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Effect of berberine on glucokinase and its related glucose metabolism in rats with insulin-secretion deficiency

小檗碱对胰岛素分泌缺陷型糖尿病大鼠葡萄糖激酶相关糖代谢的影响



全 文 :中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月·725·
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小檗碱对胰岛素分泌缺陷型糖尿病大鼠葡萄糖激酶相关糖代谢的影响
荣太梓,陆付耳。,陈 广,徐丽君,王开富,邹 欣
(华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合研究所,湖北武汉430030)
摘要:目的探讨小檗碱对胰岛素分泌缺陷型糖尿病大鼠肝脏葡萄糖激酶(GK)相关糖代谢的影响。方法观
察小檗碱对实验性胰岛素分泌缺陷型糖尿病大鼠空腹血糖、血清胰岛素(INS)、糖原、肝脏乳酸(LA)、GK活性及
其蛋白表达的影响。结果与模型组比较,小檗碱组大鼠血清空腹血糖水平明显降低,而INS、肝脏LA无明显变
化,肝糖原合成增多、GK活性及其蛋白表达明显增高。结论小檗碱能调节胰岛素分泌缺陷型糖尿病大鼠糖代谢,
这可能与其促进GK活性及其蛋白表达有关。
关键词:小檗碱;胰岛素分泌缺陷;葡萄糖激酶;糖原
中图分类号:R286.72 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2007)05—0725一04
Effectofberberineonglucokinasea ditsrelatedglucosemetabolism
inratswithinsulin—secretiondeficiency
RONGTai—zi,LUFu—er,CHENGuang,XULi—jun,WANGKai—fu,ZOUXin
(InstituteofIntegrativeTraditionalChineseandWesternMedicine,TongjiHospital,TongjiMedicalCo lege,
HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China)
Abstract:ObjectiveTos udytheffectofberberineonglucosemetabolisminratswithinsulin—
secretiondeficiency.MethodsThefastingbloodglucose(FBG)wasobservedbeforeandaftert eatment,
insulin(INS),hepaticglycogen,lacticacid(LA),andtheactivityofhepaticglucokinase(GK)were
detectedaftertwoweeksoftreatment.Atthesametimetheproteinxpressionof.hepaticGKwas
determinedusingWesternblotting.ResultsIncomparisonwiththemodelcontrol。theFBG1 velof
berberinegroupwasobviouslylowered.andthelevelsofhepaticglycogenandGKsignificantlywere
raised。whilet eleve】ofINSandhepaticLAshowednoevidentdifference.ConclusionItiss ggested
thatberberinehasthesignificanteffectonimprovingglucosemetabolisminratswithinsulin—secretion
deficiency,whichmightbe loselycorrelatedwitht effectsonactivatingtheactivityandthexpression
ofGKthatisakeyenzymeofglucosemetabolism.
Keywords:berberine;insulins cretiondef ciency;gtucokinase(GK);glycogen
