全 文 :中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月· 631·
1)与文献对照[7]一致,据此推断化合物I为
cernuosidesB。
化合物Ⅳ:白色粉末(甲醇),Liebermann—
Burchard反应和Molish反应均为阳性。ESI—MS
m/z:925.8[M—HI一,949.7[M+Na]+,与分子式
C.8H78017一致。其1H—NMR(600MHz,C5DsN)艿:
0.89,0.90,0.94,1.03,1.12,1.22,1.23(7×3H,
s,一CH3),5.43(1H,brs,H一12),1.69(3H,d,J=6.2
Hz,-CH3ofrha),6.23(1H,d,‘厂=8.0Hz,glc7—1一
H),4.98(1H,d,‘厂=7.8Hz,glc-I—H),5.83(1H,
brs,rha’一1一H)。”C—NMR(600MHz,C5D5N)数据
(表1)与文献对照[8]一致,据此推断化合物IV为
oleanolicac d28一O-a—L—rhamnopyranosyl(1—’4)一
}D—glucopyranosyl(1—’6)一pD—glucopyranoside,
为首次从该属植物中分离得到。
3讨论
从以上实验结果可以看出,当样品第一次通过
色谱柱时,各组分之间的峰有所重叠,4个组分化学
结构极为相似,各峰之间未达到基线分离,分离度较
低。而采用循环系统,通过设置程序,可以使样品进
行多次循环,反复经过色谱柱进行分离,最终的分离
结果是每次分离效果的累加。具有分辨率高、检验方
便、收集产物准确、质量分数高等优点。这样在一般
的高效液相色谱上很难或不能分离的样品可以利用
循环功能,达到满意的分离效果,因此循环制备
HPLC可成为天然产物、合成医药研究的有效手段。
致谢:沈阳药科大学孙启时教授在本课题的药
材鉴定中给予的帮助。
参考文献:
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苦参方有效部位成分分析及配伍机制研究
彭 程,胡晋红。,朱全刚,刘继勇,覃 卓,高丽红,王 晶
(第二军医大学长海医院药学部,上海200433)
擅要:目的对苦参方有效部位成分进行定性定量分析.研究方剂配伍对有效成分的影响。方法采用LC—MS、
GC—MS联用技术确定苦参方的有效成分;采用HPLC色谱法对苦参方生物碱进行定量分析,考察方剂配伍后的成
分变化。结果苦参方挥发油中的主要成分有胡薄荷酮、薄荷酮等,苦参方所含苦参生物碱主要有苦参碱、氧化苦
参碱、槐果碱、氧化槐果碱;苦参方的方剂配伍后有效成分发生了转化,氧化苦参碱部分转化成苦参碱,氧化槐果碱
部位转化为槐果碱,挥发油在配伍后成分及量也有所变化。结论确定了苦参方的有效成分及各成分的量,明确了
该方剂配伍后的成分改变。
关键词:苦参方l苦参;荆芥l苦参碱;氧化苦参碱;槐果碱,氧化槐果碱;配伍
中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2008)11—1631—05
苦参方由苦参、荆介组成,始见于《太平惠民和
剂局方》,为治疗疥癣、湿疹和皮肤瘙痒的有效方剂。
苦参中苦参生物碱和荆芥中荆芥挥发油均具有良好
的调节免疫和抗过敏作用‘1’引。但长期以来,该方剂
有效部位成分及量未能明确。本研究采用多种分析
手段,确定了该方剂有效部位的具体成分及量,并证
实了方剂中挥发油和生物碱在苦参与荆芥配伍后发
生了成分的改变和转化,使这一中药传统方剂的含
收稿日期:2007—12-08
基金项目:上海市科委中药现代化重大专项基金(04DZl9846)I上海市卫生局科研课题基金(054099),上海市科委基础研究重点项目
(05JCl4046)
