全 文 ：柱前衍生 RP2HPLC法测定泽泻中氨基酸的含量
崔淑芬1 ,2 ,许柏球1 ,王小如2 ,3 Ξ
(11 深圳职业技术学院 生物应用工程系 ,广东 　深圳 　518055 ; 21 厦门大学化学化工学院 现代分析科学教育部重点实验
室 ,福建 厦门 　361005 ; 31 国家海洋局第一海洋研究所 青岛现代分析技术及中药标准化重点实验室 ,山东 青岛 　266061)
摘　要 :目的 　分析不同产地泽泻中氨基酸含量及其特征性。方法 　采用邻苯二甲醛 (OPA) 、氯甲酸芴甲酯
(FMOC)联合柱前衍生 RP2HPLC 测定泽泻中的 17 种氨基酸。结果 　氨基酸质量浓度与峰面积呈良好的线性关
系 , r 均在 0199 以上。不同产地泽泻中氨基酸含量有一定差别。结论 　该方法适宜泽泻药材中氨基酸含量的测
定。
关键词 :泽泻 ;氨基酸 ;反相高效液相色谱 ;柱前衍生
中图分类号 :R286102 　　　文献标识码 :B 　　　文章编号 :0253 2670 (2004) 08 0867 03
Determination of amino acids in Alisma orientale by pre2column derivatization of RP2HPLC
CU I Shu2fen1 ,2 , XU Bai2qiu1 , WAN G Xiao2ru2 ,3
(11 Department of Biological Applied Engineering , Shenzhen Polytechnic College , Shenzhen 518055 , China ;
21 The key Laboratory of Analytical Science , Ministry of Education , College of Chemistry and Chemical
Engineering , Xiamen University , Xiamen 361005 , China ; 31 Qingdao Key Laboratory of Analytical
Technology Development and Standardization of Chinese Medicines , First Institute
Oceanography of State Oceanic Administration , Qingdao 266061 , China)
Abstract : Object 　To determine the contents of amino acids and study the characters of A lism a orientale
(Sam1 J uzep1) f rom different habitats1 Methods 　The samples of A 1 orientale f rom three different areas were
derived with o2phthaldialdehyde (OPA) and 92fluorenylmethyl chloroformate ( FMOC) in pre2column , and sep2
arated by RP2HPLC1 Seventeen kinds of amino acids were determined1 Results 　The concentration of amino
acids and peak areas achieved a nice linear relations ( r is higher than 0199) 1 There were differences of the amino
acid in A 1 orientale f rom different habitats1 Conclusion 　This method is suitable for the determination of
amino acid in A 1 orientale1
Key words : A lism a orientale (Sam1) J uzep1 ; amino acid ; RP2HPLC ; pre2column derivatization
　　泽泻为泽泻科植物泽泻 A lism a orientale
(Sam1) J uzep1 的干燥块茎 ,为利水渗湿之要药。主
产福建、四川和江西等地 ,药材分别称为“建泽泻”、
“川泽泻”和“江泽泻”,以福建、四川产者最为著名 ,
其中又以建泽泻质量最佳 ,被载入中国道地药材的
南药。近年来 ,柱前衍生 RP2HPLC 法测定氨基酸
的技术取得了很大的进展并有逐渐取代传统氨基酸
分析仪的趋势。邻苯二甲醛 (OPA)衍生法具有衍生
步骤简单、反应速度快、剩余试剂不干扰测定的特
点 ,因此在柱前衍生试剂中应用最广泛 ,但此法不能
测定胱氨酸和脯氨酸的含量 [1 ] 。氯甲酸芴甲酯
( FMOC)能与胱氨酸和脯氨酸生成稳定的荧光衍生
物[2 ] 。本实验采用 OPA 和 FMOC 做衍生剂 ,优化
色谱分离条件 ,测定了泽泻中氨基酸含量 ,可为泽泻
的质量评价提供依据。
1 　仪器与材料
Agilent 1100 系列高效液相色谱仪 ,四元梯度
泵 ,在线真空脱气机 ,7725i 手动进样器 (20μL 定量
环) ,二极管阵列检测器 ;分析柱 : Hypersil ODS C18
柱 (200 mm ×416 mm ,5μm) ; HP —A109101 化学
工作站 ; Grant XB14 超声波清洗机 ;滤膜 (美国 Mil2
lipor Corporation ,孔径 0145μm) 。
天冬氨酸 (Asp) 、谷氨酸 ( Glu) 、丝氨酸 (Ser) 、组氨
酸 (His) 、甘氨酸 ( Gly) 、苏氨酸 ( Thr) 、丙氨酸 (Ala) 、精
氨酸 (Arg) 、酪氨酸 ( Tyr ) 、胱氨酸 (Cys) 、缬氨酸 (Val) 、
蛋氨酸 (Met) 、苯丙氨酸 (Phe) 、异亮氨酸 ( Ile) 、亮氨酸
(Leu) 、赖氨酸 (Lys) 、脯氨酸 ( Pro) 标准品和混合品、
OPA 衍生剂购于 Agilent 公司 ;正缬氨酸 (Norvaline ,内
·768·中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月
Ξ 收稿日期 :2004202218
基金项目 :国家自然科学基金 2003 重点项目 (20235020) ;福建省泽泻 GAP 研究项目 (2002 Y024)