收稿日期:2006—09—14
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30472254)
作者简介:荣太梓(1979一),男,河北唐山市人,硕士,从事中西医结合临床与科研工作。
Tel:(027)83663304(027)63991563E—mail:tzr2006@yahoo.corn.cn
*通讯作者 陆付耳Tel:(027)83662220E—mail:felu@tjh.tjmu.edu.cn
万方数据
·726· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月
小檗碱是传统中药黄连的主要有效成分。小檗
碱的抗菌、抗炎作用及其临床应用已经众所周知,随
着对小檗碱药理作用研究的不断深入,许多新的发
现见诸报道,尤其是小檗碱的降糖作用成为近来关
注的焦点[1]。国内外众多研究表明,小檗碱的降糖作
用主要在于改善胰岛素(INS)的敏感性[2矗3;本课
题组曾首次报道,小檗碱的抗糖尿病效应尚可通过
直接促进胰岛口细胞分泌INS而起作用[4]。胰岛p
细胞中的葡萄糖激酶(GK)受葡萄糖浓度调节,当
血糖升高时,该酶活性升高,葡萄糖代谢加速。而肝
脏中的GK受INS水平的调节,当血糖升高时,则
血浆INS水平相应升高,GK活性增强,糖原合成
增加[5]。如何解释小檗碱既有改善INS敏感性又有
促进INS分泌的作用,其靶点何在?笔者曾提出假
设,GK可能是小檗碱的作用靶点。为了验证这一假
设,本实验特选择INS分泌缺陷型大鼠为模型,探
讨小檗碱对其GK相关糖代谢的影响。
1材料与方法
1.1药物与试剂:盐酸小檗碱(常州亚邦制药有限
公司,质量分数99.3%),临用前用含0.5%羧甲基
纤维素的PBS溶液(NaCl136mmol/L、KCL2.7
mmol/L、Na2HPO。pH7.4)配成含盐酸小檗碱
28.125g/L的混悬液;盐酸二甲双胍(中美上海施
贵宝制药有限公司生产)同法配制成含盐酸二甲双
胍9.175g/L混悬液。血糖试剂盒(购于北京北化
康泰试剂有限公司),乳酸(LA)测试盒(购于南京
建成生物工程研究所),血清胰岛素放免测试盒(购
于中国原子能科学研究院),链脲佐菌素
(Streptozotocin,STZ,为Sigma公司产品)。
1.2主要仪器:半自动化分析仪、紫外分光光度计、
DYCZ--24型垂直板电泳槽、BDF--1600型双恒电
流仪、DYY~7B型转移电泳仪、WD--9405B型
摇床。
1.3 动物分组与造模:健康雄性清洁级Wistar大
鼠46只,约2月龄,体重(200±20)g,购于湖北省
防疫站。动物先普食适应性喂养1周后,随机取38
只大鼠,尾ivSTZ65mg/kg;普食喂养1周后,尾
静脉取血测空腹血糖,筛选空腹血糖≥16.65
mmol/L[63者32只,随机分成3组(模型组11只,
小檗碱组11只,二甲双胍组10只)。小檗碱组按
562.5mg/(kg·d)给大鼠ig盐酸小檗碱混悬液,
每天早晨给药1次(以下各组给药体积及次数与此
相同);二甲双胍组按184mg/(kg·d)ig二甲双胍
混悬液;模型组ig含0.5%羧甲基纤维素的PBS
溶液[4]。以上3组在干预期间喂普通饲料,每天晚上
SCINS1次(按16U/kgSC常规INS)D,83。另取8
只大鼠不作任何处理,以普通饲料喂养,作为正常
组。各组大鼠干预2周(因实验过程中有动物死亡,
2周后各组大鼠均剩余8只),末次给药后禁食12
h,尾静脉取血分离血清测其空腹血糖,再用戊巴比
妥钠60mg/kgip麻醉,腹主动脉取血,3000r/min
离心15min,取上层血清分装,一20℃保存,待测
INS。同时迅速取出肝脏,用消毒过的锡箔纸包好,
放至一80℃冰箱中保存。
1.4空腹血糖和INS的检测:空腹血糖采用葡萄
糖氧化酶法测定,INS采用放射免疫法测定,均严格
按照相应试剂盒说明书进行操作。
1.5肝组织LA检测:严格按试剂盒说明操作。
1.6肝糖原检测:参照蒽酮法操作。准确称取肝组
织100mg,加2mL5%三氯乙酸(TCA),用电动
匀浆器匀浆,于4℃冰箱过夜,取出于低温离心机
在4℃、3000r/min条件下离心15min,将上清液
转移至另一EP管,取上清液500弘L,于冷水浴中
加入1.5mL蒽酮试剂(称取50mg蒽酮,1g硫
脲,加入到100mL72oA的硫酸中)后摇匀,盖上试
管胶塞并刺上注射器针头,转移到沸水浴中煮沸10
min,再于自来水笼头下冲至室温,可见样品管及标
准管在沸水浴中变为蓝绿色,于620nm波长处测
各管吸光度,空白管以5%TCA500弘L,加蒽酮
