全 文 ：复方丹参对缺血预适应大鼠心肌蛋白激酶 C表达的影响
高秀梅 1 ,张伯礼 1 ,商洪才 1 ,王　怡 1 ,郭利平 1 ,张　萌 1 ,史　红 1 ,刘密新 2
( 1. 天津中医学院 中医药研究中心 ,天津　 300193; 2. 清华大学 化学系 ,北京　 100084)
摘　要: 目的　探讨复方丹参加强缺血预适应 ( IPC)的机制 ,是否通过促进蛋白激酶 C ( PKC)蛋白、 mRN A水平
表达发挥作用。方法　采用冠脉结扎大鼠 5 min缺血 , 5 min再灌反复循环 3次的缺血预适应方案 ,缺血 30 min,再
灌 2 h的缺血再灌模型 ,通过免疫组化、 RT— PCR的方法观察 PKC蛋白、mRNA表达以及复方丹参对其影响。结
果　 PKC在正常对照组中主要存在胞浆 ,但经过 IPC和使用复方丹参后 ,在胞膜和胞核也可见 ;不论早期 ,还是晚
期 IPC组 PKC表达均高于假性预处理组 ,以早期 IPC组明显 (P < 0. 01) ;经复方丹参预处理后 , PKC的表达均高
于再灌组、早期、晚期 IPC组 ,以药物预处理+ 缺血预处理组 ( DIPC)为优 ,显著高于早期 IPC组 (P < 0. 01)。 PKC
mRN A在正常心肌组织、再灌组、假性预处理组间无明显差异 ,但 IPC后不论早期 ,还是晚期 PKC mRN A表达均
高于假性预处理组 ,晚期 IPC组表达更加明显 ;经复方丹参预处理后 ,可明显促进早、晚期 IPC及再灌组 PKC mR-
NA的表达 (P < 0. 05)。结论　复方丹参可激活 PKC,使其发生转位 ,促进其蛋白、 mRN A表达水平增高。这可能
是此方加强 IPC的主要机制之一。
关键词: 缺血预适应 ( IPC); 复方丹参 ; 蛋白激酶 C ( PKC)
中图分类号: R286. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 10 0933 03
Effect of Compound Salvia Recipe on myocardial protein kinase C
express ion of ischemic preconditioning rat
GAO Xiu-mei
1 , ZHANG Bo-li
1 , SHANG Hong-cai
1 , WANG Yi
1 , GUO Li-ping
1
ZHANG Meng
1 , SHI Hong
1 , L IU Mi-x in
2
( 1. TCM Resea rch Center, Tianjin Co lleg e of TCM , Tianjin 300193, China; 2. Depa rt ment
of Chemistr y , Tsinghua Univ er sity , Beijing 100084, China)
Key words: ischemic precondi tioning ( IPC) ; Compound Salv ia Recipe; pro tein kinase C ( PKC)
　　蛋白激酶 C ( pro tein kinase C, PKC)是一种
在组织中广泛分布的磷酸化酶 ,静息状态下定位于
细胞胞浆中 ,受到刺激后可以转位至细胞膜、细胞
核 , PKC活化后在细胞分泌、增生、分化等功能中发
挥着重要作用 [ 1]。 PKC的激活在缺血预适应 ( IPC)
跨膜信号传递过程中具有举足轻重的地位 ,是一类
Ca
2+ 、磷脂依赖性的蛋白激酶 , IPC时机体内源性保
护物质释放增加 ,作用于相应的受体 ,经受体和 G
蛋白偶联激活磷脂酶 C ( PLC) ,后者使膜上的磷脂
酰肌醇 -4, 5-二磷酸 ( PIP2 ) 水解为三磷酸肌醇
( IP3 ) 和二酰基甘油 ( DG) , DG是 PKC激活剂 ,
PKC通过移位 ,将信息传递于细胞核和细胞的外
周 ,通过催化多种蛋白质磷酸化 ,进而对细胞产生保
护作用。复方丹参对缺血再灌心肌损伤具有保护作
用 ,可加强 IPC的保护效应 ,减轻缺血再灌心肌坏
死区质量 ,其是否可以激活 IPC级联反应中的关键
物质 PKC,促进其表达从而发挥对心肌缺血的保护
作用 ,本实验从蛋白及 m RNA表达水平进行了探
讨。
1　材料与方法