作者简介:彭程(1971--),女,主管药师,在读博士,从事临床药学工作.Telf(021)25070674E—mail:topengcheng@126.com
*通讯作者胡晋红
万方数据
·1632· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月
义更加明确、科学、合理。
1仪器和材料
挥发油测定器(上海盛惠玻璃仪器厂)、10AVP
高效液相色谱仪(日本岛津)、1100SeriesLC/MSD
(美国Aglient)、6890NGC一5973NMSD(美国
Agilent)。
苦参、荆芥饮片经第二军医大学长海医院药学
部王忠壮教授鉴定符合《中国药典92005年版要求;
苦参碱对照品(批号:110780—200402),氧化苦参碱
对照品(批号:110805—200306),氧化槐果碱对照品
(批号:111652—200301)均购自中国药品生物制品检
定所;槐果碱(质量分数≥98%,上海倍翔生物科技
公司);甲醇(色谱纯,Sigma);乙腈(色谱纯,
Merck);乙醇(药用级,上海永玖实业有限公司);其
他试剂为分析纯;水为重蒸水。
2方法
2.1 苦参方有效部位的提取及样品制备:称取苦参
或荆芥单味药或苦参、荆芥质量比为2:1配伍,加
入药材8倍量的水,按《中国药典92005年版的挥发
油测定法(附录XD),进行水蒸气蒸馏,收集挥发油,
为淡黄色油状液体,得率为0.6mL/100g,用于GC—
MS检测。水提液滤过,浓缩,60%乙醇醇沉以除去
蛋白质及多糖等杂质,抽滤取上清液;水蒸气蒸馏后
的药材残渣加8倍量的60%乙醇回流3h,提取2次,
将提取液抽滤,所得滤液与醇沉液合并,浓缩回收乙
醇,浓缩液用蒸馏水适当稀释,5000r/rain离心10
rain,滤过,得HPLC、LC—MS待测样品[3]。
2.2 GC—MS鉴定挥发油主要成分:色谱柱为HP一5
MS柱(29.8mX0.25mmX0.25pm,Agilent
19091J一433);柱温:初始温度60℃,以5℃/rain升
至250℃,恒温10rain,载气:He(>99.999%),恒
流:1mL/min,进样口温度230℃,进样量:1弘L,分
流比50s 1,四极管温度150℃,离子源温度:230℃,
EI源,电子能量:70eV,接口温度280℃,检索谱
库:wiley275、nbs75k库。
2.3 LC—MS鉴定苦参方生物碱成分
液相色谱条件:色谱柱为DiamosalC18TM柱
(250mmX4.6mm,5肛m);流动相:乙腈一水(2l
98,甲酸调pH2.6),体积流量:1mL/min,检测温
度:25℃;检测波长:220rim;进样量:20弘L。
质谱检测条件:电喷雾离子化(ESI)方式,检测
离子为正离子,质量扫描范围m/z150--500,传输/
裂解电压为70V。干燥气体(N。)体积流量:10L/
rain,雾化压力:276×103kPa,干燥气体温度:350
℃,毛细管电压:4000V。
2.4 HPLC法测定苦参生物碱
2.4.1色谱条件:色谱柱:DiamosalC。8TM柱(250
mm×4.6mm,5pm);流动相:乙腈一水(2l 98,
0.05%三乙胺,磷酸调pH3.5)[43;体积流量:I.2
mL/min,检测温度:25℃;检测波长:220rlm;进样
量:20肛L。
2.4.2标准曲线的制备:精密称取苦参碱(Mat)、
苦参碱(Omt)、槐果碱(Sop)、氧化槐果碱
(Osp)对照品适量,以蒸馏水制备质量浓度各为200
ptg/mL的储备液;精密量取0.5、1.0、2.5、5.0、
10.0、20.0、30.0、40.0、50.0mL贮备液用蒸馏水定
容于100mL量瓶中,得质量浓度范围为1~100t,g/
mL的Mat、Omt、Sop、Osp对照品溶液。在上述色谱
条件下,依次进样测定。以峰面积(A)对质量浓度
