全 文 ：聚酯型儿茶素对人外周血单核细胞免疫反应的影响
史霄燕 1 ,辛华雯 2 ,谢笔钧 3 ,曾繁典 1
( 1. 华中科技大学同济医学院临床药理研究所 ,湖北 武汉 430030; 2. 广州军区武汉总医院 临床药理科 ,湖北　武汉　
430070; 3. 华中农业大学 食品科技系 ,湖北 武汉　 430070)
摘　要: 目的　研究聚酯型儿茶素对人外周血单核细胞免疫反应的影响。 方法　采用 M T T法测定淋巴细胞增殖
反应和 IL-2活性 ,采用免疫细胞化学和间接免疫荧光测定 IL-2R的水平 ,采用放射免疫法测定细胞内 cAM P浓
度。 结果　 50, 150, 500μg /m L聚酯型儿茶素对人外周血单核细胞增殖有明显的促进作用 ,亦可促进经植物血凝
素 ( PHA)活化的人外周血单核细胞产生 IL-2及表达 IL-2R。此外 ,聚酯型儿茶素可明显降低人外周血单核细胞内
cAM P浓度 ,也可对抗前列腺素 E1 ( PGE1 ) 升高 cAM P的作用。 结论　聚酯型儿茶素对人具有明显的免疫增强作
用 ,其机制与促进 IL-2的诱发及其受体的表达 ,降低细胞内 cAM P水平有关。
关键词: 聚酯型儿茶素 ; 淋巴细胞 ; 白细胞介素 -2; 白细胞介素 -2受体
中图分类号: R286. 95　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 05 0432 03
Immunomodulatory effects of theasinesin on human peripheral blood
mononuclear cells in vitro
SHI Xiao-yan
1
, XIN Hua-w en
2
, X IE Bi-jun
3
, ZEN G Fan-dian
1
( 1. Institute of Clinical Pharmaco log y, Tong ji Medica l Colleg e, Hua zhong Univ e rsity of Science and Technolog y ,
Wuhan Hubei 430030, China; 2. Depar tment o f Clinical Pharmacolog y , Wuhan Genera l Hospita l in Guang zhou
Milita ry Region, Wuhan Hubei 430070, China; 3. Depa rtment o f Food Science and Techno lo g y,
Hua zhong Ag ricultur al Univ er sity , Wuhan Hubei 430070, China )
Abstract: Object　 To study the immunomodula to ry ef fects o f theasinesin ( TS) on human peripheral
blood mononuclea r cells ( PBMC) in vit ro. Methods　 The pro liferation response of lymphocy tes and IL-2
production of human PBMC were detected by M T T method. IL-2R expression w as determined by immuno-
cytochemist ry and indirect immuno fluo rescence. The int racellula r cAMP level w as assayed by radioim-
munoassay. Results　 50, 150, 500μg /mL TS could enhance phy tagg lutinin ( PHA) -induced human PBMC
proliferation in a dose-dependent manner. The IL-2 production and IL-2R expression of PHA-activ ated
PBMC were increased ma rkedly under the presence o f TS. TS also decreased cAMP level of PBMC and in-
tensiv ely w eaken the cAM P upregula ting ef fect o f prostag landin E1 ( PGE1 ) . Conclusion　 TS possesses a
potential immunoenhancing ef fect w hich migh t be made by decreasing the cAMP level of PBMC, promo t-
ing IL-2 production and IL-2R expression.