1. 1　动物: SPF级雄性 Sprage-Daw ley大鼠 ,体重
( 443. 65± 36. 13) g ,由北京维通利华动物实验技术
有限公司提供。
1. 2　药物:复方丹参浸膏根据复方丹参滴丸处方及
提取工艺制备而成 ,出膏率为 20. 26% ,给药量 2. 0
g生药 /kg,经 HPLC分析主要含丹参水溶性成分
和三七总皂苷以及冰片。
1. 3　试剂: PKC小鼠抗大鼠单克隆抗体 ( Santa
Gruz) ,生物素化山羊抗小鼠 Ig G (二抗 ) ,辣根酶标
记链亲合素 (三抗 ) , DAB、封闭用山羊血清 (博士
德试剂公司 ) , DEPC、琼脂糖 ( Sigmag ) , TRIZOL
Reagent ( LTI ) ,一 步法 反转 录 PCR 试剂 盒
·933·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 10期 2003年 10月
收稿日期: 2002-08-18基金项目: 国家重点基础研究规划项目-方剂关键科学问题研究 ( G1999054403)作者简介: 高秀梅 ( 1966— ) ,女 ,内蒙古人 ,副研究员 ,博士 ,现为中国中医研究院中西医结合博士后 ,从事丹参与三七配伍关系研究。
Tel: ( 022) 27386453 23051076　 Fax: ( 022) 27493265
( TakaRa BIOT ECH公司 ) ,大鼠 PKC、β-actin引物
由北京赛百盛生物工程公司合成。 PKC引物序列:
上游 5′-CCGCCTCTACT T TGTGAT-3′,下游 5′-
CCT TGCGT TCGAGTT TCT-3′,长度 563 bp。 β -
actin的序列:上游 5′-CT ATCGGCAATGAGCGG-
T TC-3′, 下 游 5′-CT TAGGAGT T-GGGGGTG-
GCT-3′,长度 762 bp。
1. 4　动物模型的复制
1. 4. 1　复制方法:用 3% 戊巴比妥钠 ( 30 mg /kg )
腹腔麻醉大鼠 ,行气管插管连接小动物呼吸机 ,频率
80～ 90次 /min,潮气量 3～ 4 mL,持续记录心电图
变化。开胸暴露心脏 ,用穿有缝合线的弯针钩绕左冠
状动脉前降支主干 ,线两端共穿过一根聚乙烯小管
以形成闭环。拉紧闭环并用止血钳固定即产生缺血 ,
放松闭环即发生再灌注。缺血性适应 IPC缺血 5
min,再灌 5 min,反复循环 3次。间隔 10 min后 ,再
进行缺血 30 min,再灌 2 h。
1. 4. 2　缺血及再灌标志:缺血的标志为 ST段抬高
和 R波增高 ,左室发绀。 再灌的标志为抬高的 ST
段和 R波恢复 ,发绀区变红。
1. 4. 3　退出实验的标准:有下列情况之一的大鼠将
退出实验: ( 1)当灌注染色后 ,缺血质量 ( AAR)不
足心脏重的 15% ; ( 2)结扎冠状动脉失败或未发现
再灌注者 ; ( 3)过度出血并致血压下降者 ; ( 4)呼吸心
跳停止超过 30 s者。
1. 5　实验分组:将 90只大鼠随机分 9组。其中 61
只大鼠完成了本实验。 除给药组外 ,其余各组均 ig
等量生理盐水。①对照组 ( cont rol ): 不做任何处理。
②再灌组 ( IR):缺血 30 min,再灌 2 h。③假性缺血
预处理组 ( SIPC): 3个 IPC (采用 5 min缺血 , 5
min再灌 ,反复循环 3次 ) 时只穿线 ,不结扎 , 10
min后缺血 30 min,再灌 2 h。 ④缺血预处理组
( IPC):首先 3个 IPC, 10 min后缺血 30 min,再灌
2 h。⑤药物预处理+ 缺血预处理组 ( DIPC): ig 2 h
后 ,再进行 IPC组过程。⑥药物预处理组 ( DIP): ig
2 h后 ,再进行再灌过程。⑦晚期假性缺血预处理组
( SIPC /swop): 3个 IPC时只穿线 ,恢复 24 h后再
进行再灌过程。⑧晚期缺血预处理组 ( IPC /sw op):
3个 IPC后 ,恢复 24 h再进行再灌过程。⑨晚期药
物预处理+ 缺血预处理组 ( DIPC /sw op): ig 2 h后 ,
进行 3个 IPC,恢复 24 h后进行再灌过程。
1. 6　 PKC蛋白表达