(C)作线性回归,得Mat的回归方程为:A=ll188
C一1871.6,,.=0.9999;Omt的回归方程为:A=
11167C+2459.6,,.=0.9999;Sop的回归方程
为:A=29409C一29141,r一0.999;Osp的回归
方程为:A=25737C一1901.7,,.一0.999,4种生
物碱在1~100pg/mL线性关系良好。最低检测限为
10ng/mL(S/N≥3)。
2.4.3 精密度试验:分别于1d内3个不同时间点
精密吸取低、中、高3个剂量的Mat、Omt、Sop、Osp
的对照品溶液,重复进样3次,4种生物碱3个剂量
峰面积的RSD值分别为1.30%、1.60%、1.59%;
0.52%、1.09%、0.46%;1.77%、0.81%、0.45%;
1.05%、0.99%、0.81%。分别于3d内,每日一个时
间点,精密吸取低、中、高3个剂量的Mat、Omt、Sop、
Osp的对照品溶液,重复进样3次,4种生物碱3个
剂量峰面积的RSD值分别为1.67%、0.39%、
1.42%;0.58%、1.67%、0.39%;1.83%、1.12%、
1.00%;1.02%、0.96%、0.32%。
2.4.4重现性试验:取供试品溶液,按上述条件进
行测定,将4种生物碱分别配制同一浓度的6个不同
样品进样检测,结果Mat、Omt、Sop、Osp峰面积的
RSD分别为1.64%、1.02%、1.33%、0.79%。
2.4.5稳定性试验:供试品溶液于0、1、2、4、8、12h
进样,结果Mat、Omt、Sop、Osp的质量浓度基本保
持一致,RSD分别为1.26%、0.96%、1.77%、
0.98%,说明供试品溶液在12h内稳定。
2.4.6回收率试验:采用加样回收率测定法。精密
量取样品稀释液(含Mat86.45pg、Omt73.22pg、
Sop47.02/.tg、Osp32.18pg)1mL,共5份,加入含
万方数据
中革蒋ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月· 633。
Mat41.20tlg/mL、Omat40.80}tg/mL、Sop36.00
/生g/mL对照品溶液1、2、3、4、5mL,蒸馏水定容于10
mL量瓶中,在相同条件下进行测定,结果4种生物
碱回收率及RSD分别为:100.18%、0.75%;
99.51%、0.35%;99.65%、1.01%;100.Ol%、
1.32%。
2.5统计分析:采用SAS9.1.3数据统计软件进行
处理(第二军医大学统计教研室协助),组间比较采
用Student7st检验进行。
3 结果
3.1 荆芥挥发油主要成分分析及配伍变化:由GC—
MS分析苦参、荆芥单味药、苦参方(苦参、荆芥两味
药)水蒸气蒸馏法提取的挥发油成分,见表1荆芥在
与苦参配伍前后挥发油成分及各成分比例都有所改
变,量最高的成分为来自荆芥的薄荷酮、胡薄荷酮、
右旋柠檬烯等[5],苦参挥发油成分[6]所占比例较少。
3.2苦参方提取物生物碱成分分析及配伍变化
3.2.1苦参方生物碱成分的确定:苦参方提取物的
HPLC色谱图显示其中主要含4种生物碱成分。经
LC—MS分析,质谱图显示4个峰分别为苦参碱
裹1 GC—MS分析挥发油成分
Table1 AnalysisofvolatileoilcompositionbyGC-MS
成 分
苦参 荆芥荆/芥+苦参
成 分
苦参 荆芥荆芥+苦参
质量分数% 质量分数/%
(+)-3一甲基环己酮 一0.108一 4(1Z),8(13)一二亚乙基三胺一5争一0.1420.463
苯甲醛 一0.198— 醇一石竹烷
1一辛烯一3一醇 2.8350.436 0.423 1,4.6.7,8。9一六氢一2一甲氧基一3一 一 一0.238
3一辛酮 一0.140一 甲基一6,6-双异丙基萘
