全 文 ：中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月·18 9·
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红花注射液对大鼠细胞色素P4502D6亚型的抑制作用
刘高峰，郭兴蕾，黄丽军
(哈尔滨医科大学附属第二医院药学部黑龙江省高校重点实验室，黑龙江哈尔滨 150086)
摘要：目的研究红花注射液对大鼠细胞色素P4502D6亚型(CYP2D6)的影响。方法利用探针药物右美沙
芬(DM)，高效液相色谱法测定各实验组(对照组，红花注射液0．9、1．8、3．6mI，／kg组)大鼠体内尿液中与体外肝
微粒体温孵系统中DM的代谢率，考察红花注射液对大鼠CYP2D6活性的影响。结果体内实验和体外实验中，
红花注射液1．8和3．6ml，／kg组DM的代谢率均明显低于对照组(P
10．64mg／mL。结论红花注射液对大鼠CYP2D6有显著的抑制作用。
关键词：红花注射液；CYP2D6；细胞色素P450；药物相互作用
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)12—1829—04
InhibitionofH nghuaInjectiononCYP2D6inrats
LIUGao—feng，GUOXing—lei，HUANGLi—jun
(KeyLaboratoryofUniversityinHeilongjiangProvince，DepartmentofPharmacy，SecondAffiliatedHospital
ofHarbinMedicalUniversity，Harbin150086，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofHonghuaInjectionontheactivityofratliver
CYP2D6．MethodsThemetabolicratesofprobed xtromethorphan(DM)intheblankandHonghua
Injectiongr ups(O．9，1．8，and3．6mL／kg)inv vourineandinvitrolivermicrosomeincubatedsystem
weredeterminedbyhighperformanceliquidhromatography(HPLC)．Thevariationofthemetabolicrate
ofDMrepresentedtheffectofHonghuaInjectionontheactivityofratliverCYP2D6in口而oandinvitro．
ResultsInvivoandinvitro，theDMmetabolicratesoftreatedgroups(1．8and3．6mL／kg)arelow r
thanthatintheblankgroup(P<0．05，0．01)；TheDMmetabolicratesinHonghuaInjectiongroupand
Cimetidinegroupweresignificantlylowerthanthatintheblankgroupininhibitorystudy(P<0．05，
respectively)；TheDMmetabolicrateinHonghuaInjectiongr up(30mg／mL)wasaboutthesameasthat
inCimetidinegroup(O．6mg／mL)，thein ibitingabilitywasimilarinabove—mentionedtwogroups；The
50o．4inhibitoryc ncentration(IC50)ofHonghuaInjectionis10．64mg／mL．ConclusionTheHo ghua
InjectioncouldsignificantlyinhibitCYP2D6inrat．
Keywords：HonghuaInjection；CYP2D6；cytoehromeP450(CYP450)；druginteraction
收稿日期：2008—04—03
基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目(11531114)
作者简介；刘高峰(1965一)，女，主任药师，博士，硕士生导师．研究方向为中药代谢与药物相互作用。
Tell(0451)55969328E—mail：liugaofengwty@126．com