1. 6. 1　 PKC蛋白的表达: 采用免疫组化方法检测。
于实验结束时各组大鼠在结扎线以下取 2 cm厚的
全心组织 ,放入福尔马林磷酸盐缓冲液中固定 48
h,石腊包埋 ,切片 , PKC一抗稀释倍数 ( 1∶ 100) ,
染色步骤: 切片脱腊入水。 3% H2O2室温孵育 10
min,以灭活内源性酶。最后蒸馏水洗 3次。将切片
浸入 T AB ( 0. 05 mo l /L, pH 7. 4) 中 ,电炉加热至
100℃ ,持续 30 min。冷却后进行下一步。滴加抗原
修复液 ,室温孵育 10 min,蒸馏水洗 3次。滴加正常
5% 兔血清封闭液 ,室温孵育 10 min,甩去多余液
体。滴加稀释的一抗 , 4℃湿盒内过夜。 T AB洗涤
3次 ,每次 5 min,滴加二抗室温孵育 30 min。 T AB
洗涤 3次 ,每次 5 min,滴加三抗 ( HIG H-SABC)室
温孵育 30 min。 T AB洗涤 3次 ,每次 5 min, DAB
显色。自来水冲洗 ,苏木复染 ,封片。
1. 6. 2　观察方法及判断标准:心肌组织中出现黄染
为阳性。 每张切片由 2位观察者独立计数 ,随机取
染色区域 4个高倍视野 (× 400)阳性细胞平均数 ,
用半定量计分 ,染色强度用 0～ 3级计分: 0-无染色 ;
1-轻度阳性染色 ; 2-中度阳性染色 ; 3-强阳性染色 ;
染色范围根据细胞阳性染色的百分数而分为 0～ 4
级 ; 0-无染色 ; 1-< 25% 细胞染色 ; 2-25%～ 50% 细
胞染色 ; 3-50% ～ 75% 细胞染色 ; 4-> 75% 细胞染
色。 染色总评分为染色强度+ 染色范围。
1. 7　 PKC m RNA表达检测:采用 RT-PCR方法观
察 PKC mRNA表达。于实验结束时各组取心尖组
织 100 mg ,立刻放入液氮中保存。
1. 7. 1　总 RNA的提取: 使用 TRIZOL Reagent
( LT I)提取心脏总 RNA,核酸分析仪定量 ,检测纯
度和含量 ,琼脂糖凝胶电泳分析其完整性。 取 1μg
RN A用于 RT-PCR。
1. 7. 2　一步法 RT-PCR:使用 TakaRa BIO T ECH
公司的一步法试剂盒测定。反应体系为 25μL,每一
反应体系中含总 RNA 1μg,上游引物和下游引物
终浓度为 0. 4μmol /L , PKC RT-PCR扩增的循环
次数 28 cycles,逆转录 50℃ , 30 min;变性 94℃ ,
30 s;退火温度 55℃ , 30 s;延伸 72℃ , 6 min。 β-
actin退火温度为 64℃ ,其他条件同上。
1. 7. 3　 PKC mRNA表达分析: 各组取 0. 5μL扩
增产物 ,进行琼脂糖凝胶电泳 ,结果拍照 ,采用 Im-
age M aster( R) VDS进行吸光度扫描 ( IOD) ,以各组
PKC条带 IOD和相应的 β -actin条带的 IOD比值
表示 PKC mRNA表达的强弱。
1. 8　统计学处理: 数据用 x± s表示 ,用随机设计的
方差分析和 q检验。采用 Stata4. 0软件进行。
2　结果
·934· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 10期 2003年 10月
2. 1　复方丹参对 IPC大鼠心脏组织 PKC蛋白表
达的影响: PKC在对照组中主要存在于胞浆 ,但经
过 IPC和用药后 ,在胞膜和胞核也可见 ,这说明上
述两种情况激活了 PKC,发生转位 ,再灌和假性预
处理组较对照组表达增强 ,但无显著差异 ,早期 IPC
组和晚期 IPC组表达均高于假性预处理组 ,以早期
IPC组明显 ( P < 0. 01) ;经复方丹参预处理后 , PKC
的表达均高于相应组 ,以 DIPC组为优 ,显著高于
IPC组 ( P < 0. 01)。 上述结果提示复方丹参可激活
PKC,促进 PKC蛋白表达 ,见表 1。
表 1　各组缺血预适应大鼠的 PKC蛋白表达 ( x± s)
Table 1　 Ef fects on PKC protein expression
of ischemic preconditioning rats (x± s)
组　别 动物 /只 评分值　
