全 文 ：中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11,El·1691·
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适合中药研究的小鼠$180肿瘤获得性多药耐药模型的建立及稳定性研究
陈 强1，李贵海2，孙付军2，尹格平3
(1．济南市中心医院，山东济南250013；2．山东省中医药研究院，山东济南250014；
3．济南军区总医院，山东济南250031)
摘 要：目的模拟临床化疗PFC(顺铂、环磷酰胺、5一氟脲嘧啶)方案，诱导小鼠S。。。肿瘤细胞多药耐药(MDR)
相关生物因子的异常表达，建立获得性多药耐药基因表达产物P。，。(P糖蛋白)、LRP(肺耐药相关蛋白)及拓扑异
构酶Ⅱ(TOP()Ⅱ)表达小鼠载体模型，并观察模型稳定性，为探讨药物干预MDR的有效途径提供实验模型，同时
为临床提供全面定量检测肿瘤耐药程度的方法。方法 应用流式细胞术动态检测MDR表达产物P。，。、LRP、
TOPOI表达情况及S。。。细胞凋亡指标(Fas因子，CD。s)，同法检测同期外周血淋巴细胞上述指标，模型小鼠传代
后ig给予苦参碱100mg／kg，再次检测上述指标。结果实验组小鼠白化疗后1周P。，。、LRP、TOPOⅡ表达逐渐
增高，自第4周后显著性增加(P
MDR相关基因表达稳定，给予钙离子拮抗剂苦参碱可逆转上述指标的表达。
关键词：化疗；多药耐药；P。，。；细胞凋亡；苦参碱
中图分类号：R286．91 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)11—1691—04
Establishmentofobtainedmultidrugresistancemod IofS180celIinmice
usedforstudyonChinesemateriamedicaandits tability
CHENQfan91，LIGui—hai2，SUNFu—jun2，YINGe—pin93
(1．JinanCe tralHospital，Jinan250013，China；2．ShandongAcademyofTraditionalChinesesMedicine，
Jinan250014，China；3．JinanMilitaryGeneralHospital，Jinan250031，China)
Keywords：chemotherapy；multidrugresistance(MDR)；P170；apoptosis；matrine
以往对肿瘤细胞化疗耐药研究多采用细胞系作
体外研究的方法[1~3]。但在体内化疗过程中，恶性肿
瘤细胞的消亡受到机体免疫系统及化疗药物的影
响，故应用恶性肿瘤细胞系做体外化疗耐药的研究，
难以模拟化疗药物及内环境对肿瘤细胞多药耐药
(MDR)形成的影响。且中药由其性质决定了难以
适合体外细胞培养的要求，故应建立适合中药干预
肿瘤MDR的研究载体细胞模型。小鼠肿瘤细胞多
药耐药基因的结构和功能与人类肿瘤有相关性∞]。
本研究模拟目前临床常用的PFC(顺铂、环磷酰胺、
5一氟脲嘧啶)化疗方案，反复刺激S，。。细胞荷瘤小
鼠，建立获得性MDR表达模型，观察传代后及给予
钙离子拮抗剂苦参碱后模型小鼠相关指标的表达情
况，观察小鼠肿瘤MDR实验模型相关因子的稳定
性，并探讨临床早期发现化疗耐药和建立全面定量
检测耐药程度的方法。
1材料
1．1药品：苦参碱由西安山川I生物制品有限公司提
供，质量分数98％，批号20020516；注射用顺铂
(Pt)，山东齐鲁制药厂产品，批号01111611；环磷酰
胺(Cytoxan，CTX)，上海华联制药有限公司产品，
批号030703；5一氟脲嘧啶(5一Fu)，天津金耀氨基酸
有限公司产品，批号国药准字H12020959。
1．2 动物：昆明种小鼠19～21g，雌雄各半，由山
收稿日期：2006—02—03
基金项目：山东省自然科学基金资助项目(Y2002C37)
作者简介：陈强(1962一)，男，山东省济南市人，副主任中医师，中西医结合专业硕士，研究方向为老年病及微循环。
万方数据
·1692· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月