万方数据
·1830· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月
细胞色素P450(cytochromeP450，CYP450)
氧化酶是人体内最重要的药物代谢酶。涉及药物代
谢的CYP450主要为CYPl、CYP2、CYP3家族中
的7种亚型。已经确立临床有90％以上的药物经过
CYP亚酶CYPlA2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4
代谢[1]。经同一亚型代谢的药物如果联合应用时，可
能会产生代谢性药物相互作用，导致血药浓度降低
达不到治疗效果或浓度增高而使不良反应增加心J。
红花注射液是由菊科植物红花的花经提取加工制成
的灭菌水溶液，具有活血化瘀、止痛消肿之功效，临
床上主要用于治疗闭塞性脑血管疾病、冠心病、脉管
炎等。红花注射液临床上常与B受体阻断药、抗高血
压药、抗心绞痛药、抗心律失常药等联合使用，而这
些药物有很多都是CYP2D6的底物“]，有报道经
CYP2D6代谢的许多药物治疗浓度范围较窄，其疗
效和不良反应易受药物相互作用的影响“]。红花注
射液对CYP450代谢的研究尚未见报道，本实验就
红花注射液对CYP2D6的影响进行了研究，为临床
安全合理用药提供参考。
l材料
1．1仪器：Waters2010高效液相色谱仪(717自动
进样器，616泵，470荧光检测器)；高速冷冻离心机
(美国Beckman公司)；SHA—C型水浴恒温振荡器
(江苏金坛市亿通电子有限公司)；DY89一Ⅱ电动玻
璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
1．2药物及试剂：红花注射液(规格20mE／支，每
1mL注射液中含有红花生药量0．5g，批号
060702—1，山西亚宝药业集团股份有限公司)；右美
沙芬(dextromethorphan，DM)、去甲右美沙芬
(dextrophan，DX)、p葡萄糖醛酸酶、异柠檬酸脱氢
酶、异柠檬酸钠均购自Sigma公司；氧化型辅酶Ⅱ
二钠(NADPNa2)购自Roche公司；盐酸丁丙诺菲
对照品(DB)购于中国药品生物制品检定所；己烷
磺酸钠、甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，
水为纯化水。
1．3 动物：SPF级Wistar雄性大鼠，体质量
(180+20)g，由哈尔滨医科大学动物中心提供，合
格证号：SCXKHEl20020002。
2方法Ⅲ
2．1动物实验：Wistar雄性大鼠随机分成4组(对
照组与红花注射液低、中、高剂量给药组)，每组6
只。对照组大鼠每天尾iv给予生理盐水1mL，各给
药组大鼠每天分别尾iv给予红花注射液0．9、1．8、
3．6mI。／kg(相当于红花生药量0．45、0．90、1．80
g／kg)，连续给药7d。第8天4组大鼠均ig给予探
针药物DM6mg／kg，然后留置代谢笼内收集8h
内尿液后，大鼠断头处死(处死前禁食24h)。取尿
液和肝脏，分别置一20‘C和一80C冰箱保存。
2．2 尿样的处理：取1mL尿样，加入2mmol／L
盐酸丁丙诺菲内标溶液50pL和pH5．0醋酸钠缓
冲液1mL，混旋15min，置于37℃水浴水解
14h。加入3mI。正己烷一正丁醇(9：1)提取液和
3mol／L氢氧化钠溶液1mL，混旋5min，3000×g
离心5min，取上层有机相2mL置具塞离心管中，
加入0．02mol／L盐酸溶液200肛L，混旋3min，
3000×g离心5min，取下层水相20肛L，注入高效
液相色谱仪进行分析。
2．3肝微粒体制备及处理
2．3．1肝微粒体制备：把对照组和高、中、低剂量给
药组大鼠肝组织经剪碎、漂洗、吸干后称质量，按
1：4加入匀浆缓冲液(50mmol／LTris，11．5g／L
KCl，HCl调pH值至7．4)，冰浴，用玻璃匀浆器制
成肝匀浆，4℃下9000×g离心20min，取上清液
转移至超速离心管内，在4℃下100000xg离心
60min，沉淀即为肝微粒体，重悬于0．25mol／I。蔗
糖溶液中，分装，置一80℃冰箱内保存备用。用
Branford方法测定肝微粒体蛋白质量浓度。
2．3．2肝微粒体体外温孵系统反应：温孵反应体系
中肝微粒体蛋白质量浓度lg／L，NADP+1mmol／
L，异柠檬酸钠20mmol／L，异柠檬酸脱氢酶l×103
U／L，MgCl21mmol／L，探针药物DM0．3mmol／L，
以0．1mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．4)定容至500