对照 6 　　 0. 88± 0. 21
IR 7 1. 79± 0. 86
SIPC 7 2. 43± 1. 00
IPC 7 3. 36± 1. 17* *
DIPC 7 5. 20± 1. 30* * △△
DIP 7 2. 71± 1. 31
SIPC /sw op 7 1. 25± 0. 63
IPC /sw op 6 1. 83± 1. 48
DIPC /swop 7 2. 71± 1. 12
　　与 IR, S IPC组比较: * * P < 0. 01; 与 IPC组比较: △△ P < 0. 01
　　* * P < 0. 01 vs IR, S IPC g roups; △△ P < 0. 01 vs IPC g roup
2. 2　复方丹参对 IPC大鼠心脏组织 PKC mRNA
表达的影响:琼脂糖凝胶电泳结果见图 1,经分析发
现 , PKC mRNA在正常心肌组织中也表达 ,再灌和
假性预处理组与对照组没有明显差异 ,早期 IPC组
和晚期 IPC组表达均高于假性预处理组 ,晚期 IPC
组表现更加明显 ,复方丹参预处理后 ,可明显促进
早、晚期 IPC及再灌组 PKC mRNA的表达。
3　讨论
1-对照组　 2-缺血再灌组　 3-假性缺血预处理组　 4-缺血预处
理组　 5-药物预处理+ 缺血预处理组　 6-药物预处理组　 7-晚
期假性缺血预处理组　 8-晚期缺血预处理组　 9-晚期药物预处
理+ 缺血预处理组
1-cont rol　 2-IR　 3-SIPC　 4-IPC　 5-DIPC　 6-DIP
7-SIPC /SWOP　 8-IPC /SWOP　 9-DIPC /SWOP
图 1　各组缺血预适应大鼠的 PKC mRNA表达
Fig. 1　 Ef fect on PKC mRNA expression
of ischemic preconditioning rats
　　 IPC的保护主要是由 PKC的激活、蛋白质的磷
酸化及其保护蛋白的积累。当短暂缺血和药物刺激
后 PKC迅速转位 ,使多种保护蛋白发生磷酸化 ,这
是长时间缺血保护的基础。
本实验观察到 , IPC和用药后 PKC有转位的现
象 , IPC组 PKC mRNA和蛋白表达明显增强 ,另外
还发现不论是再灌前给予复方丹参 ,还是早、晚期
IPC前给予复方丹参 ,均可明显促进 PKC mRNA
和蛋白的表达水平。 说明复方丹参对心脏缺血的保
护可能是通过激活 PKC途径而起作用。但 PKC激
活后能使哪些蛋白质发生磷酸化 ,并参与了心肌细
胞的保护作用 ,以及复方丹参激活了 PKC的何种
亚型是今后值得研究的问题。
References:
[1 ]　 Nishizuka Y. Protein kinas e 5, protein kinas e C and lipid sig-
naling for sus tained cellular responses [ J ]. FA SEB J , 1995,
9( 5): 484-494.
消红散对实验性肾小球肾炎小鼠红细胞免疫功能作用机制的研究
张　翠 ,刘　琳
(哈尔滨商业大学 制药工程系 ,黑龙江 哈尔滨　 150076)
摘　要: 目的　研究具有益气健脾摄血功效的消红散对肾小球肾炎 ( GN )小鼠红细胞免疫功能的影响。 方法　复
制免疫性 GN小鼠模型 ,检测小鼠血中 C3b受体花环率及免疫复合物 ( CIC)、红细胞免疫黏附促进因子 ( RFER)、
红细胞免疫黏附抑制因子 ( RFIR) 的变化。结果　消红散能增加 GN小鼠的红细胞免疫功能 ,使 C3b受体的数目
增加 ,促使红细胞清除免疫复合物 ,减少 CIC在肾小球基底膜沉积 ,缓解炎症或 CIC介导的病理过程 ,且能使
RFER活性升高 , RFIR活性下降。 结论　消红散对红细胞免疫功能具有双向调节作用。
·935·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 10期 2003年 10月
收稿日期: 2003-01-10基金项目: 黑龙江省教育厅基金项目 ( 9551130)作者简介: 张　翠 ( 1958— ) ,女 ,副教授 ,博士 ,主要从事方剂的配伍规律及中药复方治疗肾病的研究。 Tel: ( 0451) 84838207