全 文 ：BrdU-EL ISA 法测定四逆汤及组方药提取物
对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响
刘　平1, 葛迎春1, 李晨燕1, 马天舒1, 任慧君1, 徐亚娟2, 徐东铭2Ξ
(11 大连市中医研究所 药理研究室, 辽宁 大连　116013; 21 吉林省中医中药研究院 植物化学研究室, 吉林 长春　130021)
摘　要: 目的　观察四逆汤 (SN T ) 及组方药提取物对大鼠主动脉血管平滑肌细胞 (V SM C) 增殖的影响。方法
采用M T T 比色法和 B rdU 2EL ISA 法观察药物对离体大鼠 V SM C 增殖的影响。结果　B rdU 2EL ISA 法结果表明
四逆汤总提取物 (EST ) 对 V SM C 的 B rdU 掺入 DNA 没有显著影响, 而M T T 测定表明 EST 可以提高 V SM C
的脱氢酶活性。甘草 (L E)、附子 (A E)、干姜 (GE)、甘草加附子 (LA E)、干姜加附子 (A GE) 提取物显著提高
V SM C 的脱氢酶活性, 同时提高V SM C 的B rdU 掺入DNA 的水平。结论　EST 可以增加V SM C 的脱氢酶活性,
但对 V SM C 的 B rdU 掺入 DNA 的水平无影响。而其他组方药提取物可以增加 V SM C 的脱氢酶活性, 同时提高
V SM C 的 B rdU 掺入 DNA 的水平。
关键词: 四逆汤; 血管平滑肌细胞; 细胞增殖; 5 溴22 脱氧尿苷 (B rdU )
中图分类号: R 28612　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 01 0054 04
Effect of extracts from Sin i Tang and its com ponen t drugs by BrdU-EL ISA
on prol ifera tion of ra t va scular sm ooth m uscle cell in vitro
L IU P ing1, GE Y ing2chun1, L I Chen2yan1, M A T ian2shu1,
R EN H u i2jun1, XU Ya2juan2, XU Dong2m ing2
(11D epartm ent of Pharm aco logy, Inst itu te of T radit ional Ch inese M edicine of D alian, D alian 116013, Ch ina;
2. D epartm ent of Phytochem istry, A cadem y of T radit ional Ch inese M edicine and
M atera M edica of J ilin P rovince, Changchun 130021, Ch ina)
Abstract: Object　To ob serve the effect of ex tracts from D ecoct ion fo r R esu scita t ion (Sin i T ang)
(EST ) and its componen t drugs on p ro lifera t ion of ra t vascu lar smoo th m u scle cells (V SM C). M ethods　
U sing m ethyl th iazo lyl tet razo lium assay (M T T assay) and b romodeoxyu rid ine (B rdU ) EL ISA , to invest i2
gate the effect of drugs on p ro lifera t ion of V SM C in v itro. Results　T he resu lts ind ica ted that EST in2
creased dehydrogenase act ivity (M T T assay) bu t had no effect on B rdU inco rpo ra t ion in DNA in V SM C.
P repared lico rice roo t ex tracts (L E) , acon ite roo t ex tracts (A E) , dried ginger ex tracts (GE) , ex tracts of
p repared lico rice roo t and acon ite roo t (LA E) , ex tracts of acon ite roo t and dried ginger (A GE) increased
dehydrogenase act ivity and B rdU inco rpo ra t ion in DNA in V SM C of ra t. Conclusion　EST increased dehy2
drogenase act ivity bu t had no effect on B rdU inco rpo ra t ion in DNA in V SM C. L E, A E, GE, LA E, A GE
increased dehydrogenase act ivity and B rdU inco rpo ra t ion in DNA in V SM C of ra ts.
