全 文 ：·药剂与工艺·
银杏叶中银杏萜内酯的 GC-MS定性定量分析
唐红芳 1 ,郑自强 2 ,朱晓雨 2 ,毛丽珍 1
( 1. 浙江省医学科学院 ,浙江 杭州　 310013; 2. 浙江出入境检验检疫局 ,浙江 杭州　 310012)
摘　要: 目的　建立银杏叶中银杏内酯 A, B, C和白果内酯的定性定量分析方法。方法　银杏叶以 20%乙醇超声提
取 ,乙酸乙酯萃取 ,再经酸性氧化铝 -活性炭 -硅藻土混合柱层析 ,在 100℃以双-三甲基硅烷三氟乙酰胺硅烷化 60
min后 ,用 HP-5 M S毛细管色谱柱 ,柱温从 180℃程序升温至 300℃。 采用选择离子监测 ( SIM )方式 ,以峰值最高
的碎片离子作为监视离子进行定量分析。 结果　银杏内酯 A, B, C和白果内酯的保留时间分别为 13. 7, 14. 3, 15. 3
和 6. 8 min,特征 (监视 )离子 (m /z )分别为 537, 625, 713及 455( 299) ;平均回收率分别为 102. 0% , 99. 4% , 96. 0%
和 96. 3% , RSD分别为 0. 54% , 2. 40% , 1. 98%和 2. 43%。结论　本方法操作简便、重现性好、专属性强、准确可靠 ,
可作为银杏萜内酯的定性定量分析方法。
关键词: 银杏叶 ;银杏萜内酯 ;银杏内酯 A, B, C;白果内酯 ;气相色谱 -质谱
中图分类号: R286. 02　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 03 0214 04
Quality and quantity analysis of terpene lactones fromGinkgo biloba leaves by GC-MS
TANG Hong-fang
1
, ZHEN G Zi-qiang
2
, ZHU Xiao-yu
2
, M AO Li-zhen
1
( 1. Zhejiang Academ y of Medical Science, Hang zhou 310013, China; 2. Zhejiang Entry-exit
Inspection and Qua rantine Bureau, Hang zhou 310012, China)
Abstract: Object　 To develop a capi llary GC-M S analy tical method fo r identi fication and deter-mina-
tion of g inkgolide A, B, C and bilobalide ( GA, GB, GC and BB) in Ginkgo biloba L. leaves. Methods
The leave samples w ere ex t racted in ul trasonic bath wi th ethanol-w ater ( 20∶ 80) . The ex t ract was puri-
fied by liquid-liquid ex traction with ethy l acetate fo llow ed by so lid-phase ex t raction on a column mixed
w ith acid Al2O3 , activ e carbon and celite. The terpenes w ere t rimethylsi lylated by BS TFA ( wi th 1% TM-
CS) fo r 60 min at 100℃ and determined by GC-M S w ith HP-5 M S capi llary column in the selected-ion
moni to ring mode. The intense f ragment ions were chosen as moni to ring ions for quanti ta tive analy sis.
Cholesterol w as used as an internal standard. Co lumn tempera ture g radient: initial temperature 180℃ ,
maintained 1 min, and then increased a t 20℃ /min to 260℃ , and finally a t 2℃ /min up to 300℃ , main-
tained 2 min. Results　 The retention times of GA, GB, GC and BB were 13. 7, 14. 3, 15. 3 and 6. 8 min,
the major f ragmenta tion ions ( moni to ring ) w ere at m /z 537, 625, 713 and 455 ( 299) , the average recover-
ies of GA, GB, GC and BB were 102. 0% , 99. 4% , 96. 0% , 96. 3% , RSD were 0. 54% , 2. 40% , 1. 98%
and 2. 43% , respectiv ely. Conclusion　 This method is repeatable, specific, accurate and easy to operate.
It is adoptable fo r quality and quantity analysis o f terpene lactones f rom G. biloba leaves.
