全 文 ：苦参碱对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的体外抑制作用
姜孟臣1 ,陈 虹2,刘洪琪1,陈 莉3
( 1. 武警医学院附属医院 烧伤科, 天津 300162; 2. 武警医学院 药学教研室, 天津 300162;
3. 武警医学院 生物教研室,天津 300162)
组织损伤修复是人体自我保护的一个正常病理
过程, 而过度修复则会出现组织纤维化, 影响组织、
器官的正常功能,人增生性瘢痕是创伤过度修复的
异常结果。苦参碱 ( matrine, M at ) 广泛存在于豆科
植物苦参、苦豆子及广豆根中,近年研究发现其具有
较强的抗组织纤维化作用[ 1] ,目前关于 Mat 对人增
生性瘢痕成纤维细胞(下文简称为成纤维细胞)作用
的报道较少。本实验以成纤维细胞为靶细胞观察不
同质量浓度的 Mat 在体外对该细胞增殖的影响,并
对其抗纤维化作用机制进行初步研究。
1 材料与仪器
苦参碱标准品 (中国药品生物制品检定所提
供 ) ; DMEM 培养基 ( Gibco 公司产品) ; M T T、
Hoechst 33342、PI (碘化丙啶)、胰蛋白酶、胶原酶
(均为 Sigma 公司产品) ; 胎牛血清 (中国医学科学
院血液学研究所提供) ;转化生子因子-1 ( T GF-1)
多克隆抗体 ( Gibco 公司产品) ; Ⅱ抗 ( SP—900 试
剂盒)、DAB 显色试剂盒 (均由北京中山生物技术
有限公司提供) ; 青霉素、链霉素 (华北制药厂生
产)。仪器: 550 型全自动酶标仪 ( BIORAD,美国) ;
E800 型荧光显微镜 ( NIKON, 日本)。
2 方法
2. 1 细胞培养: 手术切取增生性瘢痕组织 ( 6 例,
年龄为 6～32 岁) ,在无菌条件下, 用 D-Hank s 液
浸泡、剪碎, 经胶原酶消化,离心,收集细胞,以 1×
106 / mL 体外培养于 DMEM 培养基中,培养基内含
10% 胎牛血清、2 mmol/ L 谷氨酰胺、100 U/ mL 青
霉素、100 g / mL 链霉素,置 5% CO 2孵育箱中 37
℃ 进行体外培养, 待长成致密单层细胞后, 用
0. 125% 胰蛋白酶消化、传代,实验所用的细胞为第
4～5 代细胞。
2. 2 细胞生长曲线的测定:取对数生长期的成纤维
细胞,用 0. 125% 胰蛋白酶液消化细胞, 制成细胞
混悬液,计数、调整细胞浓度为 2×105 / mL, 接种于
25 mL 培养瓶内, 培养 24 h 后, 实验组加入不同质
量浓度 Mat ( 0. 5、1. 0、2. 0 mg / mL) ,对照组加等量
培养基。以后每天随机从 4组细胞中, 各取出3瓶细
胞, 用台盼蓝拒染法, 在光镜下计活细胞数,取平均
值, 以时间为横坐标, 活细胞数为纵坐标,作图得细
胞生长曲线[ 2]。
2. 3 Mat 对成纤维细胞的细胞毒作用:按 2. 2项方
法制成细胞悬液, 调整细胞浓度为 2×104/ mL, 接
种于 96 孔培养板上, 每孔加 200 L 细胞悬液, 培
养 24 h 后, 加入不同质量浓度 Mat ( 0. 5、0. 75、
1. 0、1. 25、1. 5、1. 75、2. 0 mg / mL) ,另设对照组 (不
加 Mat) 和空白对照组 (只加培养基)。每组设 8 个
复孔,加药后 48 h,加 MTT ( 5 mg/ mL) 20 L, 4 h
后, 离心,去上清液,加入 DMSO 200 L,避光振荡
10 min,用全自动酶标仪 (波长 490 nm) 测定各孔
吸光度 ( A )值, 按文献方法计算细胞生长抑制率[ 3]。
2. 4 荧光双染法检测细胞凋亡比例:取对数生长期
的细胞加入 Mat ( 0. 5、1. 0、2. 0 mg/ mL) ,另设对照
组 (不加 Mat) , 每组设 9 瓶细胞, 分别于处理 24、
