因素,而温度的影响相对较小。在25。C条件下,
A B C D E
30
25士
20杂
15鬟
10恃
5
0
A一暗培养25℃B一臼光F培养25℃C一蓝光F培养13℃
D一蓝光下培养20℃E一蓝光下培养25℃
A—dark25℃B—whitelight25℃ C—bluelight13℃
D—bluelight20℃E—bluelight25℃
图3 物理环境对柴胡愈伤组织生长和不定根诱导的影响
Fig.3Effectsofphysicalenvironmentoncallusgrowth
andadventitiousro tinductioninB.chinense
黑暗培养最有利于柴胡不定根的发生。在蓝光条件
下,13℃有利于发根,其次为20℃,最后是25℃。
说明在相同的光照条件下,低温有利于柴胡不定根
的发出。
以上结果表明,25℃条件下,黑暗培养既有利
于胡愈伤组织的生长,又有利于其不定根的诱导。
3讨论
本实验对柴胡的愈伤组织和不定根诱导进行了
初步研究,探索出了柴胡愈伤组织生长的最佳条件,
并发现了影响柴胡不定根诱导主要因素。不同的生
长素对柴胡愈伤组织和不定根诱导的影响不同,而
温度和光照条件同样对二者具有非常重要的影响。
这些结果为进一步柴胡不定根的培养打下了良好的
工作基础。我国的组织培养在雪莲、石斛等药用植物
上已经出现了一些工业化的实例[3]。但不定根的培
养较少,这方面做得最成功的是韩国对高丽参不定
根的培养[4’5]。此外,在其他药用植物组织培养上的
研究也很深入,并力求通过组织培养技术产生一些
大田和野生药用植物无法比拟的新材料[6’7]。这些经
验都值得借鉴。我国是世界上使用和出口药用植物
资源最多的国家,大力开发组织培养技术,并与目前
正在开展的GAP标准化栽培相结合,对真正实现
国家倡导的药用植物资源的可持续利用具有非常重
要的意义。
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何首乌RadixPdygoniMultiflori为蓼科植物
何首乌PolygonummultiflorumThunb.的干燥块
根。性微温,味苦、甘、涩。《中国药典>>2005年版一部
记载具有润肠通便之功效。何首乌中的主要有效成
分之一为蒽醌类口](anthraquinone,AQ),包括大黄
素(emodin,EM)、大黄酸(rhein)、大黄酚(chryso—
phanol,CH)、大黄素甲醚(physcion,PH)等;何首乌
中另一种有效成分为二苯乙烯苷(stilbene
glycoside)类[2]。夜交藤CaulisetFoliumPolygoni
Multiflori,YJT叉名首乌藤,为蓼科植物何首乌的
干燥藤茎或带叶藤茎,有养心、安神、通络、祛风止痛
等功效口],用于治疗失眠、劳伤、多汗、血虚身痛。何
首乌与夜交藤虽为同一植物的不同部位,但功效却
不尽相同。二苯乙烯苷和蒽醌类衍生物均为何首乌
中的有效成分。《中国药典>>2005年版中记载了何首
乌中二苯乙烯苷的测定,但并未记载关于何首乌中
蒽醌类成分的测定方法。本实验采用RP—HPLC法
分别测定了何首乌、制首乌和夜交藤中二苯乙烯苷
和蒽醌类衍生物的量,并且对3种药材中二苯乙烯
苷和蒽醌类衍生物的量进行了比较,为探讨其药效
物质基础与作用机制,开发新的药物制剂提供了
依据。
1仪器与试药
Waters高效液相色谱仪,Waters色谱工作站。
大黄素(批号:0756—9908)、大黄酸(批号:0757—
200206)、大黄酚(批号:110796—200309)、大黄素甲
醚(批号:758—9803)、二苯乙烯苷(批号:0844—
200003)对照品购于中国药品生物制品检定所,甲
醇、乙腈均为迪马公司的色谱纯,水为自制重蒸水。
何首乌、制首乌和夜交藤购于河北省安国市药
材公司、河北乐仁堂药店和石家庄市饮片厂,经河北
医科大学药学院聂凤提教授鉴定。
2方法与结果
2.1 色谱条件:色谱柱:Dikma(迪马)C,。柱(250
mm×4.61Tim,5t-tm);流动相:甲醇一乙腈一1%甲酸
(15:10:75),检测波长为320BITI,柱温30℃,体
积流量1.0mL/min。理论板数按二苯乙烯苷计算
不低于2500,分离度大于2L.0。流动相:甲醇一乙腈一
1%磷酸(70:10:15),检测波长为254nm,柱温30
℃,体积流量1.0mL/min。理论板数按大黄素、大
黄酸、大黄酚和大黄素甲醚计算不低于2500,分离
度大于2.0
2.2对照品溶液的制备:精密称取二苯乙烯苷、大
黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚对照品适量,分
别加甲醇溶解并稀释制成160、90.0、100、100、100
lag/mL的溶液,即得。
2.3二苯乙烯苷定量用供试品溶液的制备:取何首
乌、制首乌细粉0.2g,或者夜交藤细粉1.0g,精密
称定,加50%乙醇25mL,称定质量,超声处理15
min,放冷,再次称定质量,用50%乙醇补足减失的
质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.4蒽醌类成分定量用供试品溶液的制备[4巧]:将
收稿日期:2006—04—14
作者简介:苏建(1980一),男,河北秦皇岛人,河北医科大学2004级硕士研究生。
*通讯作者张兰桐Tel:(0311)86266419Fax:(03 1)86052053E—mail:zhanglangtong@263.net
万方数据
柴胡愈伤组织生长和不定根诱导的研究
作者: 姚智, 高文远, 李克峰, PAEK Kee-yoeup, YAO Zhi, GAO Wen-yuan, LI Ke-feng,
PAEK Kee-yoeup
作者单位: 姚智,高文远,李克峰,YAO Zhi,GAO Wen-yuan,LI Ke-feng(天津大学药物科学与技术学院,天
津,300072), PAEK Kee-yoeup,PAEK Kee-yoeup(Research Center for the Development
of Advanced Horticultural Technology, Chungbuk National University, Cheongju
361-763, Chungbuk, Korea)
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2007,38(2)
被引用次数: 5次

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本文链接:http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200702043.aspx