月桂烯 一0.166一 a一杜松醇1 一 一0.402
月桂酸 3.810 一 一 石竹烯醇一I 1.812—0.254
右旋柠檬烯 1.4483.392 0.282 5,7-二甲氧基一1一萘酚 一 一0.849
1一甲基一2一丙烯基苯酚 一0.142— 3,4-二氟一4一二甲氧苯 一0.6420.683
1·辛烯一3一烃基醋酸盐 一0.228一 6,10,14一三甲基一2·十五烷酮 一 一0.141
tran$一声·2.8-薄荷二烯一1一醇 一 一0.5221一正十四醇 一 一0.640
3,6-二甲基一2,3.3A,4,5,7A一六甲 一0.469棕榈酸 一0.7522.633
嘧啶 9.12-十八碳二烯酸(Z,Z) 一 一0.642
户一薄荷基一trans-2。8---亚乙基三一0.331一 己醛0.221一 一
胺一1一ol a一藻烯0.131一 一
左旋薄荷酮 一38.85729.553莰烯0.207—0.104
右旋薄荷酮 一4.2896.250 香桧烯0.320— .108
异胡薄荷酮 一 1.932 4.952 对聚伞花素0.882一 一
ds一负蒿醇 一 一0.6421.8一桉叶素 2.371 —0.001
2一丁烯醛0.0110.347 — 正壬醛0.078一 一
3一甲基一4,5,6,7一四氢茚满一1一酮 一 一0.331樟脑0.092一 一
1一乙基一3一枯烯 一 一 1.110 紫苏酮0.207—0.051
1-甲氧基-4一(1一乙烯基)苯酚 一0.412一 香叶基丙酮 7.236 一 一
(+)一胡薄荷酮 一 40.83338.422 l一辛烯一5一醇 2.005 一 一
(1RS,4SR)一8一羟基一户一薄荷烷一3一酮0.7820.362 ”十五烷 1.333 一 一
辣薄荷酮 一0.4870.826 n一十六烷 5.020 一 一
8一羟基一#-4(5)-p一薄荷烯一3一酮一0.205一 ^一十七烷 13.493—0.154
乙酸桧酯 一0.1500.214 2,6,10,14一四甲基十五烷 5.211 一 一
薄荷二烯酮 一 1.960 1.974 十八烷 11.236—0.011
争波旁烯 一0.1450.138 2,6,10,14一四甲基十六烷 10.024一 一
dj一茉莉酮 ~ 一0.1452.6.10,14一四甲基十七烷 5.117 一 一
5一乙酰基一2一肼基一4一肼基 一 一0.429十九烷 12.091—0-054
丁香烯 一0.6821.091 二十烷 10.362—0.109
}荜澄茄苦素 z.117 —0.433松油烯一4一醇0.023—0·550
d一杜松烯 一 一0.195芳樟醇0.009一 一
(+)匙叶桉油烯醇 一0.4410.490 癸烯一2一酸0.01l一 一
石竹烯氧化物 一 1.277 1.638 争水芹烯0.056—0·0673
12一乙二酸二环[9.1.o]一1,5.5。8一~ 一0.1971,6一二甲基奈0.072一 一
四甲基一十--一-3,7-双烯[1R一 1一甲基一4一乙基一苯0.002一 一
(1R.3E,7E,11R)] 十椤烯0.037一
~
(3S,4R,5S,6R.7S)-头膏香草酚一一 一0.322甲基丁香油酚0.110一 一
9一乙二胺一3一醇
万方数据
·1634· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月
[M+H]+249.1、[M+K]+287.1;槐果碱[M+HI+
247.1、[M+K]+285.1;氧化槐果碱[M+H]+
263.1、[M+K]+301.1;氧化苦参碱[M+H]十
265.1、[M+K]+303.1。经对照品HPLC图谱对照,
可确定4种苦参类生物碱成分分别为苦参碱、氧化
苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱。
A
2
B
3.2.2苦参方配伍生物碱成分变化分析:比较苦参
单味药和苦参方(苦参和荆芥两味药)的提取样品
HPLC色谱图,见图1,并对各生物碱进行分析比较,
结果见表2,发现苦参与荆芥配伍后Omt和Osp明
显减少,而Mat和Sop显著增加。
4讨论
1
O 5 10 15 20 250 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
t/rain
1一苦参碱2一槐果碱3一氧化槐果碱4一氧化苦参碱A一对照品&苦参提取物c-苦参+荆芥提取物
1-matrlne2-sophocarpine3-oxysophocarpine4-oxymatrineA—referencesubstancesB-extractofRadixSophorae
FlavescentisC—extractofHerbaSchizonepetaeandRadixSophoraeFl vescentis
圈1 HPLC色谱图
Fig.1HPLCChromatogram
裹2苦参、苦参与荆芥配伍后生物碱的比较(露一6)
Table2 ComparisonofalkaloidsbetweenRadix$aphoraeFlavescentisa dcompatibility
ofHerbaSchizonepetaeandRadixSophoraeFlavescentis(万=6)
’尸
敏性皮肤病的有效传统方剂,本研究通过多种分析
方法的采用使苦参方的有效部位各成分及组成更加
明确,除挥发油外,苦参类生物碱主要以苦参碱、氧
化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱为主,在LC/MS分析
中还发现有少量槐定碱、槐胺碱等,但由于量较低,
没有对其进行分析,本研究对苦参方主要成分分析
达到了定性、定量的目的,克服了传统方剂不确定性
较大的不足。
在研究中发现苦参与荆芥配伍后挥发油成分及
生物碱成分都有所变化,量较高的几种挥发油成分
中,异胡薄荷酮、丁香烯、棕榈酸在苦参与荆芥配伍
后量有较大增高,左旋薄荷酮量减少,右旋薄荷酮、
胡薄荷酮变化不大,且在配伍后一些成分消失,也有
一些新的成分出现,但在总挥发油中所占比例很小,
所以整体影响不大。苦参挥发油的量较少,且其药理
作用仍不明确,有待进一步研究。苦参与荆芥配伍后
各生物碱量发生了明显的改变,分析两药配伍后可
能发生成分的转化,苦参与其他药材如蛇床子、黄
柏、车前草、地龙等配伍时,氧化苦参碱转化为苦参
碱的情况已有报道[7哪],而与荆芥配伍时两者的转
化未见报道,槐果碱与氧化槐果碱之间在配伍后发
生转化亦未见报道。从苦参类生物碱的化学结构及
理化性质来看,苦参碱型生物碱均具有以苦参碱(简
称M)为代表的骨架结构,属于四环的喹嗪啶类,分
子骨架可看作二个喹嗪啶环的稠合体,M分子式为
C。。H。.N:O,OM是M的N2氧化物,分子式为
C。。H。.N。O。,在一定条件下M和OM可相互转
化[10。,所以氧化苦参碱与苦参碱,氧化槐果碱与槐
果碱之间的转化是可能的。中药配伍后成分的转化
也是中药方剂辨证用药治疗疾病的根本所在,所以
明确中药材有效成分和中药方剂配伍后成分的改变
对于研究中药防治疾病的原理是非常重要的,也是
中药现代化的要求。
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灰毡毛忍冬的化学成分研究
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(江苏省中国科学院植物研究所,南京中山植物园江苏省药用植物研究开发中心,江苏南京210014)
灰毡毛忍冬LoniceramacranthoidesHan .
