全 文 ：白花曼陀罗悬浮培养细胞生长和生物碱活性成分合成
龚加顺 ,杨兆祥 Ξ
(昆明制药集团股份有限公司药物研究所 ,云南 昆明 　650100)
摘 　要 :目的 　研究白花曼陀罗细胞悬浮培养合成生物碱。方法 　在 MS 液体培养基上悬浮培养细胞生产生物
碱 ,以碳源、p H 值、接种量等为影响因子进行研究。结果 　蔗糖为最佳碳源 ,细胞接种量以鲜重 115～210 g/ L 、培
养液初始 p H 值 515～610 对曼陀罗悬浮培养细胞生长和生物碱合成最有利 ,加入苯丙氨酸能促进生物碱的合成。
结论
白花曼陀罗细胞悬浮培养能有效地合成生物碱。
关键词 :白花曼陀罗 ;悬浮培养 ;细胞生长 ;生物碱合成
中图分类号 :R282113 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2004) 08 0936 04
Cell growth and alkaloid synthesis in suspension cultures of Datura metel
GON G Jia2shun , YAN G Zhao2xiang
( Institute of Materia Medica , Kunming Pharmaceutical Corporation , Kunming 650100 , China)
Abstract : Object 　To investigate the synthesis of alkaloids by cell suspension cultures of Dat ura metel L1
Methods 　Cultured cells derived from leaves of D1 metel were maintained in Murashige and Skoog (MS) liquid
medium1 The effects of different carbohydrated , different inoculum sizes , and different p H values of medium as
affecting facters on cell growth and alkaloid formation were studied1 Results 　The optimum carbohydrate was
sucrose , inoculum size (115 - 210 g/ L) for f resh weight and initial p H values (515 - 610) of the medium were
benefit for cell growth and alkaloid synthesis in the suspension cultures1 The synthesis of alkaloids was improved
when exogenous phenylalanine added to the culture1 Conclusion 　Suspension2cultured cells of D1 metel can be
used to synthesize alkaloids1
Key words : Dat ura metel L1 ; suspension culture ; cell growth ; alkaloid synthesis
　　目前 ,仿天然生物碱成为了研究热点。所谓仿
天然生物碱就是指利用植物组织培养方法所获得的
生物碱 ,把从含生物碱植物的根、茎、叶或花、种子等
器官上取下的组织 ———细胞群乃至单个细胞 ,接种
在特殊控制的培养基中 ,在人工条件下进行离体培
养 ,以此代替原植物体在短时间内生产优质高含量
的生物碱。许多发达国家正在进行这项工作 ,如芬
兰对钝叶天仙子转化根培养 ,可于 14 d 内提高莨菪
碱质量分数为干重的 0179 %[1 ] ;英国 NOVALA 植
物制药公司利用细胞悬浮培养连续发酵生产医药中
间体 ,其中绝大多数为生物碱 ,如咖斯它诺精胺 ;美
国的麦角碱、德国萝芙木生物碱、日本小蘖碱和喜树
碱均已投放市场。
白花曼陀罗 Dat ura metel L1 又名洋金花 (风
茄花) ,系茄科植物。含黄酮、生物碱、多糖等多种有
效成分 ,具有刺激中枢神经系统 ,改善微循环的作
用 ,可在眼科疾病、皮肤病、气管炎、慢性支气管炎、
哮喘、中毒性休克、风湿痹痛等中应用[2 ] 。洋金花
生物总碱具有抗衰老功能 ,能提高机体内源性 SOD
活力和抑制脂质过氧化 ;临床用于麻醉、银屑病、血
栓闭塞性脉管炎眩晕等的治疗[3 ] 。本实验主要对
白花曼陀罗细胞组织悬浮培养合成生物碱进行了初
步探讨 ,研究了接种量、p H、糖质量浓度等对悬浮培
养细胞生长和生物碱合成的影响 ,为进一步规模化
培养合成生物碱奠定基础。
1 　材料和方法
111 　试验材料 :采用由白花曼陀罗叶诱导的愈伤组
织白色细胞系。
112 　培养方法 :采用 MS 液体培养基 (Murashige 和