Key words: D ecoct ion fo r R esu scita t ion (Sin i T ang, SN T ) ; vascu lar smoo th m u scle cells; cell p ro li2
fera t ion; b romodeoxyu rid ine (B rdU )
　　四逆汤 (SN T ) 出自《伤寒论》, 由附子、干姜、
甘草 3 味药组成, 功效为回阳救逆, 是用于治疗少
阴虚寒证的主方。现代药理学和化学研究已经对
SN T 的药理作用和物质基础有了较深入的认识, 研
究者从单味药有效成分的组合[1, 2 ]到 SN T 新的药
理作用等方面进行了大量的实验研究 [3, 4 ] , 有关
SN T 的作用机制和物质基础研究日益深入。本研究
以心血管药物作用机制研究方法, 建立相应实验模
型, 以酚妥拉明 (Phe) 和去甲肾上腺素 (NA ) 为对
照, 以血管平滑肌细胞 (V SM C) 的增殖为观察指
标, 研究比较 SN T、单味药及组合药提取物药理活
性的特点和差别, 探讨 SN T 配伍使用的作用机制。
1　材料
111　药品: SN T 及组方药提取物样品由吉林省中
·45· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2003205209
基金项目: 国家自然科学基金重点项目 (39930210)
作者简介: 刘　平 (1951—) , 男, 吉林省长春市人, 研究员, 硕士生导师, 主要从事中药有效成分的筛选及作用机制的研究, 发表学术论文
50 余篇。T el: (0411) 2671824　E2m ail: ddbc@m ail. d lp tt. ln. cn
医中药研究院提供。四逆汤总提取物 (EST , 94 g 生
药ög)、甘草提取物 (L E, 83 g 生药ög)、附子提取物
(A E, 358 g 生药ög)、干姜提取物 (GE, 373 g 生药ö
g)、甘草加附子提取物 (LA E, 271 g 生药ög)、干姜
加附子提取物 (A GE, 539 g 生药ög)。酚妥拉明
(Pheto lam ine, Phe) , 瑞士。去甲肾上腺素 (no ra2
drenaline, NA ) , 上海禾丰制药厂 (批号: 991001)。
112　动物: W istar 大鼠, 体重 100～ 120 g, 雌雄兼
用, 购于大连医科大学实验动物中心。
113　试剂: Eagle’s M EM 培养基 (Gibco , 美国) ;
胰蛋白酶 (Gibco , 美国) ; Ê 型胶原酶 (Sigm a, 美
国) ; 96 孔培养板 (Co star, 美国) ; B rdU 标记及检
测试剂盒 (Roche, 德国) ; 四甲基偶氮唑盐 (M T T ,
Sigm a, 美国) ; 胎牛血清 (中国医学科学院血液病
研究所, 批号 200004) ; 其余试剂均为国产分析纯。
114　仪器: 自动酶标光度计 (C lin iB io 128 C, EC) ;
CO 2培养箱 (SAN YO , M CO —175M , 日本)。
2　方法
211　V SM C 原代培养: 无菌条件下取大鼠胸主动
脉至腹主动脉一段, 在培养皿中撕弃外膜、剪开动脉
腔, H ank’s 液冲洗。置青瓶中, 经 0125% 胰蛋白酶
消化 30 m in, 吹打除去内皮细胞。用 H ank’s 液冲洗
3 次后, 剪成 1 mm 3组织块。加 011% 胶原酶, 37 ℃
水浴消化 120 m in, 吹打成细胞悬液。过 100～ 200
目尼龙纱网, 细胞悬液经离心 (1 000 röm in, 10
m in) 弃上清洗涤 3 遍。细胞计数后接种于 96 孔培
养板中, 置培养箱, 5%CO 2, 95% 空气, 饱和湿度,
37 ℃ 孵育。
212　半数效应量 (ED 50) 测定: 将制备的V SM C 悬
液接种在 96 孔培养板中, 每孔接种培养液 100 ΛL ,
含 2×104细胞。实验分对照组和实验组, 对照组加
入不含提取物的培养液 20 ΛL , 实验组加入含各提
取物的培养液 20 ΛL。使各提取物在培养液中的终
浓度分别为 66616, 33313, 16616, 8313, 4116,
2018 ΛgömL。置含 5% CO 2培养箱, 37 ℃ 孵育 24
h。终止培养前 4 h 加入M T T , 按下述方法测定各
孔吸光度 (A ) , 计算细胞增殖抑制率。以L ogit 法计
算各提取物对细胞增殖抑制的 ED 50及检验两两
ED 50值之间差异的显著性。
细胞增殖抑制率= (1- A 实验öA 对照)×100%
213　细胞增殖测定: 将制备的 V SM C 悬液接种在
96 孔培养板中, 每孔接种培养液 100 ΛL , 含 1×104
细胞。经 CO 2培养箱孵育 48 h, 观察细胞生长状态
良好, 加入不同剂量的药物。实验分对照组和实验
组, 对照组加入培养液 20 ΛL , 实验组加入含提取物
的培养液 20 ΛL。根据增殖抑制实验结果, 细胞增殖