-Mazz.为忍冬科忍冬属植物,具有清热解毒、抗菌
消炎的功效,在中医临床及民间广泛应用于痈肿疔
疮,喉痹,丹毒,热毒血痢,风热感冒,温热发病等疾
病的治疗。《中国药典>>2005年版一部将其作为新收
载品种,与红腺忍冬、华南忍冬一同列入新增的山银
花项下。国内外对其化学成分的研究相对较少。本
文报道从灰毡毛忍冬中分离得到的8个化合物:金
圣草素一7-0一pD一吡喃葡萄糖苷(I)、苜蓿素一7一。一p
D一吡喃葡萄糖苷(I)、槲皮素(I)、芦丁(Ⅳ)、槲皮
素一3—0一}D一吡喃葡萄糖苷(V)、绿原酸甲酯(Ⅵ)、
绿原酸(Ⅵ)、3一O—pD一吡喃葡萄糖基(1-3)-a—L一吡
喃鼠李糖基(1—2)一a—L一吡喃阿拉伯糖基一常春藤皂苷
元-28-O—pD一吡喃葡萄糖酯苷(Ⅶ),其中化合物I
和Ⅶ为首次从忍冬属中分离得到,化合物Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ
为首次从灰毡毛忍冬中得到。
1仪器与材料
核磁共振光谱用BrukerAV一500型核磁共振
光谱仪测定(TMS内标),熔点用X4型数字显示显
微熔点测定仪测定,ESI—MS在Agilent1100LC/
MSDSL上测定,Labconco(freezedrysyst m/
LYPHLOCK固4.5)冷冻干燥仪。柱色谱材料为硅胶
H(Merck)、RP—C18(YMC,12nm)及SephadexLH一
20(AmershamBioseiences)。灰毡毛忍冬于2003年
6月采自湖南隆回县,经江苏省中国科学院植物研
究所袁昌齐研究员鉴定,标本现存放于江苏省中国
科学院植物研究所药用植物研究开发中心。
2提取与分离
灰毡毛忍冬干燥花蕾38kg用适量90%乙醇回
流提取浓缩得浸膏,取其中一半的浸膏依次用石油
醚、醋酸乙酯萃取。萃取所得醋酸乙酯部分用硅胶柱
分段、脱色,流动相依次为氯仿一甲醇(10:1、4:1、
1 z 1)、甲醇。其中氯仿一甲醇(4:1)部分经反复硅胶
柱分段,反相柱分离及凝胶柱纯化得到单体化合物
I~Ⅶ。
3结构鉴定
化合物I:黄色粉末(丙酮一水),盐酸一镁粉反应
阳性,Molish反应阳性。ESI—MS(m/z):485[M+
Na]+,分子式为C22H2:011。IR蜷是(cm.1):3300
(OH)、1660(C=O)、1600 1495(苯环双键)、
1110(C一0)、1085、840。1H—NMR(DMSO—d。,500
MHz)艿:6.45(1H,d,J一2.18Hz,H一6),6.87(1H,
d,,=2.14Hz,H一8),示A环为5,8一二取代;6.98
(1H,S,H一3),7.59(1H,overlap,H一2’),6.95(1H,d,
J=8.9Hz,H一57),7.60(1H,m,H一6’),示B环为
ABX自旋系统;5.06(1H,d,J=7.40Hz,Glc—H一
1),12.95(1H,S,5一OH)。”C—NMR(DMSO—d6,125
MHz)dt:164.10(C一2),103.75(C一3),181.99(C一4),
161.04(C一5),100.01(C一6),162.93(C一7),94.98
(C一8),156.87(C一9),105.31(C一10),120.45(C一17).
11 . 3(C一27),150.88(C一37),148.01(C一4’),
115.74(C一57),121.32(C一6’),99.47(G一1),73.09
(G一2),77.21(G一3),69.59(G一4),76.43(G一5)。
60.61(G一6),55.95(OCH。)。综合各光谱数据及与
收稿日期:2008.03—28
摹金项目:江苏省社会发展科技计划项目(BS2001025)
作者简介:贾晓东.(1981一),女,内蒙古包头市人,2006年毕业于江苏省中国科学院植物研究所,获硕士学位·从事药用植物活性成分的
。通讯作者冯煦Tel/Fax..(025)84347084E-mail:fengxu@mail.cnbg.net
万方数据
苦参方有效部位成分分析及配伍机制研究
作者: 彭程, 胡晋红, 朱全刚, 刘继勇, 覃卓, 高丽红, 王晶
作者单位: 第二军医大学长海医院,药学部,上海,200433
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2008,39(11)
参考文献(10条)
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汉大学学报(理学版)2008,54(4)
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]-北京中医药大学学报2007,30(11)
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