pL，加入NADPI。开始反应。37C水浴中孵化45
min，加入20％冰冷的三氯醋酸50弘L终止反应。
2．3．3肝微粒体样品处理：于500弘L温孵反应液
中加入50弘L盐酸丁丙诺菲内标溶液(2mmol／
L)，3mol／L氢氧化钠溶液100扯I，，2．0mL正己
烷一正丁醇(9：1)，混悬振荡5min提取，3000×g
离心5min，取上层有机相1．5mL置具塞离心管
中，加入0．Olmol／L盐酸溶液115pI。，混旋3min，
3000×g离心5min，取下层水相20肛L进样分析。
比较对照组和给药组DM代谢率(DX与DM质量
浓度比值)。
2．4样品测定：尿样和肝微粒体经处理后，用高效
液相色谱仪采用内标法测定其中探针药物DM和
其代谢物DX的质量浓度。内标物为盐酸丁丙诺菲。
色谱条件：色谱柱为Hypersil—C6H5柱(250mm×
4．6mm，5弘m)；流动相为0．02mol／L磷酸二氢
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月·1831·
钾一0．02mol／L己烷磺酸钠一乙腈一甲醇(33：33：
100：94，pH4．0)，体积流量1．0mL／min；Ex=
280nm，EM=310nm。
2．5抑制实验
2．5．1红花注射液抑制曲线：将红花注射液加入到
空白肝微粒体温孵系统中，使其质量浓度分别为0、
5、10、15、20、25、30、45mg／mL，每个质量浓度取3
个平行样，经肝微粒体温孵系统反应及样品处理后，
取20肛L注入HPI。C进样分析。以红花注射液质量
浓度的对数值为横坐标，红花注射液对CYP2D6的
抑制率[抑制率一(1一加药后代谢率／未加药代谢
率)×100％]为纵坐标作图，并用Logit法求半数抑
制浓度(IC。。)，评估红花注射液对CYP2D6的抑制
能力及量效关系。
2．5．2红花注射液与西咪替丁抑制能力的比较：将
肝微粒体分为3组：空白组、红花注射液组和西咪替
丁组(阳性对照组)。红花注射液组是在空白肝微粒
体温孵系统中加入红花注射液(终质量浓度为30
DX
B
-．—LJ--——··--_——--^州
厂——1———一2
DX
mg／mL)，西咪替丁组为空白肝微粒体温孵系统中
加西咪替丁(终质量浓度为0．6mg／mL)。温孵系
统反应同2．3．2项。比较3组DM的代谢率(DX与
DM质量浓度的比值)。
2．6统计学处理：实验数据用z-4-s表示，组间变异
用SPSS软件的单因素方差分析。
3结果
3．1 红花注射液对大鼠肝脏指数的影响：对照组与
红花注射液0．9、1．8、3．6mL／kg的肝脏指数(肝
脏指数一肝质量／体质量)分别为(33．60±5．91)、
(32．78±5．57)、(32．92士4．33)、(31．91±4．41)
g／kg。各给药组与对照组之间及各给药组之间差异
均没有显著性(P>0．05)，表明红花注射液对大鼠
肝脏指数没有影响。
3．2 专属性试验：在本实验色谱条件下，尿样和肝微
粒体样品中DM与DX分离良好；空白尿样及空白
肝微粒体中没有其他组分干扰测定。色谱图见图1。
3．3 红花注射液对大鼠尿液中DM代谢率的影
DX
D
-_JL-‘_‘_。_·。_·’。-4-J
4————8”飞12
E
DM
L贮人
4 8 12
t／min
A一对照品 B一空白尿液C一空白尿液+对照品D一空白肝微粒体E一空白肝微粒体+对照品
A—-referencesubstanceB-blankurinesampleC·-blankurine+referencesubstance
D-blanklivermicrosomeE—blanklivermicrosome+referencesubstance
图1 空白尿液和空白肝微粒体HPLC色谱图
Fig．1HPLCChromatogramsfbl nkurineandblanklivermicrosome
响：用HPLC法测定给药后尿液中探针药物DM及
其代谢物DX的质量浓度，计算DM的代谢率(DX
与DM的质量浓度比值)。根据对照品组和给药组
DM代谢率的比较，评估红花注射液对CYP2D6活
性的影响，结果见表1。红花注射液低剂量组DM的
代谢率与对照组比较差异无显著性(P>0．05)；中
剂量组DM代谢率低于对照组，差异显著(P<
0．05)；高剂量组DM代谢率低于对照组，差异非常
显著(尸<0．01)。
3．4红花注射液对大鼠肝微粒体中DM代谢率的影
响：见表1。红花注射液低剂量组DM的代谢率与对照
组比较差异无显著性(P>0．05)；中剂量组DM代谢
率与对照组相比差异显著(P
影响(善±s，n一6)