东大学实验动物中心提供，合格证号为鲁动质字：
200204011；小鼠S。。。细胞腹水型传代瘤种由山东省
医学科学院药物研究所提供。
1．3 试剂：碘化丙啶(PI)，美国Sigam公司产品，
批号NO．247—081—0；异硫氰酸荧光素(FITC)标记
的鼠抗鼠单克隆抗体、Fas因子(细胞凋亡因子
CD95／Ap01)、MDR表达产物P。70(P糖黏蛋白、P—
gP)、LRP(肺耐药相关蛋白)、拓扑异构酶Ⅱ
(TOPOⅡ)及用于免疫阴性对照的兔抗羊IgG
FITC均为美国Pharmigen的产品，由北京岳泰生
物公司提供。藻红蛋白(EB)标记P”。、CD。(T淋巴
细胞标记物)及用于免疫阴性对照的兔抗羊IgG
PE抗体购自美国贝克曼库尔物生物公司。
1．4仪器：FACScan型流式细胞仪，美国BD公司
产品；梅特勒GB一303电子天平，美国梅特勒公司
产品。
2方法
2．1模型建立
2．1．1分组及给药：化疗诱导s，。。实验组(给药
组)20只。化疗方案及用法：实验组采用目前临床
常用的PFC联合化疗方案：(1)Pt，3mg／kg，每周
ip给药1次；(2)CTX、5一Fu，各3mg／kg，每日ig1
次，连续4周。正常S㈤对照组20只小鼠仅接种，不
用化疗药物。
2．1．2接种方法：无菌操作抽取荷瘤S。。。种鼠腹
水，无菌NS稀释至含细胞数l×106／mL，每只小鼠
0．2mI。腹腔接种。
2．1．3化疗药物对s㈨细胞的杀伤性观察：①S。∞
细胞P。，。表达、凋亡情况及细胞杀伤率：每周抽取接
种鼠的腹水2．0mL，经NS洗涤离心(1500r／
min，5min)3次后分装入5支试管用于各项目的
检测。取上述S，。。细胞稀释液少许涂片，加10弘L
P。，。单克隆抗体20rain后，在荧光显微镜下观察瘤
细胞MDR表达情况并拍照。上述5管中的其余4
管调整细胞数至1×106／mL，分别加入PI及相应
的荧光标记抗P。，。、Fas(CD。。)单抗和免疫阴性对
照的抗体工作液进行免疫标记20min[州。以NS10
mL漂洗、离心(1500r／min、10min)后，除去上清
液，加入生理盐水500肛L后进行流式细胞仪检测
(FACScan型美国BD公司生产)。上机后收取2×
104个细胞，计算机记录荧光散射数据、荧光强度后
分别以CellQuestPlot软件(BD公司生产)分析
Fas(CD95)和P170表达量，ModifitLT软件(BD公
司生产)分析凋亡率。S。。。细胞各种分子表达率
(Fas或P，，。等)一各种分子阳性表达的细胞数／受
检细胞数×100％；其中1管用0．4％台盼蓝染色
后，显微镜下计数活细胞，按下式求出药物对细胞的
杀伤率(％)：细胞杀伤率=(对照组细胞存活数一给
药组细胞存活数)／对照组细胞存活数×100％。②
S。。。小鼠外周血淋巴细胞各指标的比较：分别于接种
日起每7天在抽取腹水测定S，∞各项指标的同时，
各组均抽取3只小鼠眼球后静脉血，肝素抗凝后分
离其淋巴细胞，并将细胞分人4管，每管500pL，每
支试管均加入抗CD。(PE标记)工作液20pI。，再
分别加入FITC标记的抗Fas(CD。；)、P。，。的工作液
20肚L，免疫标记20rain后加入500pI。NS。同法进
行流式细胞仪检测，以判断化疗过程中外周血T淋
巴细胞MDR、Fas(CD。。)表达情况及与S。。。细胞上
述指标表达的相关性。
2．2 MDR模型化疗敏感性及稳定性观察
2．2．1MDR模型化疗敏感性观察：依照2．1方法
建立小鼠MDR模型。实验组末次给予CTX和5一
FU24h后，无菌抽出腹水，由NS稀释至含瘤细胞
1×107／mL，无菌接种于小鼠左腋皮下，每只小鼠
0．2mL，接种24h后，随机分为3组：NS对照组、
20mg／kgCTX组和苦参碱(100mg／kg)+CTX
(20mg／kg)组；另设未化疗诱导S、。。NS组和
S㈣+20mg／kgCTX对照组。每组10～12只，雌雄
各半。除两个NS对照组外，其余各组均每日SC20
mg／kgCTX，NS对照组igNS0．2mL／10g，苦参
碱组ig0．5％苦参碱溶液0．2mL／10g，给药10d。
末次给药24h后，处死小鼠，剥离瘤体，称质量，t检
验进行组间比较，并按(对照组瘤质量一药物组癯