Key words: the leaves of Ginkgo biloba L. ; terpene lactones; ginkgolide A, B, C; bilobalide; GC-M S
　　银杏叶为银杏科植物银杏 Ginkgo biloba L.的
干燥叶 ,其提取物及制剂是防治心脑血管系统疾病
的热点品种。 其所含萜内酯成分 (包括银杏内酯 A,
B, C和白果内酯 ,简称为 GA, GB, GC和 BB)对血
小板活化因子具显著的拮抗作用 ,是发挥药效的主
要活性成分 [1 ]。 萜内酯因无紫外吸收 ,故无法用
HPLC-UV法测定。 目前文献报道的测定方法有
HPLC-RI
[2 ] , GC-FID
[ 3] , GC-M S
[4 ]及 SFC-ELSD[ 5]
等。 但这些方法大多集中在银杏叶提取物及制剂的
测定上 ,其中 GC-M S法仅用于定性 ,定量回收率
低。而对萜内酯含量低、基体干扰大的银杏叶药材的
直接测定报道甚少 ,采用 GC-M S法测定未见报道。
本实验通过对样品预处理采用新的纯化方法 ,萜内
酯硅烷化及 GC-M S分析条件的优化试验 ,建立了
回收率高、重现性好、专属性强的银杏叶的定性定量
分析方法。
·214· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 3期 2003年 3月
收稿日期: 2002-06-27基金项目:浙江省中医药管理局青年科研基金 ( 1999年 )资助项目 ;浙江省分析测试基金资助项目 ( 00021)
1　仪器与材料
HP 6890 GC-5973 M SD色质联用仪 ; HP 7673
自动进样器 ; HP-5 M S石英熔融毛细管色谱柱
( 30 m× 0. 25 mm , 0. 25μm);玻璃色谱柱 ( 8 mm×
90 mm)。
GA, GC, BB由中国药品生物制品检定所提供 ;
GB、胆甾醇和双 -三甲基硅烷三氟乙酰胺 ( BS TFA,
含 1% TMCS)由 Sigma公司提供 ;酸性氧化铝 (层
析用 , 100～ 200目 ) ;活性炭 (化学纯 ) ;硅藻土 (上海
化学试剂公司 ,进口分装 )。乙酸乙酯、二甲基甲酰胺
( DM F)等试剂均为分析纯。
银杏叶 ( 1)采自浙江临安昌化 ( 1998年 10月 ) ,
银杏叶 ( 2)采自浙江杭州 ( 2000年 9月 )。 70℃烘干
3 h,粉碎后备用。
2　 GC-MS条件
　　载气:氦气 ( 1 mL /min) ;分流比: 25∶ 1;进样口
温度: 250℃ ;柱温: 初始温度 180℃ ,保持 1 min,以
20℃ /min速率升温至 260℃ ,再以 2℃ /min升温
至 300℃ ,保持 2 min;气质接口温度: 280℃ ;电离
方式: EI;电子能量: 70 eV;质量分析器: 四极杆 ;质
量扫描范围: 50～ 800 amu;定量方式: 选择离子监
测 ( SIM )。
3　方法与结果
3. 1　对照品溶液的制备: 取 GA, GB, GC及 BB对
照品适量 ( 5～ 10 mg ) ,精密称定后置 25 mL量瓶
中 ,加甲醇溶解 ,定容 ,制成银杏萜内酯的混合对照
品溶液。
3. 2　标准曲线的制备: 精密吸取混合对照品溶液
0. 025, 0. 05, 0. 1, 0. 2, 0. 3, 0. 4, 0. 5 mL置于 5 mL
离 心管中 ,各加胆甾醇内标溶液 0. 5 mL ( 100
μm /mL) ,在 60℃水浴 , N2气流下将样液吹干 ,用
0. 2 mL DM F溶解残渣 ,加 BS TFA 0. 2 mL,混匀 ,
密闭 ,于 100℃下硅烷化反应 60 min。取出 ,冷却至
室温后 ,用 DMF定容至 1. 0 mL,混匀。用自动进样
器进样 2μL,以各银杏萜内酯衍生物的特征离子质
量色谱峰面积与内标衍生物特征离子质量色谱峰面
积比对浓度回归 , GA, GB, GC和 BB的回归方程分
别为 Y 1= 0. 004 6X 1+ 0. 077 4, Y2= 0. 079 2X 2+
0. 047 7, Y3= 0. 090 8X 3+ 0. 020 5, Y4= 0. 089 4
X 4+ 0. 1; r 值分别 为 1. 000, 0. 999 8, 0. 999 7,
1. 000;线性范围分别为 21. 4～ 428, 10. 0～ 200,
15. 6～ 312, 10. 0～ 200 ng。
3. 3　样品的预处理: 取银杏叶粉末 2 g (准确至
0. 001 g ) ,置 100 mL具塞锥形瓶中 ,加 20%乙醇溶