测定的剂量为 25, 5, 1 ΛgömL。Phe 和NA 的剂量
为 100, 10, 1 ΛgömL。继续孵育 24 h 终止培养, 进
行M T T 测定和B rdU 2EL ISA 检测。
214　B rdU 2EL ISA 法检测: 每孔加入 B rdU 10 ΛL
标记细胞, 37 ℃ 孵育 2 h, 弃培养液。经 60 ℃ 干燥
1 h, F ixD enat 固定液室温固定 30 m in。弃固定液加
入 A n ti2B rdU 2POD 液室温放置 90 m in, 吸弃抗体
加洗涤工作液洗涤, 每孔 3 次。加底物溶液 100 ΛL ,
室温放置 30 m in。每孔加 25 ΛL 终止反应液 (1
mo löL H 2SO 4 ) , 5 m in 内自动酶标光度计测量, Κ
(测) = 450 nm , Κ(参) = 690 nm。
215　M T T 测定: 每孔加入 1 m gömL M T T 20 ΛL ,
孵育 4 h, 终止反应。吸弃每孔培养液, 加二甲基亚
砜 100 ΛL , 微量振荡器振荡 5 m in, 自动酶标光度计
测定各孔 A 值, Κ(测) = 550 nm , Κ(参) = 620 nm。
216　统计: 结果以 x ±s 表示, 组间进行 t 检验。
3　结果
311　细胞增殖抑制的 ED 50测定: 表 1 结果显示, 剂
量在 2018 ΛgömL 时, 除A E 组外, 其他各组的细胞
增殖均未受到抑制。表 2 结果显示各提取物的 ED 50
值, 除 EST 组与A E 组 ED 50值之间差异显著外, 其
他各组 ED 50值之间差异不显著。
312　V SM C 增殖的M T T 测定: 表3结果显示 ,
表 1　EST 及组方药提取物对 VSM C
增殖的影响 (x±s, n= 4)
Table 1　Effects of EST and extract from its componen t
drugs on VSM C prol iferation (x±s, n= 4)
提取物
剂　量ö(Λg·mL - 1) 抑制率ö% 提取物 剂　量ö(Λg·mL - 1) 抑制率ö%
EST 66616 90143±1162 A E 　66616 95149±1170
33313 65106±2184 33313 90139±1139
16616 35107±4127 16616 65109±3187
8313 13128±1120 8313 37136±3122
4114 3157±2199 4114 21197±7138
2018 0100±0100 2018 4152±0198
L E 66616 88129±0128 LA E 66616 88168±2193
33313 71164±1108 33313 70171±2176
16616 36107±1110 16616 37187±5135
8313 17115±5178 8313 24126±7154
4114 8179±7106 4114 10150±3159
2018 0100±0100 2018 0100±0100
GE 66616 95178±0154 A GE 66616 97134±0183
33313 90143±1152 33313 90138±1165
16616 71129±4193 16616 88168±1150
8313 33164±5186 8313 41132±5181
4114 9193±5183 4114 9147±4110
2018 0100±0100 2018 0100±0100
·55·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
表 2　EST 及组方药提取物对 VSM C 增殖抑制的 ED 50
Table 2　ED 50 of EST and extract from its componen t
drugs on inh ibition of VSM C prol iferation
提取物 ED 50ö(Λg·mL - 1) 提取物 ED 50ö(Λg·mL - 1)
EST 238144 A E 　　　1061453
L E 225124 LA E 217150
GE 160142 A GE 143169
　　与 EST 组比较: 3 P < 0105
　　3 P < 0105 vs EST group
M T T 法测定 NA 对 V SM C 的四唑盐还原反应是
刺激作用, 而 Phe 对 V SM C 的四唑盐还原反应影
响不明显。各提取物对V SM C 的四唑盐还原反应均
有刺激作用。而且, 随着药物剂量的降低, 刺激作用
下降。其中 EST ,AL E 的作用较强 (P < 01001)。
表 3　M TT 法测定 EST 及组方药提取物对
VSM C 增殖的影响 (x±s, n= 4)
Table 3　Effects of EST and extract from its
componen t drugs on prol iferation