Key words: theasinesin ( TS) ; lymphocy te; lL-2; IL-2R
　　聚酯型儿茶素 ( theasinesin, T S) 是从绿茶中
提取的一种多酚类新型化合物 [1 ] ,研究发现 TS对
小鼠免疫功能有明显的调节作用 (资料待发表 )。本
实验选用 T 淋巴细胞增殖反应、 IL-2诱发及 IL-2
受体 ( IL-2R)表达测定等细胞免疫功能指标 ,研究
T S对人外周血单核细胞免疫反应的影响 ,为探讨
其机制还观察了 T S对细胞内第二信使环磷酸腺苷
(cAM P)的影响。
1　材料和方法
1. 1　主要药品与试剂: 聚酯型儿茶素 (华中农业大
学食品科技系提供 ,纯度 80% ) ,新生小牛血清 (杭
州四季青生物工程材料研究所 ) ,淋巴细胞分离液
(上海试剂二厂 ) ,植物血凝素 ( PHA) (广州医药工
业研究所 ) ,鼠抗人 IL-2R单抗 ( Tac) 和异硫氰酸
荧光素 ( FITC)标记羊抗鼠 IgG (卫生部武汉生物
制品所 ) , SABC免疫组化染色试剂盒和 DAB显色
试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公司 ) , 125 I-
cAMP RIA ki t (上海中医药大学同位素室 )。
·432· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 5期
收稿日期: 2001-08-24基金项目:湖北省“九五”重大科技攻关项目 ( No. 972P1101)作者简介:史霄燕 ( 1973-) ,女 ,河北保定人 ,医学博士 , 1994年同济医科大学获学士学位 , 1999年在该校获医学博士学位 , 1999年 10月～ 2001年 6月在美国 Texas州立大学西南医学中心做博士后研究 , 2001年 7月至今在美国康奈尔大学从事博士后研究 ,研究方向为免疫药理学。 E-mai l: shix y90@ hotmail. com
1. 2　实验对象: 正常人外周血取自武汉市中心
血站。
1. 3　淋巴细胞增殖实验:用淋巴细胞分离液制备人
外周血单核细胞 ( PBMC)。于 96孔板中每孔加 1×
10
7
/mL PBMC细胞悬液 100μL,再加 100μL培养
液或含有不同浓度 TS和亚适浓度 PHA (μg /mL)
的培养液 ,每一样品设 3复孔。 37℃、 5% CO2环境
培养 68 h, M T T法测定各孔的吸光度值 ( A570 nm ) ,
计算细胞增殖百分率。
1. 4　 IL-2的诱生和活性检测
1. 4. 1　 IL-2的诱生 [2 ]:将 2× 106 /mL人 PBMC加
入 24孔培养板中 ,每孔 1 mL,然后分别加入内含
50μg /mL PHA或 PHA和 TS的 RPM I-1640培
养液 1 mL,以及单独加入培养液作为阴性对照。培
养 24 h离心取上清液 ,用 Con A活化的小鼠脾细
胞 MT T法测定 IL-2活性。 部分细胞继续培养至
48 h,检测细胞膜 IL-2R。
1. 4. 2　 Con A活化脾细胞的 M TT法检测 IL-2活
性:常规制备小鼠脾细胞悬液 ,且 RPM I-1640培养
液配成 2× 106 /mL。取 10 mL置培养瓶中 ,加入
Con A (终浓度 5μg /mL) , 37℃、 5% CO2培养 72
h,轻轻摇瓶 ,离心 ( 1 500 r /min, 8 min)取细胞 ,分
别加到 2管各盛有 4 mL质量体积比为 1. 063的
FI分层液上 ;离心 ( 1 500 r /min, 20 min) ,吸出单核
细胞层。用含 10 mg /mLα-甲基甘露糖苷 (α-MM )
的 BSS液洗涤细胞 2次 ,再用 10% N BS-1640培养
液洗 1次 ,并配成 2× 106 /mL的细胞悬液。按每孔
100μL加入 96孔细胞培养板 ,再加入待测样品
100μL。 37℃、 5% CO2培养 48 h。吸弃上清液 ,每
孔加入 5 mg /mL M TT溶液 100μL继续培养 2 h。
离心 ,弃上清液 ,每孔加入酸化异丙醇 120μL,振荡
使充分溶解 , DG3022型酶联免疫检测仪 (南京华东
电子管厂 )测定各孔的吸光度值 ( A570 nm )。
1. 5　 IL-2R的免疫细胞化学法检测 [3 ]: 细胞样品涂
片后 ,纯丙酮 4℃ 固定 20 min。滴加适当稀释的鼠
抗人 Tac, 4℃ 过夜。 加生物素化羊抗鼠 IgG工作
液 10μL, 37℃ , 20 min。再加生物素化 SABC,最后
DAB显色。在显微镜下 ,每张玻片随机选取 10个图
像并转入图象分析仪 ,用 HPIAS-1000高清晰度彩
色病理图文档案系统测定 100～ 150个细胞 (每张
涂片 ) ,计数阳性细胞百分率 ,并测定积分吸光度 ,然
后计算出细胞平均吸光度值。
1. 6　细胞表面 IL-2R间接免疫荧光测定方法 [4 ]:
收集培养后的细胞每试管 1× 106个 ,用冷 1. 5% 小