48、72 h 取出细胞,每一时段每组取 3瓶细胞,按文
献方法[ 4] , 将细胞消化、离心、洗涤后制成细胞悬液,
用 Hoechest 33342 和 PI 进行荧光双染色, 每瓶细
胞染色后滴片, 在荧光显微镜下观察细胞核形态变
化, 并摄像记录,同时计数凋亡细胞, 随机选 4个视
野, 每个视野计数 250 个细胞, 共计数 1 000 个细
胞,重复 4次,取平均值。按文献方法计算细胞凋亡
比率[ 3]。
2. 5 免疫细胞化学法 ( SP 法) 检测 T GF-1的表
达: 取对数生长期的细胞消化、调整细胞浓度, 将处
理后的盖玻片置于 6 孔板内培养 (每孔一片盖玻
片) ,每孔接种 5×105个细胞, 培养 24 h 后, 加入
Mat ( 0. 5、1. 0、2. 0 mg / mL ) , 正常对照组(只加培
养基)。每组设 9个复孔。再培养 24 h 后,取出生长
细胞后的盖玻片, 用冷丙酮固定, 晾干后, PBS 冲洗
·89·中草药 Chinese T raditional and Herbal D rug s 第 36 卷第 1 期 2005年 1月
收稿日期: 2004-04-23作者简介:姜孟臣( 1962—) ,男,籍贯内蒙古,副主任医师,硕士,主要研究方向为瘢痕防治。T el: ( 022) 60578676 60579602
3次,每次 5 min, 0. 3% 过氧化氢封闭内源性过氧
化物酶,用 0. 5% T ritonx-100处理 10 min,热修复
8 min,自然冷却,血清封闭 15 min,加Ⅰ抗, 4 ℃ 过
夜, PBS 冲洗 3次, 每次 5 min, 加Ⅱ抗, PBS 冲洗,
加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素, PBS 冲洗,
DAB 显色 6 m in, 冲洗,苏木素核复染,常规脱水封
片,用普通光学显微镜观察 Mat 对体外培养人成纤
维细胞 TGF-1表达的影响,并做摄像记录。形态学
评价分析:二甲苯封片后, 光镜下观察,胞质中出现
棕黄色颗粒为阳性, 每张玻片高倍镜下 (×400倍)
至少计数 100 个细胞,计算 TGF-1阳性细胞率。
2. 6 统计处理:采用统计软件 SPSS10. 0进行数据
处理,组间行 t 检验。
3 结果
3. 1 Mat 抑制成纤维细胞生长:由细胞生长曲线,
可见成纤维细胞经 3种不同质量浓度 Mat 处理后,
细胞生长受到明显地抑制, 以 2 mg / mL Mat 的抑
制作用最强, 见图 1。
1-对照 2-0. 5 mg/ mL Mat 3-1. 0 mg /m L M at
4-2. 0 mg/ mL M at
1-cont rol 2-0. 5 m g/ mL Mat 3-1. 0 mg/ mL Mat
4-2. 0 mg/ mL M at
图 1 Mat 对成纤维细胞生长的抑制作用 ( n= 3)
Fig. 1 Inhibitory ef fect of Mat on growth of f ibroblasts
3. 2 Mat 对成纤维细胞的细胞毒作用: 成纤维细
胞经 Mat 处理 48 h 后,经 MT T 法检测, 活细胞数
明显减少,半数抑制浓度 IC50值为 1. 25 mg/ mL,与
对照组相比差异显著, 见表 1。
3. 3 Mat 诱发成纤维细胞凋亡: 荧光双染法染色
后可见对照组细胞核均匀一致,被 Hoechest 33342
染成蓝色荧光, 经 Mat 处理后, 核染色质凝集、碎
裂、出现凋亡小体,凋亡细胞数目随用药质量浓度增
加及用药时间延长逐渐增多, 以 2. 0 mg / mL 作用
最为明显, 于加药后 24 h 细胞凋亡比率达 40% 以
上,加药后 48 h 细胞凋亡比率达 60% 以上。
3. 4 Mat 下调 T GF-1的表达: TGF-1蛋白颗粒在