1.5mL同样本一同操作,作标准曲线,根据标准曲
线计算出各标本肝糖原值。
1.7肝脏GK活性检测:参考Davidson法[9]。取肝
组织100mg,放入预冷的塑料试管中剪碎,后加入
1mL组织匀浆液(pH7.4,Tris·HCl50mmol/L,
Hepes50mmol/L,EDTA1 mmol/L,MgCl25
mmol/L,KCl100mmol/L,DDT2.5mmol/L),
用匀浆机制成10%组织匀浆。在4℃下以12000
r/min离心15min沉淀微粒,用吸管吸去上层的脂
肪层,吸10肛L上清液放入装有反应液(pH7.4,
Tris·HCl50mmol/L,Hepes50mmol/L,NADH
0.5mmol/L,MgCl27.5mmol/L,KCl100mmol/
L,DDT2.5mmol/L,小牛血清白蛋白10mg/mL)
的两个试管中,分别含100mmol/L和0.5mmol/L
葡萄糖,在37℃水浴锅中孵育10min。然后用半自
动化分析仪在340nm测定吸光度,加入G6PD和
ATP(含5mmol/L),然后每隔10min测一次吸光
度(时间段中间放37℃水浴锅中孵育),计算高糖
管与低糖管吸光度的差值,取各组平均值反映GK
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月·727·
活性。
1.8肝脏GK的蛋白表达:用Westernblotting方
法检测。取肝组织i00mg加入1mL三去污组织裂
解液,匀浆。在15000r/rain和4℃条件下离心30
min,取上清液以考马斯亮蓝试剂盒测蛋白浓度。各
组肝组织总蛋白上样量均为每孔100tLg,2×上样
缓冲液(50mmol/LTris·HCl,4%SDS,0.2%
溴酚蓝,20%甘油,10%p巯基乙醇,pH6.8),沸水
中变性5min,SDS胶110V恒压条件下电泳,200
mA恒流转膜4.5h(不含SDS)。硝酸纤维素膜用
含5%牛奶的TBST(取5mol/LNaCl20mL,1
mol/LTris·HCl10mL,聚山梨酯一201mL,pH
7.4,然后定容至lL)封闭。GK一抗以1:2000
稀释,4℃孵育过夜,用TBST洗膜4次,每次15
min,再用兔抗山羊二抗1:3300稀释,放室温在摇
床上孵育2h,再用TBST洗膜4次,每次15min。
在暗室中用ECL化学发光试剂盒进行检测。
1.9统计学方法:用SPSS软件进行方差分析。
2结果
2.1 各组大鼠干预前后空腹血糖和INS测定结
果:见表1。与正常组比较,其他3组空腹血糖显著
升高(P组比较,小檗碱干预组空腹血糖显著降低(P<
0.05),提示小檗碱具有降低INS分泌缺陷型糖尿
病大鼠空腹血糖的作用。
表1小檗碱对INS分泌缺陷型糖尿病大鼠空腹血糖

和INS的影响(工±S,n一8)
Table1 Effectofberberineonfastingbloodglucose
andINSindabeticratswithINS—secretion
deficiency(;±F,撑=8)
组别
剂量/ 空腹血糖/(mmol·L一1) INS/
(mg·kg1) 给药前 给药后(mU·L一1)
正常 一 3.82±1.017.09土2.02 40.31士13-18
模型 一 23.76±2.36。。25.33士7.38。。13.02+3.78。。
二甲双胍184 25.06+3.10””25.32±9.24。+12.10i5.18’+
尘茎堕 !!!:! !!:!!圭!:!!::!!:!!圭!:!!::三三!!:!!圭!:!!::
与正常组比较:~P”。P<0.01口snormalgroup:△P2.2各组大鼠肝脏LA及糖原测定结果:见表2。
各组大鼠肝组织LA水平无明显变化;与模型组比
较,小檗碱组肝糖原明显增高(P2.3各组大鼠肝脏GK活性的结果:见表2。与正常
组比较,模型组大鼠肝组织GK活性明显降低(P<
o.01);而与模型组比较,小檗碱组肝组织GK活性
则明显升高(P<0.05);提示小檗碱具有促进INS
分泌缺陷型糖尿病大鼠肝组织GK活性的作用。
表2小檗碱对INS分泌缺陷型糖尿病大鼠肝脏LA、
糖原及GK活性的影响(z±S,n一8)
Table2 EffectofberberineonhepaticLA,glycogen,
andGKactivityofdiabeticratswithINS—
secretiondeficiency(i±s,万一8)
剂量/LA/ 肝糖原/ GK活性/
组别(mg.kg-1)(mm。t.g-Z)(mg.g一1)(min.“g一1)