of VSM C by M TT assay (x±s, n= 4)
组别
剂　量ö(Λg·mL - 1) A 550 nm 组别 剂　量ö(Λg·mL - 1) A 550 nm
对照 　　　- 01070±01012　　 GE 　　2510 01136±010073 3
NA 　　1010 01103±010023 510 01110±010073
110 01089±01002 110 01109±010053
Phe 1010 01088±01007 A E 2510 01130±010073 3
110 01086±01003 510 01109±010033
EST 2510 01148±010023 3 3 110 01105±010063
510 01105±010083 LA E 2510 01149±010063 3 3
110 01103±010053 510 01117±010083
L E 2510 01137±010123 3 110 01106±010043
510 01114±010023 A GE 2510 01128±010093
110 01105±010063 510 01114±010093
110 01096±01002
　　与对照组比较: 3 P < 0105　3 3 P < 0101　3 3 3 P < 01001
　　3 P < 0105　3 3 P < 0101　3 3 3 P < 01001 vs con tro l group
313　V SM C 增殖的B rdU 2EL ISA 测定: 表 4 结果显
示, NA 和 Phe 对V SM C 的B rdU 掺入DNA 均有
显著影响, 其中NA 影响最显著 (P < 01001)。EST
各剂量组对V SM C 的DNA 掺入均无显著影响。但单
味药及组合药提取物对V SM C 的DNA 掺入均有显
著影响, 且随着剂量的降低DNA 掺入增加。
4　讨论
　　5 溴22 脱氧尿苷 (B rdU ) 为脱氧胸苷的类似
物, 在细胞增殖过程中, 能够掺入到新合成的DNA
中。B rdU 2EL ISA 法测定结果可以反应细胞增殖时
DNA 掺入的水平。M T T 测定的原理是细胞中的线
粒 体 脱 氢 酶 将 四 唑 盐 还 原 成 不 溶 性 甲月替
(fo rm azen) 沉淀, 主要反应细胞能量代谢的水平。
细胞的增殖通常也伴随着细胞代谢的增强, 但是,
表 4　BrdU-EL ISA 法测定 EST 及组方药提取物对
VSM C 的 D NA 掺入的影响 (x±s, n= 4)
Table 4　Effects of EST and extract from its com -
ponen t drugs on incorporation in D NA
of VSM C by BrdU-EL ISA (x±s, n= 4)
组别
剂　量ö(Λg·mL - 1) A 450 nm　 组别 剂　量ö(Λg·mL - 1) A 450 nm
对照 　　 - 01348±01059　　 GE 　　2510 01240±01005
NA 　　10010 01327±01044 510 01362±01012
1010 11548±010283 3 3 110 01542±010393 3
Phe 10010 01411±01087 A E 2510 01345±01031
1010 01690±010563 3 510 01521±010663
EST 2510 01247±01022 110 01676±010743 3
510 01350±01032 LA E 2510 01486±010573
110 01391±01073 510 01618±010313 3
L E 2510 01425±01066 110 01748±010633 3
510 01488±010643 A GE 2510 01220±01021
110 01550±011093 510 01495±010383
110 01643±010063 3
　　与对照组比较: 3 P < 0105　3 3 P < 0101　3 3 3 P < 01001
　　3 P < 0105　3 3 P < 0101　3 3 3 P < 01001 vs con tro l group
DNA 的掺入水平增加和细胞的代谢增强是两个不
同的概念。多数情况下, 细胞增殖伴随DNA 合成增
加; 但某些特殊情况下, DNA 合成的增加有时是细
胞凋亡的先兆[5 ]。
　　NA 是肾上腺素能神经末梢释放的神经递质,
有强烈的收缩血管作用。NA 可以诱导磷脂酶D 的
活性和 V SM C 的增殖[6 ]。而且, NA 可以增加平滑
肌细胞的胞质内钙浓度[7 ] , 这也许是 NA 收缩血管
的作用机制之一。Phe 是一种 Α2肾上腺素受体阻滞
剂, 有扩血管功能。本实验M T T 测定结果表明,NA
有刺激 V SM C 四唑盐还原反应的作用, 而 Phe 的
影响则不明显。结果提示, 血管扩张药和血管收缩药
对V SM C 增殖作用不同。但B rdU 2EL ISA 测定的