质量)／对照组瘤质量X100％，计算抑瘤率；按(药物
组抑瘤率一对照组抑瘤率)／对照组抑瘤率X100％，
计算药物对抑瘤作用的提高率。
2．2．2MDR模型化疗稳定性观察：无菌抽取化疗
诱导4周的MDR小鼠S。。。腹水，由无菌NS稀释至
含细胞数l×106／mL，每只小鼠0．2mL腹腔接种，
并取各化疗诱导4周的MDR小鼠S。。。腹水2mL，
肝素抗凝，PBS液洗脱3次后，70％乙醇固定，4℃
保存。小鼠接种耐药Sm细胞后24h，随机分为对照
组、苦参碱100mg／kg组，每组14只，对照组ig水
0．2mL／10g，苦参碱组ig0．5％苦参碱溶液0．2
mL／10g，连续10d，于末次给药24h后，无菌抽出
腹水，肝素抗凝，pH7．4PBS液洗涤，1500r／min
离心5rain，共3次，后用70％乙醇固定，检测S-s。
肿瘤细胞相关生物因子Pm、LRP、TOPOⅡ，观察
万方数据
中草蔼ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月·1693·
MDR模型鼠瘤细胞传代后上述生物因子的表达情
况及苦参碱对其的治疗作用。
2。3统计学方法：两组间比较采用t检验，多组间
比较采用方差分析。
3 结果
3．1 MDR模型的检测结果
3．1．1第1～3周S，。。细胞杀伤率、P。，。表达、凋亡
率和Fas(CD。。)表达水平：见表1。结果提示：正常
SⅢ组中各指标在第1、2、3周均无显著性改变，两周
后小鼠出现死亡，于第3周剩余6只；化疗诱导组随
化疗时间延长，P。，。水平逐步上升，至第5周显著高
于第1周，第5周明显表达MDR小鼠有8只，占
61．4％，凋亡率、细胞杀伤率及Fas(CD。。)表达水
3周后幅度明显下降，但仍显著高于正常s。。。组。两
周后小鼠也出现死亡，但死亡率明显低于正常S，so
组，至第5周小鼠剩余13只。
3．1．2第1、3、5周时外周血淋巴细胞P。，。表达、凋
亡率及Fas(CD。。)表达水平：见表2。结果提示：化
疗诱导组小鼠外周血淋巴细胞凋亡率及Fas
(CD。。)水平于第1周明显增加，显著高于正常S㈨
组。随化疗时间延长P：，。水平呈上升趋势，至第3周
时P。，。表达显著增高。第5周时8只小鼠中5例淋
巴细胞MDR表达阳性，占62．5％，此时淋巴细胞
凋亡率及Fas(CD。。)表达水平低于第1周水平。
相关性检验证实第1、3、5周时外周血淋巴细胞
PⅢ表达水平与S，。。细胞MDR表达水平显著相关，
平至第1、2周呈较高水平，显著高于正常S，。。组，第 相关系数分别为0．97、0．68、0．86。
表1 S,so细胞杀伤率、P。表达、凋亡率和Fas(CD，5)表达水平(；±s)
Table1 Cytotoxicityrate，P,Toexpression，apoptosisrate，andFas(CDgs)expressionofSlsocells(z士s)
与同组第1周比较：’P
表2外周血淋巴细胞PI，0表达、凋亡率及Fas(CD95)表达水平(i士s)
Table2 Pmexpression，apoptosisrate，andFas(CD9s)expressionoflymphocytenperipheralblood(j土s)
表注同表1
NotesaresametoTable1
3．2 MDR模型化疗敏感性及稳定性
3．2．1MDR模型化疗敏感性结果：见表3。结果提
示：PFC方案给药4周使小鼠S。。。肉瘤细胞产生耐
药性，降低化疗敏感性，苦参碱明显逆转耐药S，。。细
胞的耐药性，提高化疗药物CTX的化疗敏感性。
3．2．2MDR模型稳定性和药物敏感性检测结果：
见表4。结果提示：传代后对照组各检测指标与化疗
诱导4周组比较差异无显著性，苦参碱组与对照组
比较差异非常显著(P
抗剂苦参碱[53可明显的逆转上述各指标的过度
表达。
4讨论
近年来以小鼠作为动物模型进行试验性化疗的
研究已取得了一定的进展，但是以化疗方案为依据
建立的多种药物所致的肿瘤细胞MDR动物模型尚
少见报道。本研究以目前临床治疗卵巢癌最常用的
化疗方案(JJN铂+环磷酰胺+5一氟脲嘧啶)建立了
小鼠MDR表达动物模型，应用分子生物学技术动
态监测腹水SⅧ癌细胞受长期持续化疗药物作用
万方数据