牛血清 PBS洗涤 ,离心弃上清液后 ,每管加入 1∶
40稀释的鼠抗人 Tac ( IL-2R位点之一 ) 单抗 200
μL,同时设二抗对照 ,混匀 ,置水浴 30 min。用冷
1. 5% 小牛血清 PBS洗 3次 ,最后一次离心弃上清
后 ,加入 1∶ 40稀释的 FITC羊抗鼠 Ig G荧光抗体
200μL,混匀 ,置冰浴 30 min。冷 1. 5% 小牛血清
PBS洗 3次后 ,以每管 0. 2 mL冷 PBS悬浮细胞 ,
置冰浴中送流式细胞仪 ( FACS)测定。每管样品分
析 10 000个细胞得出表面 IL-2R阳性细胞的百
分率。
1. 7　细胞内 cAMP 的检测 [6 ]: 用煮沸法提取
cAMP样品 ,置 - 20℃ 保存待测。采用放射免疫法
( RIA法 )以 FJ-2011γ-免疫计数器 (国营西安 262
厂 )测定细胞内 cAM P浓度 ,严格按试剂盒说明书
进行测定。
2　结果
2. 1　 TS对人 PBMC增殖反应的影响:见表 1。 TS
从 50μg /mL开始对 PHA诱导的人 PBMC增殖有
明显促进作用 ,细胞增殖百分率明显增加 , TS浓度
为 150μg /m L时 ,细胞增殖百分率高达 137. 8% 。
表明 T S可促进活化 PBMC的增殖反应。
表 1　 TS对人外周血单核细胞增殖反应
的影响 ( n= 5, x± s )
组　别　　　　 A 570 nm 增殖百分率 (% )
培养液对照 0. 37± 0. 13
PHA 50μg /m L 0. 44± 0. 16 118. 9
PHA+ TS 50μg /mL 0. 47± 0. 12* 127. 0
PHA+ TS 150μg /mL 0. 51± 0. 08* * 137. 8
PHA+ TS 500μg /mL 0. 51± 0. 10* * 137. 7
　　与 PHA组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
2. 2　 TS对人 PBMC产生 IL-2的影响: 见表 2。
50, 150, 500μg /mL T S组 IL-2水平均显著高于
PHA组 ( P < 0. 05) ,且有明显的浓度依赖性。表明
TS可促进 PHA刺激的人外周血单核细胞产生 IL-
2,提高 IL-2水平。
表 2　 TS对人 PBMC产生 IL-2的影响 ( n= 5, x± s )
组　别　　　　　 A570 nm
培养液对照 0. 19± 0. 03
PHA 50μg /m L 0. 25± 0. 02△△
PHA+ TS 50μg /mL 0. 34± 0. 04* * △△
PHA+ TS 150μg /mL 0. 42± 0. 07* * △△
PHA+ TS 500μg /mL 0. 51± 0. 07* * △△
　　与培养液对照组比较: △△ P < 0. 01
　　与 PHA组比较: * * P < 0. 01
2. 3　 TS对人 PBMC表达 IL-2R的影响 (免疫细
胞化学及间接免疫荧光法 ):见表 3。 IL-2R在细胞
膜表达 ,染色阳性信号均呈棕黄色 ,阴性细胞未着色
·433·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 5期
或着淡黄色。PBMC与 PHA ( 50μg /mL)共育 48 h
后可明显表达 IL-2R, Tac阳性细胞达 33% 。未经
PHA活化的 PBMC培养 48 h不表达 Tac抗原。在
PHA与 PBMC的培养系统中加入 TS可明显增强
IL-2R表达 ,且呈浓度依赖性 ,与 PHA对照组比较
均有显著性差异 (P < 0. 01) ,表明 TS能促进活化
淋巴细胞的 IL-2R表达。结合 FACS图形分析发现
T S作用组的 IL-2R检测图形和高峰值峰位明显向
高荧光强度方向迁移 ,表明 TS对活化淋巴细胞的
IL-2R的表达量有促进作用。
表 3　 TS对人 PBMC表达 IL-2R的影响
组　别 细胞平均吸光度 IL-2Ra
+
( Tac+ ) %
空白对照 0. 022± 0. 015 0
PHA 50μg /m L 0. 054± 0. 011△△ 33. 0
PHA+ TS 50μg /m L 0. 129± 0. 029* * △△ 43. 5
PHA+ TS 150μg /m L 0. 174± 0. 069* * △△ 54. 9
PHA+ TS 500μg /m L 0. 200± 0. 042* * △△ 60. 4
　　与空白对照组比较: △△ P < 0. 01
　　与 PHA组比较: * * P < 0. 01
2. 4　 T S对人 PBMC细胞内 cAMP水平的影响:
见表 4。经 PHA活化 48 h的 PBMC的 cAM P水平
与培养液对照组比较无明显差别 ,表明 PHA单独
作用不影响淋巴细胞内 cAM P的合成。培养体系中
加入 TS 50, 150, 500μg /mL,对其 cAMP水平呈剂