Table1 EffectofHonghuaInjectiononmetabolicrate
ofDMinurineandlivermicrosomeofrats
(；±j，甩=6)
．．
剂量／DM代谢率
组别——————————————————————■——一
(g·kg_1) 尿液 肝微粒体
与对照组比较：。P<0．05一P<0．01
。P<0．05‘’P<0．01UScontrolgroup
3．5红花注射液抑制曲线f结果见图2。用Logit‘
法求得红花注射液的lC。。值为10．64mg／mL。
3．6红花注射液与西咪替丁抑制能力的比较：结果
万方数据
·1832· 中革焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月
loo
80
蠢60
磊40
最
20
O
I
Ise
图2红花注射液对体外DM代谢率的抑制曲线
(；士s，露一3)
Fig．2Inhibitoryca veofHonghuaInjection
onDMmetabolicratenvitro(；±s，n一3)
见图3。红花注射液组和西咪替丁组与空白组比较，
DM的代谢率都明显降低(尸
DM的代谢率与西咪替丁(o．6mg／mL)组DM的
代谢率相近，抑制能力相当。
O．10
0．08
静
蓉0．06
吞o．04
O．02
0
空白组 红花注射液组西咪替J‘组
与空白组比较：’尸
图3红花注射液与西咪替丁抑制能力的比较
(；士$，n一5)
Fig．3Comparisonbetweeninhibitoryabilities
ofHonghuaInjectionandCimetidine
(；士s，n一5)
4讨论
本实验利用CYP2D6特异性探针药物右美沙
芬(DM)，通过体内实验(尿液中DM与其代谢物
DX测定)、体外实验(肝微粒体温孵系统中探针药
与其代谢物测定)，比较对照组与给药组DM的代
谢率来评估红花注射液对CYP2D6的影响。体内实
验和体外实验结果均表明，红花注射液对大鼠
CYP2D6有显著的抑制作用。
从红花注射液的抑制曲线可以看出，随着在肝
微粒体温孵系统中加入的红花注射液的量逐渐增
大，红花注射液对DM代谢的抑制能力逐渐增强，
说明红花注射液对CYP2D6的抑制作用有浓度依
赖性。求得的半抑制浓度IC。。值也表明红花注射液
对CYP2D6有明显的抑制作用。
为了测定红花注射液对CYP2D6抑制能力的
大小，进行了体外抑制实验，同时采用了阳性对照药
物西咪替丁作为对比，结果表明红花注射液与西咪
替丁都显著抑制DM的代谢。由于红花注射液法定
质量标准中没有有效成分指标，因此用红花注射液
含红花生药量来表示，红花注射液含红花生药量为
30mg／mL时对CYP2D6的抑制能力与西咪替丁
O．6mg／mL相当。在体外肝微粒体温孵系统中直接
加入受试药物，对酶有抑制作用的药物可能与DM
竞争酶位点，使探针药物DM的代谢率降低，从而可
以筛选出抑制CYP2D6代谢的药物，此法可作为药
物筛选实验应用于经其他亚型酶代谢药物的筛选L5j。
红花注射液有效成分为红花黄色素、红花苷、红
花醌苷及新红花苷等黄酮类物质。黄酮类化合物的
体内代谢研究多见于CYPlA2的报道[6]，对于
CYP2D6的代谢研究尚比较少见。本实验研究结果
提示，黄酮类化合物对CYP2D6代谢的影响应引起
重视，并且值得进一步研究和探讨。
通过本实验结果，提示临床上使用红花注射液
和其他含红花的中药注射液时，应关注其对
CYP2D6的抑制作用，尽量避免与CYP2D6代谢的
其他药物联合应用。如根据临床需要必须联用时，应
注意可能产生的代谢性体内相互作用，适当调整合
用药物的剂量，避免由于红花注射液对代谢酶的抑
制作用使联用药物血药浓度增高不良反应增加而产
生不良后果，提高临床用药的安全性和有效性。对中
药的代谢研究是中药现代化研究的重要方面，可为
临床安全有效合理用药提供科学依据。
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万方数据
红花注射液对大鼠细胞色素P450 2D6亚型的抑制作用
作者： 刘高峰， 郭兴蕾， 黄丽军， LIU Gao-feng， GUO Xing-lei， HUANG Li-jun
作者单位： 哈尔滨医科大学附属第二医院药学部,黑龙江省高校重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150086
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
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