表 1 Mat 对成纤维细胞的细胞毒作用 ( x±s, n= 8)
Table 1 Cytotoxicity of Mat on fibroblasts ( x±s, n= 8)
组别 质量浓度/ (m g·mL- 1) A 490 生长抑制率/ %
空白 - 0. 086±0. 005 8 -
对照 - 0. 381±0. 025 7 -
Mat 0. 50 0. 338±0. 029 5* 14. 58
0. 75 0. 303±0. 027 6* * 31. 61
1. 00 0. 268±0. 023 6* * 45. 33
1. 25 0. 237±0. 024 9* * 48. 81
1. 50 0. 215±0. 018 7* * 56. 27
1. 75 0. 207±0. 016 7* * 59. 15
2. 00 0. 193±0. 015 2* * 61. 24
与对照组比较: * P < 0. 05 * * P < 0. 001
* P < 0. 05 * * P < 0. 001 v s cont rol group
对照组成纤维细胞的胞浆内呈高密度棕黄色信号,
阳性细胞表达率为 100%,尤以核膜附近较为密集,
而经 Mat 作用后, 成纤维细胞的胞浆内可见阳性颗
粒由深变浅呈淡黄色阴性信号,阳性细胞表达率明
显降低, 2. 0 mg / mL M at 组阳性细胞表达率仅为
30% ,表明 Mat 可抑制人成纤维细胞 TGF-1蛋白
的表达。
4 讨论
本实验结果表明, Mat 能有效地抑制体外人增
生性瘢痕成纤维细胞的增殖。用 2. 0 mg / mL Mat
处理成纤维细胞 24 h 后,活细胞数较对照组减少
40% 以上, 48 h 达 60% 以上,且随时间延长对细胞
的抑制率也增加, 细胞生长曲线测定及 MTT 细胞
毒实验检测均证明 Mat 对细胞增殖有明显抑制作
用,其抑制率与药物浓度呈剂量依赖关系,并与作用
时间呈正相关。荧光双染法证明, M at 可诱导成纤
维细胞凋亡,使细胞核染色质凝集、边移、并发生碎
裂、出现凋亡小体,而且还观察到凋亡细胞的比例与
药物浓度及作用时间呈正相关。T GF-1是重要的细
胞因子,主要有 3种生物学作用:抑制大多数细胞的
增殖,但促进某些间质细胞的增殖; 免疫抑制作用;
促进细胞外基质的合成。其对胶原蛋白合成、分泌有
重要的影响, T GF-1的免疫细胞化学实验结果表
明, 经 Mat 作用后, T GF-1的表达明显减弱, 说明
Mat 能抑制 T GF-1的细胞内合成,也将影响胶原
蛋白的合成。
本实验证明 Mat 能有效地抑制人增生性瘢痕
成纤维细胞增殖, 诱导其凋亡, 且能抑制 T GF-1
的细胞内合成, 这将为该药物开发及临床抗瘢痕治
疗提供理论依据, 但其作用机制还有待于进一步
研究。
References:
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大黄素葡甲胺犬静脉注射体内药动学研究
蒋王林1, 2 ,张尊建2 ,高玉白1,田京伟1,傅风华1
( 1. 山东省天然药物工程技术研究中心 烟台大学药学院,山东 烟台 264003;
2. 中国药科大学 分析测试中心, 江苏 南京 210009)
大黄素具有抗炎作用,能显著抑制醋酸所致的
小鼠毛细血管通透性增加[ 1] ;促进豚鼠离体肠管收
缩[ 2] ; 呈剂量依赖性加强豚鼠结肠带平滑肌细胞电
和收缩活动,机制与抑制细胞膜 KAT P等钾通道的活
性相关[ 3] ;亦明显抑制大鼠肝纤维化形成[ 4]。本实验
对大黄素 iv 给药在犬体内的药动学进行了研究,为
临床用药提供理论指导。
1 材料与仪器
1. 1 药品与试剂:大黄素葡甲胺冻干粉针 (由山东
省天然药物工程技术研究中心制剂室提供, 纯度>
95%, 批号 011106) ; 肝素钠注射液 (徐州万邦生化
制药有限公司,批号 020419) ; 大黄素葡甲胺对照品