液 20 mL,在 50℃～ 60℃热水浴中超声波处理 15
min后 ,再加水 20 mL,继续超声 5 min,冷却后移入
100 mL容量瓶中 ,加水定容 ,摇匀。将部分样液转入
50 mL离心管中 , 2 000 r /min离心 10 min。吸取 20
mL上清液于 125 mL分液漏斗中 ,加入 1 g氯化
钠 ,振摇溶解 ,然后用乙酸乙酯萃取 3次 ( 30, 20, 20
mL) ,合并乙酸乙酯相 ,在旋转蒸发器上蒸干。残渣
用少量甲醇溶解后 ,移入装有 2 g混合填料 (硅藻
土-酸性氧化铝-活性炭= 1∶ 0. 8∶ 0. 2)的色谱柱中
(已用 20 mL甲醇预淋洗 ) ,用 25 mL甲醇洗脱 ,控
制洗脱速度为 1 mL /min,收集全部洗脱液 ,蒸干 ,
稍冷 ,准确加入胆甾醇内标溶液 2 mL溶解残渣。取
0. 5 mL样液于 5 mL离心管中 ,按 3. 2项下方法进
行硅烷化反应。 冷却至室温后 ,用 DMF定容至 1. 0
mL,混匀。
3. 4　 GC-M S分析:将对照品和样品用自动进样器
进样 2μL,记录银杏萜内酯的混合对照品、银杏叶
样品的总离子流色谱图和质谱图 ,见图 1～ 3。 根据
各内酯衍生物的主要特征离子质量及质量色谱峰的
保留时间进行定性分析 ;将各内酯衍生物与内标衍
生物峰面积之比值代入各自对照品溶液的回归方
程 ,计算各个银杏萜内酯含量。
图 1　混合对照品中银杏萜内酯衍生物的总离子流色谱图
Fig. 1　 Total ion chromatogram of terpene lactone
derivat ives in mixed reference substances
3. 5　方法学考察
3. 5. 1　精密度测定: 取硅烷化后的混合对照品溶
液 ,连续自动进样 8次 ,计算各萜内酯衍生物与内标
峰面积比 , GA, GB, GC和 BB的 RSD 分别为
0. 79% , 1. 17% , 1. 49%和 0. 94% 。
3. 5. 2　稳定性试验:将硅烷化后的混合对照品溶液
·215·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 3期 2003年 3月
图 2　白果内酯 (A) ,银杏内酯 A(B) , B( C) ,C( D)衍生物的质谱图
Fig. 2　Mass spectrum of bilobalide (A) , ginkgolide A( B) , B(C) , C(D) der ivat ives
图 3　银杏叶样品中银杏萜内酯衍生物的总离子流色谱图
Fig. 3　 Total ion chromatogram of terpene lactone
derivatives in samples of G . biloba leaves
和样品溶液每隔 24 h测定一次 ,连续测定 4次 ,对
照品溶液中 GA, GB, GC和 BB各衍生物与内标峰
面积比值的 RSD 分别为 2. 5% , 1. 4% , 1. 7% ,
2. 5% ;样品溶液中相应的 RSD则分别为 2. 6% ,
0. 81% , 0. 66% , 4. 3% 。实验结果表明样品溶液与对
照品溶液在 4 d内仍然较稳定。文献报道 [4 ] ,经硅烷
化后的对照品溶液在 4 d内较为稳定 ,而样品溶液
只能放置 1 d。究其原因 ,可能是由于本实验所用样
品的净化程度较高 ,因而反应更为彻底 ,衍生化产物
稳定性好。
3. 5. 3　回收率测定:取银杏萜内酯的混合对照品溶
液适量 ,于 N 2气流下挥去甲醇 ,加入已测定含量的
银杏叶粉末样品 2 g ,平行 6份 ,按实验方法操作和
测定 ,结果 GA, GB, GC和 BB的平均回收率为
102% , 99. 4% , 96. 0%和 96. 3% ; RSD 分 别 为
0. 54% , 2. 40% , 1. 98%和 2. 43% 。
3. 5. 4　重现性考察: 同一银杏叶 ( 1)样品按实验方
法制备 6份测定 , GA, GB, GC和 BB含量测定结果
的 RSD分别为 4. 2% , 1. 7% , 3. 0%和 2. 0% 。
3. 6　样品分析结果: 取样品银杏叶 ( 1)和银杏叶
( 2) ,按上述选定的实验方法提取、纯化、测定 ,结果
银杏叶 ( 1) GA, GB, GC, BB的含量分别为 212. 1,
114. 7, 114. 5, 233. 3μg /g ( n= 6) ;银杏叶 ( 2) GA,