Skoog ,1962) [4 ] ,并添加 2 ,42D 215 mg/ L ,蔗糖 30
g/ L ,p H 518 ,25 ℃,摇床转速为 90～110 r/ min ,250
mL 摇瓶中培养基装量为 50 mL 。
·639· 中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月
Ξ 收稿日期 :2003212208
基金项目 :昆明制药集团博士后基金项目
作者简介 :龚加顺 (1971 - ) ,云南富源人 ,副教授 ,博士 ,研究方向为生物技术 (细胞工程和食品生物技术) 。
113 　细胞生长测定 :液体培养物经滤纸滤过 ,放置
烘箱中置于 60 ℃烘干至恒重得干重 ,取 3 次重复的
平均值。
114 　培养液中糖质量浓度的测定 :用蒽酮比色法测
定总糖的质量浓度[5 ] ,用 Roe 比色法测定蔗糖的质
量浓度[6 ] 。
115 　培养液中生物总碱的分析 :参照 Roberts 等人
测定颠茄总碱的方法[7 ] ,并加以改进。取培养液 20
mL ,加入 015 mol/ L 硫酸 5 mL ,再加入 30 mL 乙
醚 ,搅拌后放置 5 min 倾出乙醚层 ,另加入 30 mL 乙
醚重复 4 次 ,以除去脂溶性物质。培养液中剩余乙
醚可放置于通风处除去。之后 ,向培养液中加入
10 %氨水 30 mL ,搅拌后放置 30 min ,再加入苯 10
mL 在沸水浴中加热 10 min。将样品全部转移到分
液漏斗 ,加入苯 50 mL ,萃取 60～90 min。反复用
50 mL 的苯萃取 4 次 ,并不断分离苯层将之在沸水
浴中蒸干除去。将蒸出的生物碱残渣溶解在 5 mL
乙醇中 ,精确加入 1 mL 0102 mol/ L 硫酸和 5 mL 蒸
馏水中 ,加入 5 滴甲基红指示剂 ,再用 0101 mol/ L
氢氧化钠溶液回滴剩余的酸 ,同时做空白试验。每
毫升 0101 mol/ L 碱相当于 21894 mg 生物碱。
2 　结果与讨论
211 　白花曼陀罗悬浮培养细胞生长、生物碱合成、
p H 及糖利用曲线 :由图 1 可知 ,在液体培养过程中 ,
细胞生长开始比较缓慢 ,有明显的延迟期 ,当初始糖
质量浓度为 30 g/ L 时 ,从 10～15 d ,细胞出现快速
生长 ,为指数生长期 ,其细胞干重增长量最大 ,为
2133 g/ L ;15 d 以后 ,细胞生长逐渐缓慢 ,细胞干重
增长量为 014 g/ L 。在培养初期 ,总糖消耗缓慢 ,培
养 10 d 后总糖含量急剧下降。这与细胞的快速生
长密切相关。在 20 d 以后 ,由于糖分大量消耗 ,逐
渐限制了细胞的生长 ,细胞生物量的增长趋于平缓。
因此 ,要提高悬浮培养细胞生长量 ,须增加碳源的供
给。另从图 2 可看出 ,生物碱的合成与细胞生长的
变化是一致的 ,即随着培养时间的延长 ,细胞生物量
不断增长 ,生物碱的合成也是增加的。培养初期 ,培
养液中的生物碱增长缓慢 ,到了培养末期 ( 15 d
后) ,出现了大量增长 ,25 d 时生物碱总量为01289 4
g/ L 。
另从图 3 中可以看出 ,在培养过程中 ,培养液的
p H 值处于下降趋势 ,但下降幅度不大 ,培养 25 d 时
为 4198。即使在细胞生长速度最快的时候 ,p H 值
的变化也不大 ,说明细胞组织在液体培养基中具有
一定的自动调节能力。
图 1 　白花曼陀罗细胞悬浮培养过程中
总糖与细胞生物量的变化
Fig11 　Time2courses of total sugar utilization and cell
biomass in suspension culture of D1 metel
图 2 　白花曼陀罗细胞生长与生物碱的合成曲线
Fig12 　Time2courses of cell growth and alkaloid
synthesis in suspension culture of D1 metel
图 3 　pH值随培养时间的变化
Fig13 　Time2courses of pH value
212 　培养液 pH值对白花曼陀罗悬浮培养细胞生长和
生物碱合成的影响 :pH值作为悬浮培养细胞的重要因
素对细胞生长起重要作用。图 4 显示了培养液 pH 值
对白花曼陀罗悬浮培养细胞生长和生物碱合成的影
响。当 pH值为 515～6 时 ,细胞生长量和生物碱合成
量最大。而 pH值高于或低于这个值时 ,细胞生长速度
均下降 ,生物碱合成也表现出类似的变化。
213 　接种量对白花曼陀罗悬浮培养细胞生长和生
物碱合成的影响 :由图 5 ,6 可知 ,白花曼陀罗悬浮培
养的适宜接种质量浓度为干重 115～2 g/ L 。低于
115 g/ L 时 ,细胞生长缓慢 ,生物碱合成量也较少 ;
高于 2 g/ L 时 ,虽然细胞生长量较大 ,但生物碱合成
量却减少。
·739·中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月
图 4 　pH值对细胞生长与生物碱合成的影响