结果表明,NA 和 Phe 对V SM C 的DNA 的掺入均
有刺激作用。提示细胞的代谢活性与DNA 合成并
非总是呈平行关系。
结果表明 SN T、单味药和组合药的提取物均有
促进 V SM C 代谢活性的作用, 其中 EST , LA E 的
作用较强。提示 SN T、单味药和组合药提取物可能
均有刺激平滑肌收缩的作用。但四逆汤的作用与受
体、细胞内钙浓度等影响平滑肌细胞收缩的因素有
何关系, 尚待探讨。SN T 对于血管的影响是多方面
的。在本实验中, SN T 增强了 V SM C 能量代谢, 可
能有刺激平滑肌收缩作用。然而, SN T 还可在低氧
条件下刺激血管内皮细胞释放前列环素 (PG I2) [8 ]。
而且, 对内毒素性休克大鼠血浆中血管紧张素Ê、肿
瘤坏死因子、内皮素、PG I2的含量均有显著影响 (待
·65· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
发表)。值得注意的是, 单味药和组合药提取物有刺
激 DNA 掺入的作用, 但 SN T 提取物却没有此作
用。提示组方后药物成分的化学性质可能发生了变
化, 这种变化尚需深入探讨。
本实验 B rdU 2EL ISA 法测定结果提示, SN T
并不提高V SM C 的DNA 掺入水平, 而单味药和组
合药提取物及 NA , Phe 均可以提高 V SM C 的
DNA 掺入水平。结果提示, SN T 组方后可能是通过
促进 V SM C 代谢活性, 起到刺激平滑肌收缩的作
用。而组方前的单味药和组合药刺激 V SM C 的
DNA 合成也许是一种副作用。同时, 对V SM C 增殖
抑制的 ED 50也反映了组方后 SN T 的毒性下降。本
实验进一步表明, SN T 组方用药与单味药及组合药
的药理作用不尽相同, 这可能是组方用药“减毒增
效”的作用机制之一。
References:
[ 1 ]　L i P, H uang Q F, L i A F, et a l. Effects of X inm ailing
(XM L ) on pu lmonary m icrovascu lar perm eab ility and lipo2
perox ides in endo toxem ia rats [J ]1 Ch in J P a thop hy siol (中
国病理生理杂志) , 1995, 11 (3) : 22622291
[ 2 ]　Sun H L , W u W K. Studies on p ro tective effect of S IN I
TAN G comp rising active componen ts com bined at differen t
do sage on m yocardial ischem ia reperfusion in ju ry in m ice [J ]1
Ch in T rad it H erb D rug s (中草药) , 2002, 33 (4) : 33323361
[ 3 ]　W u W K, Su J W , L in S G, et a l. C lin ical study on effect of
S IN I D ecoction on ischem iaöreperfusion in ju ry by Ho lter
monito ring in patien ts w ith acu te m yocardial infarction treat2
ed w ith th rom bo lytic therapy [J ]1 Ch in J In teg ra ted T rad it
Ch in W est M ed (中国中西医结合杂志) , 2001, 21 (10) : 7442
7461
[ 4 ]　T an H M , W u W K, L uo H C, et a l. Effect of Sin i D ecoc2
t ion on GST exp ression in the ischem ic m yocardium [J ]1
Ch in J P a thop hy siol (中国病理生理杂志) , 2002, 18 (4) :
41324141
[ 5 ]　Hong H S, Chen F R , Zhu Y B, et a l. A ssay of p ro liferation
and m etabo lic of vascu lar smoo th m uscle cells [J ]1 Ch in J
Cell B iol (细胞生物学杂志) , 2001, 23 (1) : 362391
[ 6 ]　Parm en tier J H , Sm elcer P, Pavicevic Z, et a l. PKC2zeta
m ediates no rep ineph rine2induced pho spho lipase D activation
and cell p ro liferation in V SM C [J ]1 H yp ertension, 2003, 41