GB, GC, BB的含量分别为 485. 8, 161. 6, 110. 4和
212. 6μg /g (n= 2)。测定结果提示 ,各银杏萜内酯的
比例在不同地区所产银杏叶中有一定差异 ,在原料
选择和工艺制备中须引起重视。
4　讨论
4. 1　 GC-M S的定性定量方式的确定:银杏内酯 A,
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B, C含 3个内酯环 , 2个戊烷环 ,其差异主要是在 2
个戊烷环上羟基的数目和位置不同 ,其相对分子质
量分别为 408, 424, 440;白果内酯除 3个内酯环外 ,
只含 1个带羟基的戊烷环 ,相对分子质量为 326。戊
烷环上的活性 - OH被硅烷化试剂中 - O Si ( CH3 ) 3
所取代转变为易挥发的硅醚衍生物。 每取代一
个 - OH,相对分子质量就增加 72。由各个萜内酯衍
生物相应的质谱图可见 ,峰值最高的碎片离子
m /z 537, 625, 713和 455(次高 )正是 GA, GB, GC
和 BB的硅醚分子离子丢失一个 - CH3碎片即
[M- CH3 ]+ 所产生的特征离子 ,结合在总离子流色
谱图相应质谱峰的保留时间 ,从而进行定性分析。
　　为提高方法的选择性和灵敏度 ,本实验采用选
择离子监测 ( SIM )方式进行定量分析。 由于白果内
酯的 [M- CH3 ]+ 的 m /z 455碎片离子峰值较低 ,而
其另一特征离子 m /z 299具有更高的峰值。因此最
终选定 m /z 299,其余皆以 [M- CH3 ]+ 特征离子分
别作白果内酯、银杏内酯 A, B, C的监视定量离子。
　　曾试验了结构相似的几种甾体化合物 ,如孕二
醇、雌二醇、睾丸素、黄体酮、炔诺酮、胆甾醇等用作
内标。 结果表明胆甾醇的出峰保留时间 tR在 14. 01
min处 ,位于银杏内酯 A, B之间 ,并与之达到良好
的基线分离。因此选择胆甾醇为内标物质 ,其监视离
子 m /z为 458。
4. 2　硅烷化反应条件的优化: 试验了 N -甲基 -N -三
甲基硅烷三氟乙酰胺、双-三甲基硅烷三氟乙酰胺
( BS TFA,含 1% TMCS)、N ,O-对双 -三甲基硅烷乙
酰胺 ( BSA) 3种硅烷化试剂 , BST FA的衍生化效果
最好 ,生成的内酯衍生物最为稳定 ,更适于定量分析。
　　对应所测试的萜内酯浓度上限 , BSTFA用量
以 0. 1, 0. 2, 0. 3 mL进行了试验 ,结果 0. 2 mL
BSTFA可保证反应完全。另外还对硅烷化反应时
间在 30～ 120 min、反应温度在 60℃～ 120℃进行
了试验。结果表明 ,选择硅烷化反应时间为 60 min、
硅烷化温度为 100℃ ,各个萜内酯衍生物的峰面积
基本不变 ,说明反应已经完全。
4. 3　样品的预处理方法选择: 实验发现 ,单独用有
机溶剂提取效果较差 ;以 20%～ 40%乙醇水溶液及
50%丙酮水溶液抽提 ,所得样液中银杏萜内酯的含
量较高。本实验选用 20%乙醇水溶液 ,使脂溶性成
分较少提出 ,省略了脱脂步骤 ;提取液加水稀释后 ,
乙醇含量仅为 4% ,不需除去有机溶剂 [6 ] ,简化了实
验步骤。 另外比较了索氏抽提、热回流、热水超声及
高速均质 4种提取方法 ,实验表明后两种方法的提
取效率较高 ,但以超声波法提取的样液杂质较少 ,方
法简便 ,且提取完全 ,大于 98%。
　　为保证银杏萜内酯与硅烷化试剂彻底反应 ,必
须在硅烷化前除去提取液中存在的大量有机杂质 ,
如叶绿素、酚类、蛋白质、糖类及鞣质等 ,这也是色谱
分析的前提。文献 [6 ]要求在酸性条件下用乙酸乙酯
提取银杏萜内酯 ,但回收率仅在 30% ～ 60%。 文献
报道 [2 ]用聚酰胺柱串联 C18柱的方法处理样液 , 5%
甲醇洗脱部分仍有杂质干扰 ,且成本较高。另有报道
采用 Ex trelut柱 [7 ]和酸性氧化铝柱 [8 ]纯化 ,但仅适
用于高含量的银杏叶提取物及其制剂。 本实验采用
的纯化是直接在中性介质下 ,采用乙酸乙酯提取 ,然
后选用酸性氧化铝 -活性炭 -硅藻土的混合吸附剂 ,
通过调整三者的比例 ,取得了良好的效果 ,回收率
高 ,整个洗脱过程不到 30 min,较需过夜处理的聚
酰胺、硅胶双柱法 [ 9]更为简便、快速。
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保 　 护 　环 　 境 　保　护　植　被
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