·1694· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月
表3耐药S。肉瘤小鼠化疗敏感性(；士s)
Table3 Sensitivitytochemotherapy
ofMDRSlBomice(i土s)
组剐 动物／只 癌体质量／g II$1Z抑瘸作用提高率／％
与耐药S180+CTX组比较：’P<0．05
与正常S180+CTX组比较：△△△P
△△△P<0．001USnormalSIso+CTXgroup
表4传代后MDRs。∞小鼠表达(x士s)
Table4 Expressionoftransplanted
MDRS180mice(z士S)
组别 动物／只P170／9《LRP／96TOPOI／96
化疗诱导4周(传代前) 1 2
对照(传代后) 11
苦参碱100mg／kg(传代后)12
与对照组比较：⋯P
后，其MDR基因表达的情况，以及在不同MDR表
达水平时，S。。。细胞的凋亡程度以及同期外周血淋巴
细胞MDR表达及凋亡程度。建立了可以早期发现
以MDR表达为基础的耐药的检测体系。同时观察
了模型建立后对化疗药物的敏感程度、传代后模型
的稳定性及钙离子拮抗剂对模型的影响，进一步考
察了该模型的实用性。
研究结果显示，在未用化疗药组(对照组)，1～
3周内SⅢ细胞P。，。表达量、凋亡率及Fas(CD。。)表
达率均无显著变化，小鼠因癌性腹水的大量增加而
体重增加，衰竭而死亡，平均生存期仅(17．5_-4-4．5)
d。实验组随用药时间延长生存期也明显延长，而
MDR表达呈逐渐上升趋势，到第5周时，其P，，。表
达量较第1周时上升了10余倍，与对照组相比有显
著性差异；S㈨凋亡率、细胞杀伤率、Fas(CD。。)表
达水平及生存期明显高于对照组。实验组小鼠S。们
细胞P。，。表达水平随化疗作用时间的延长而增加的
同时，凋亡率、细胞杀伤率及Fas(CD。。)表达水平
增幅却明显下降。给予正常S。。。小鼠和耐药S，so小鼠
相同的化疗条件，观察其对化疗的敏感性，与正常
S，。。组比较，耐药S，。。小鼠明显增强对化疗药物的耐
受性(P<0．001)，实验组小鼠外周血淋巴细胞
MDR表达水平亦随化疗作用时间的延长而增加，
至第7周时已显著增加，且与S㈨细胞MDR表达
水平有显著的相关性，淋巴细胞的凋亡则呈逐渐下
降的趋势，提示淋巴细胞对化疗药物耐受性有所增
加。此点提示，化疗使小鼠生存期明显延长，但经数
个疗程化疗后，癌细胞MDR逐渐表达而对化疗产
生抗性，表现在癌细胞凋亡率下降。本实验还提示，
在化疗5个星期后，应对癌细胞MDR表达水平进
行检测，以早期发现耐药。如果难以取得癌细胞，可
通过检测外周血淋巴细胞MDR表达水平间接反应
癌细胞MDR表达情况。将化疗4周的小鼠S㈣腹水
液再次传代，并给予钙离子拮抗剂苦参碱，对照组与
化疗4周组比较无明显差异，提示MDR小鼠再次
传代后MDR相关生物因子表达稳定，应用钙离子
拮抗剂是目前公认的治疗MDR有效途径[5]，苦参
碱可有效逆转MDR相关生物因子的过度表达，表
明该模型与临床肿瘤化疗引起的获得性MDR具有
可比性和相关性，能够应用其作为研究治疗MDR
药物的工具。
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适合中药研究的小鼠S180肿瘤获得性多药耐药模型的建立及
稳定性研究
作者： 陈强， 李贵海， 孙付军， 尹格平， CHEN Qiang， LI Gui-hai， SUN Fu-jun， YIN Ge-
ping
作者单位： 陈强,CHEN Qiang(济南市中心医院,山东,济南,250013)， 李贵海,孙付军,LI Gui-hai,SUN
Fu-jun(山东省中医药研究院,山东,济南,250014)， 尹格平,YIN Ge-ping(济南军区总医院
,山东,济南,250031)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(11)
被引用次数： 1次
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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200611036.aspx