Fig14 　Effects of pH value on cell growth
and alkaloid synthesis
图 5 　接种量对细胞生长的影响
Fig15 　Effect of inoculums on cell growth
图 6 　接种量对生物碱合成的影响
Fig16 　Effect of inoculums on alkaloid synthesis
214 　不同蔗糖质量浓度对白花曼陀罗悬浮培养细
胞生长和生物碱合成的影响 :碳源是细胞生长的能
量来源和构成细胞骨架的重要成分 ,植物细胞培养
一般采用蔗糖、果糖、葡萄糖为碳源。图 7、8 显示了
蔗糖不同质量浓度对白花曼陀罗悬浮培养细胞生长
和生物碱合成的影响。在蔗糖不同质量浓度下 ,细
胞生物量变化不大 ,但生物碱合成差异较大。当蔗
糖质量浓度为 40 g/ L 时 ,生物碱合成量最大为
274193 mg/ L 。较高的初始蔗糖质量浓度对细胞生
长和生物碱合成没有明显的抑制作用 ,说明白花曼
陀罗细胞能够耐受较高质量浓度的糖。
215 　不同碳源对白花曼陀罗悬浮培养细胞生长和
生物碱合成的影响 :图 9、10 为不同碳源对白花曼陀
罗悬浮培养细胞生长和生物碱合成的影响。由图可
图 7 　蔗糖不同质量浓度对细胞生长的影响
Fig17 　Effect of different concentrations
of sucrose on cell growth
图 8 　蔗糖不同质量浓度对生物碱合成的影响
Fig18 　Effect of different concentrations
of sucrose on alkaloid synthesis
图 9 　不同碳源对细胞生长的影响
Fig19 　Effect of different carbohydrates on cell growth
图 10 　不同碳源对生物碱合成的影响
Fig110 　Effect of different carbohydrates
on alkaloid synthesis
见 ,3 种碳源对细胞生长的影响不大 ,但对于生物碱
的合成却有显著的影响。以蔗糖 (30 g/ L ) 作为碳
源 ,生物碱的合成量最大为 274193 mg/ L 。因此 ,选
用蔗糖作为白花曼陀罗悬浮培养的碳源对生物碱的
合成最为有利。
216 　苯丙氨酸对白花曼陀罗细胞生长及生物碱合
成的影响 :在培养基中加入合成生物碳的前体物质 ,
会增加生物碱的生成量。如烟草愈伤组织培养中 ,
·839· 中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月
将前体物质烟碱酸加入 ,会增加烟碱的生成量[8 ] 。
因此 ,在曼陀罗细胞悬浮培养过程的第 10 天添加了
少量的苯丙氨酸 ,添加量为培养液的 01015 %。实
验发现 ,添加少量苯丙氨酸后 ,对细胞生长影响不
大。与对照相比 ,两者的 p H 值和细胞干重基本相
同。但生物碱的合成却有较大提高 ,与对照相比最
大增幅为 4612 % ,最小也有 8135 % (图 11、12) 。若
苯丙氨酸添加量达到培养液的 012 %时 ,对细胞生
长有明显的抑制作用 ,而生物碱则出现了大幅度的
提高 ,与对照相比普遍提高了 95 %以上 (图 13、14) 。
12添加苯丙氨酸　22未添加苯丙氨酸
12with phenylalanine 　22without phenylalanine
图 11 　不同 pH值条件下添加苯丙氨酸对
生物碱合成的影响
Fig111 　Effect of phenylalanine on alkaloid synthesis
with different pH values
12添加苯丙氨酸　22未添加苯丙氨酸
12with phenylalanine 　22without phenylalanine
图 12 　不同 pH值条件下添加苯丙氨酸对
细胞生长的影响
Fig112 　Effect of phenylalanine on cell growth
with different pH values
12添加苯丙氨酸　22未添加苯丙氨酸
12with phenylalanine 　22without phenylalanine
图 13 　添加苯丙氨酸对细胞生长的影响
Fig113 　Effect of phenylalanine on cell growth
12添加苯丙氨酸　22未添加苯丙氨酸
12with phenylalanine 　22without phenylalanine
图 14 　添加苯丙氨酸对生物碱合成的影响
Fig114 　Effect of phenylalanine on alkaloid synthesis
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兰州汇元生物技术研究所
联系人 :李义富 　电话 : (0931) 7357097 　手机 :13109366988
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