与正常组比较:’P与模型组比较:AP<0.05△AP<0.01
+P<0.05。。P<0.01USnormalgroup
△P<0.05△△P<0.01735modelgroup
2.4 各组大鼠肝脏GK的蛋白表达结果:对各组
大鼠肝脏GK的蛋白电泳条带进行扫描分析,结果
见图1。与正常组比较,模型组大鼠肝组织GK的
蛋白表达明显降低(P檗碱组肝组织GK的蛋白表达则明显升高(P<
O.05);提示小檗碱具有促进INS分泌缺陷型糖尿
病大鼠肝组织GK的蛋白表达作用。
与模型组比较:。P‘P图1各组大鼠肝脏GK的蛋白表达
Fig.1ProteinxpressionofhepaticGK
ofratsamonggroups
3讨论
小檗碱是从小檗碱属植物黄连根茎中提取的一
种季胺类化合物,属异喹啉生物碱,近年来许多临床
和实验研究证实,它能降低血甘油三酯、总胆固醇和
载脂蛋白B水平;显著改善糖耐量和INS抵抗。陈
其明等m3用其干预四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠,发
现能明显降低小鼠的血糖。本实验室前期工作证明
小檗碱能降低实验性2型糖尿病大鼠的空腹血糖,
并能促进INS分泌‘3’41;从而证实小檗碱具有改善
万方数据
·728· 中草芮ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月
INS抵抗和改善INS分泌的双重作用,但是小檗碱
对糖代谢的具体环节或作用靶点需要进一步探讨。
血糖的调节非常精细而复杂,血糖升高,可以刺
激胰岛B细胞分泌INS;INS浓度升高,又可以降低
血糖。血糖稳态是保证器官组织生理功能正常的关
键,而GK对维持血糖稳态起着重要作用。GK是一
种己糖激酶,特异地存在于成熟肝细胞和胰岛B细
胞中;GK催化葡萄糖转变为6一磷酸葡萄糖,且不受
6一磷酸葡萄糖的反馈抑制,而此反应是葡萄糖在体
内代谢的第一步反应。胰岛B细胞中GK与肝脏中
的GK所发挥的作用显著不同。胰岛B细胞中的
GK受葡萄糖浓度调节,当血糖升高时,则该酶活性
升高,葡萄糖代谢加速。而肝脏中的GK受INS的
调节,当血糖升高时,则血浆INS水平相应升高,
GK活性增强,糖原合成增加[5]。由此可见,GK参与
了周围组织葡萄糖的利用,也与胰岛B细胞分泌
INS有关。根据前述小檗碱对糖代谢的作用特点,推
测GK可能是其重要的作用环节或作用靶点之一。
从小檗碱对INS分泌和肝细胞葡萄糖代谢有
良好的调节效应和对其下游环节的效应来看,小檗
碱与GK激动剂的活动与环节非常相似;因此,本
实验采用尾iv大剂量STZ的方法建立INS分泌缺
陷糖尿病大鼠模型,尽可能地切断胰岛p细胞分泌
INS而调节糖代谢这条途径,从而仅从观察小檗碱
对大鼠肝脏糖代谢及其对GK的影响人手,探讨其
作用机制。研究表明,造模大鼠空腹血糖明显升高,
2周后造模组INS较正常组明显降低,而各组间无
明显差异,提示本实验所用的动物模型符合INS分
泌缺陷模型的特征和要求。本实验结果表明,小檗碱
能显著降低INS分泌缺陷型糖尿病大鼠空腹血糖;
同时小檗碱能直接促进肝脏GK的活性和蛋白表
达,促进肝糖原的合成。肝脏GK不仅是糖代谢的
限速酶,而且把肝糖中间代谢产物与血糖波动偶联
起来,起着葡萄糖感受器的作用,其作用可能类似于
磷酸化酶a,可能激活糖原合成酶促进糖原合成。因
此与模型组比较,小檗碱组的糖原合成显著增加。而
正常组糖原偏低可能是因为其血糖偏低,底物少从
而激活肝GK发挥糖原合成的作用相对较弱。但这
并不意味着正常组GK活性不高(本实验中测得
GK活性数据也恰恰证明了这一点),而是因为没有
高血糖的刺激,它的底物少,使得糖原合成少。而各
组大鼠肝组织LA水平无明显变化,应该是各组大
鼠主要是通过有氧氧化途径进行糖代谢,糖酵解途
径糖代谢相对很少,因而生成LA的量无明显差异。
本实验初步阐明了小檗碱可能通过促进肝脏GK
活性和蛋白表达而降低血糖的作用机制。有些专家
研究认为,1型糖尿病患者在应用胰岛素时,全身用
药并不能完全模拟胰岛p细胞功能正常时的门脉高
胰岛素血症,导致INS对肝脏的作用仍低于正常,
也就不能很好地刺激肝脏GK产生,使GK仍处于
低水平,不利于调节肝糖代谢。而小檗碱能直接促进
肝脏GK活性及蛋白表达,促进糖代谢,这就为临
床应用小檗碱治疗糖尿病和开发新药提供了理论依
据。当然小檗碱尚可以通过AMP—AMPK—p38途径
绕行INS信号途径和刺激糖的吸收,因此小檗碱的
降糖机制也有待进一步探讨。
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