(自制, 纯度> 99. 5%) ;色谱纯甲醇, 高氯酸、醋酸乙
酯为分析纯, 重蒸水 (自制)。
1. 2 动物: Beagle 犬 6 只, 雌雄各半, 4 个月龄,
6. 5～8. 0 kg, 中国科学院上海实验动物中心提供,
动物合格证号:中科沪动管第 99-0011 号。
1. 3 仪器: HPLC 色谱仪 (泵: T SP P2000; 自动进
样品: T SP AS3000;检测器: UV3000; 工作站 OS/ 2
cHemstation;恒温箱) ;色谱柱: Discovery C18柱 ( 25
cm×4. 6 mm , 5 m) ;低压溶剂过滤器; 冷冻离心
机,涡旋振摇器。
2 方法
2. 1 色谱条件[ 5] :流动相为甲醇-0. 1% 磷酸水溶
液 ( 85∶15) ;体积流量为 1. 0 mL/ min;检测波长为
254 nm; 柱温为 40 ℃; 采用标准曲线法定量测定血
浆中大黄素葡甲胺浓度。
2. 2 试验方案: 取大黄素葡甲胺冻干粉针, 生理盐
水溶解, 配成 4. 0 mg / mL 药液, 犬耳缘 iv 给药, 剂
量为 4. 0 mg / kg (按对大鼠实验性肠黏连具有治疗
作用的有效剂量 10 mg / kg 制定) , 给药体积为 1. 0
mL/ kg, 10 s 给完, 分别于给药 2、10、20、30、40、50、
60、75、90、120 m in 后犬股静脉抽血 2 mL, 肝素抗
凝, 3 000 r/ min 离心 10 min,取上清液 0. 40 mL,
待测。
2. 3 样品处理方法: 取血浆 0. 40 mL 于 1. 5 mL
Eppendor f 管中, 加入 6% 高氯酸 0. 20 mL, 闭塞,
振摇 1 min, 加入醋酸乙酯 0. 40 mL, 闭塞, 振摇 1
m in, 10 000 r / min 离心 10 min, 精密吸取醋酸乙酯
层 0. 20 mL 于 1. 5 mL Eppendorf 管中, 于 40 ℃
N 2吹干, 精密吸取甲醇 0. 60 mL, 振摇溶解转移至
1. 5 mL 进样瓶中, 自动进样, 上高效液相色谱
( HPLC) 柱,进样体积为 20 L,用标准曲线法进行
色谱分析。
2. 4 标准曲线:取空白犬血浆,加入大黄素葡甲胺
对照品使血浆中浓度为 0. 13、0. 26、0. 65、1. 30、
3. 25、6. 5、16. 25 g / mL, 分别取血浆样品 0. 40
mL,按 2. 3项进行 HPLC 测定,得大黄素葡甲胺峰
面积 ( A bb)。以 A bb值作为纵坐标, 以血浆中大黄素
葡甲胺质量浓度 ( Cbb) 为横坐标, 得标准曲线为:
Y = 87 708 X+ 893 ( r= 0. 999 6) , 结果表明血浆中
大黄素葡甲胺质量浓度 0. 043～5. 375 g/ mL 线性
关系良好。
2. 5 回收率:取分别含大黄素葡甲胺对照品 1. 70、
0. 85、0. 425、0. 213 g/ mL 的犬血浆 0. 40 mL, 每
一浓度分别取 6 个样品于 1. 5 mL Eppendor f 管
·91·中草药 Chinese T raditional and Herbal D rug s 第 36 卷第 1 期 2005年 1月
收稿日期: 2004-05-24作者简介:蒋王林( 1974—) , 男,安徽芜湖人,中国药科大学药物分析在读硕士, 现于山东省天然药物工程技术研究中心工作, 从事中药活性成分的药理研究。T el : ( 0535) 6706030-8004 Fax: ( 0535) 6706036 E-mail: wangl ing@ luye-pharm. com
* 通讯作者 Tel: ( 0535) 6706060 E-m ail : Fen ghua@ Luye-phar m. con