量依赖性的降低作用。培养体系中加入前列腺素 E1
( PGE1 ) ,细胞内 cAMP含量剧烈升高。 当 TS和
PGE1同时作用时 ,则 cAM P升高作用明显减弱 ,和
PHA+ PGE1组比较有极显著性差异 ( P < 0. 01)。
表 4　 TS对人 PBMC细胞内 cAMP
浓度的影响 (n= 5, x± s)
组　别　　　　　 cAMP ( pmol /106细胞 )
空白对照组 2. 62± 0. 77
PHA 2. 82± 1. 03
PHA+ TS 50μg /m L 2. 27± 0. 10*
PHA+ TS 150μg /m L 1. 60± 0. 15*
PHA+ TS 500μg /m L 0. 98± 0. 29* *
PHA+ PGE1 9. 72± 0. 78* *
PHA+ PGE1+ T S 50μg /m L 2. 75± 0. 22△△
PHA+ PGE1+ T S 150μg /m L 1. 87± 0. 03△△
PHA+ PGE1+ T S 500μg /m L 1. 63± 0. 10△△
　　与 PHA组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　与 PHA+ PGE1组比较: △△ P < 0. 01
3　讨论
IL-2是一种与免疫系统的各种功能密切相关
的细胞因子 ,主要是由 TH细胞在抗原或丝裂原刺激
下和 IL1诱导下分泌的 ,在免疫应答网络中起着中
心的调节作用 ,对机体免疫功能的发挥影响广泛。它
对 T 细胞、 B细胞和 NK细胞都有明显的刺激作
用 ,并可诱生 LAK细胞、干扰素等。 IL-2还可调节
IL-2R表达。而 IL-2是通过与靶细胞表达的 IL-2R
结合而发挥效应的。因此 IL-2及其受体系统是免疫
调节的重要环节。
本研究提示 TS对 PHA活化 PBMC的 IL-2
产生水平有明显促进作用 , TS对人活化淋巴细胞
的 IL-2R表达有促进作用。表明 TS可增加 Tac抗
原基因的活化 ,细胞膜表面活化分子 IL-2产生增
加 ,使细胞由 G1期进入 S期 ,促进 T细胞克隆性
增殖 , T细胞集落形成增加。提示 TS可以增强细胞
免疫功能 ,提高机体的基础免疫力。TS调节 IL-2水
平 ,增强 IL-2R的表达 ,可能是其免疫增强作用的
重要机制之一。
cAMP一直被认为是激素作用及调控细胞增
殖的第二信使 [6 ]。 cAM P增高可抑制包括淋巴细胞
在内的多种细胞增殖。前列腺素 ( PG)对免疫系统
有很强的作用。 PGE1通过特异受体作用于 PBMC,
使腺苷酸环化酶激活 ,导致 cAMP增加 ,从而抑制
IL-2产生等 [7 ]。 TS 50, 150, 500μg /m L可对抗
PGE1升高 cAM P的作用。
本研究表明 TS具有明显的免疫增强作用 ,其
机制与促进 IL-2的诱生及其受体的表达 ,降低细胞
内 cAMP水平有关。 TS可能通过降低细胞内
cAMP水平 ,引起 IL-2产生增多 ,同时增强 IL-2R
表达 ,产生一种自泌性和 /或旁泌性促生长态势 ,而
后者又成为 T细胞增殖的基础。
参考文献:
[1 ]　辛华雯 ,谢笔钧 ,曾繁典 . 聚酯型儿茶素对 HL-60细胞的诱导
分化作用及其机制研究 [ J] . 中国药理学通报 , 2000, 16 ( 4):
462-466.
[ 2]　匡彦德 ,张　骅 ,秦万章 ,等 . 雷公藤对 IL-2的产生和 IL-2受
体表达的抑制作用 [ J] . 上海免疫学杂志 , 1988, 8 ( 4): 250-
253.
[ 3]　胡国俊 ,白惠卿 ,杜守英 ,等 . 枸杞对 IL-2产生和 IL-2受体表
达的调节 [ J] . 中国免疫学杂志 , 1995, 11( 4): 253-256.
[ 4 ]　范勇毅 ,崔光辉 ,管远志 . 雷公藤单体 T4体外给药对 IL-2R
表达的影响 [ J] .中国免疫学杂志 , 1996, 12( 3): 171-173.
[ 5 ]　章　翰 ,李天宪 ,张昌菊 ,等 . 单个核细胞内 cAM P提取方法
的研究 [ J] .中国免疫学杂志 , 1988, 4: 42-43.
[6 ]　 Wang T, Sheppard J R, Foker J E. Ris e and fall of cyclic
AM P required for ons et of lymphocy te DNA synth esi s [ J].
Science, 1978, 201: 155-157.
[ 7]　 Goodwin J S, Bromb erg S, Mesner R P. Studies on the cyclic
AM P response to pros taglandin in human lym ph ocytes [ J].
Cell Immunol, 1981, 60: 298-303.
·434· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 5期