(3 P t 2) : 79428001
[ 7 ]　Sato M , Kaw atan i M 1 Effects of no radrenaline on cyto so lic
concen trations of Ca2+ in cu ltu red co rpus caverno sum smoo th
m uscle cells of the rabb it [J ]1 N eu rosci L ett, 2002, 324 (2) :
892921
[ 8 ]　L iu P, Ge Y C, L i C Y, et a l. Effect of ex tracts from D ecoc2
t ion fo r Resuscitation and its componen t drugs on p ro stacy2
clin release from at vascu lar endo thelial cells under acu te hy2
pox ia [J ]1 Ch in T rad it H erb D rug s (中草药) , 2001, 32
(Supp l) : 12621281
不同产地冬虫夏草清除羟自由基作用的研究
蔡仲军, 陈仕江, 尹定华, 张　艳Ξ
(重庆市中药研究院, 重庆　400065)
摘　要: 目的　比较不同产地冬虫夏草对羟自由基的清除作用。方法　采用邻二氮菲2Fe2+ 氧化法检测不同产地冬
虫夏草水提液对 H 2O 2öFe2+ 体系产生的羟自由基的清除作用。结果　来自西藏那曲地区、云南滇西北地区和四川
川西北地区的冬虫夏草均对 Fenton 反应产生的羟自由基有显著或极显著的清除作用, 且来自不同微生态环境的
样品之间的清除作用差异比来自不同主产区样品之间的清除作用差异更明显。结论　冬虫夏草水提液有明显地清
除羟自由基的作用, 且微生态环境对该作用有较大的影响。
关键词: 冬虫夏草; 羟自由基; 微生态环境; 相互变异率
中图分类号: R 28515　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 01 0057 03
Scaveng ing effect of Cordycep s grow ing in d ifferen t env ironm en t on hydroxyl rad ica l
CA I Zhong2jun, CH EN Sh i2jiang, Y IN D ing2hua, ZHAN G Yan
(Chongqing Inst itu te of Ch inese M ateria M edica, Chongqing 400065, Ch ina)
Abstract: Object　To invest iga te and compare the scavenging effect of Cordy cep s grow ing in differen t
environm en t on hydroxyl rad ica l. M ethods　102Phennan th ro line2Fe2+ ox idat ive assay w as u sed to ob serve
the effect of scavenging hydroxyl rad ica l from H 2O 2öFe2+ system by the aquenou s ex tracts of Cordy cep s.
Results　Cordy cep s from N aqu of X izang, no rthw est Yunnan, and no rthw est Sichuan all show ed u s the
sign if ican t effect on scavenging of hydroxyl rad ica l p roduced from Fen ton R eact ion. T he b iggest values of
M DR among Cordy cep s specim en s from variou s m icroeco logica l environm en t su rpassed that among speci2
m en s of N aqu of X izang, no rthw est Yunnan, and no rthw est of Sichuan. Conclusion　T he aquenou s ex2
t racts of Cordy cep s cou ld scavenge the hydroxyl rad ica l from Fen ton R eact ion. T he m icroeco logica l envi2
·75·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2003205227
基金项目: 国家自然科学基金项目 (30240067)
作者简介: 蔡仲军 (1957—) , 男, 重庆市人, 硕士, 助理研究员, 从事中药研究及开发工作。