作者简介 :崔淑芬 (1969 —) ,女 ,辽宁抚顺人 ,在职博士研究生 ,主要从事中药及海洋药物研究。Tel : (0755) 26731146
E2mail : shufencui @1631com
标) 、FMOC衍生剂为 Sigma 公司产品 ;甲醇、乙腈 (色
谱纯) ,其他试剂均为分析纯 ,超纯水。
　　泽泻采自福建建瓯 ,四川都江堰和江西广昌 ,由
本院张少艾副教授鉴定为泽泻 Alisma orientale
(Sam1) Juzep1 的干燥块茎。
2 　方法与结果
211 　供试品溶液的制备 :将泽泻生药低温烘干 ,粉
碎 ,过 60 目筛。称取 100 mg 置玻璃试管中 ,加 6
mol/ L 盐酸 10 mL ,抽真空立即封管 ,放入烘箱 ,在
110 ℃下水解 24 h ,冷却后打开水解管 ,转移至蒸发
皿中 ,水浴挥干盐酸 ,再用水洗数次 ,彻底挥干盐酸 ,
用 011 mol/ L 盐酸溶解 ,并定容至 25 mL ,0145μm 滤
膜滤过 ,滤液备用。精密量取滤液 10μL ,定量加入
10μL 正缬氨酸和 72μL 014 mol/ L 硼酸缓冲液 (pH
915) ,最后加入 5μL 邻苯二甲醛 (OPA) 、3μL 氯甲酸
芴甲酯 (FMOC)衍生剂 ,混匀 ,衍生 2 min ,即得。
212 　分析条件 :流动相 A :1 000 mL 20 mmol/ L 醋
酸钠 (p H 712) ,加入 180μL 三乙醇胺 ,加 3 mL 四
氢呋喃 ,超声混合 10 min ;流动相 B :20 mmol/ L 醋
酸钠 (p H 712)2乙腈2甲醇 ( 1∶2∶2) ,超声处理 10
min。流动相程序洗脱条件见表 1。柱温 :40 ℃;检
测波长 :338 nm ,带宽 10 nm ;参比波长 :399 nm ,带
宽 20 nm ;20 min 后检测波长 :262 nm ,带宽 16 nm ;
参比波长 :324 nm ,带宽 8 nm。进样量 20μL 。以保
留时间定性 ,内标法定量。
表 1 　流动相梯度洗脱程序
Table 1 　Gradient elution of flow phase
时间/ min 流动相 A/ % 流动相 B/ % 体积流量/ (mL·min - 1)
0 10010 　010 0145
17100 4010 6010 0145
18110 　010 10010 0145
18150 　010 10010 0180
23190 　010 10010 0180
24100 　010 10010 0145
25100 10010 　010 0145
213 　工作曲线的绘制 :将 17 种混合氨基酸标准品
(浓度为 1 nmol/μL) 用 011 mol/ L 盐酸依次稀释成
01500、01250、01100、01025 nmol/μL , 备 用。取
5816 mg 正缬氨酸溶于 50 mL 011 mol/ L HCl 溶液
中 ,配成 10 nmol/μL 储备液 ,于 0～4 ℃冰箱保存 ,
使用时用 011 mol/ L HCl 稀释至 1 nmol/μL 。取上
述氨基酸混合标准品溶液各 10μL ,分别加入等体
积的 1 nmol/μL 正缬氨酸 ( Nval) 内标溶液 ,进行
HPLC 分析。以各氨基酸与内标物的色谱峰峰面积
之比为纵坐标 ,氨基酸浓度为横坐标作图 ,得各氨基
酸的工作曲线 ,其线性回归方程见表 2。18 种氨基
酸混合标准溶液和泽泻样品中氨基酸的液相色谱图
见图 1。可见 ,在选定的条件下 ,氨基酸混合标准品
得到了较理想的分离 ,样品中的氨基酸也得到了很
好的分离。
表 2 　17 种氨基酸的回归分析结果
Table 2 　Regression analysis of 17 kinds of amino acids
氨基酸 线性方程 r
Asp Y = 01905 4 X - 01005 959 01999 8
Glu Y = 11013 0 X - 01001 492 01999 9
Ser Y = 11020 4 X - 01002 801 01999 9
His Y = 01789 0 X - 01007 129 01999 4
Gly Y = 11029 9 X - 01008 143 01999 6
Thr Y = 01995 2 X - 01005 748 01999 9
Ala Y = 11033 2 X - 01005 887 01999 9
Arg Y = 11031 3 X - 01005 784 01999 8
Tyr Y = 01958 3 X - 01004 321 01999 9
Cys Y = 01860 1 X - 01007 983 01999 5
Val Y = 11026 4 X - 01003 728 01999 9
Met Y = 11044 8 X - 01004 881 01999 9
Phe Y = 01954 3 X - 01005 262 01999 8
Ile Y = 01734 7 X - 01001 974 01999 4
Lys Y = 11251 5 X - 01017 340 01999 2
Leu Y = 01572 8 X - 01001 067 01999 9
Pro Y = 01709 8 X - 01009 903 01998 1
12Asp 　22Glu 　32Ser 　42His 　52Gly 　62Thr 　72Ala
82Arg 　92Tyr 　102Cys 　112Val 　122Met 　132Nval
142Phe 　152Ile 　162Lys 　172Leu 　182Pro
图 1 　氨基酸混合标准溶液( A)和福建产
泽泻样品( B)的 HPLC图谱
Fig1 1 　HPLC chromatograms of amino acids mixed　
standard solution ( A) and A1 orientale samples
collected from Fujian Province ( B)
214 　精密度试验 :用氨基酸混合标准溶液做 5 次平
行试验 ,结果 Pro 和 Lys 的偏差较大 , RSD 分别为
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7182 %、5190 % ,这可能与其衍生化反应程度或衍生
物的稳定性有关。其他氨基酸 RSD 均在 1 %～
5 %。
215 　回收率试验 :采用单点和多点加入法将各氨基
酸标准溶液定量加入样品溶液中 ,进行试验 ,结果各
种氨基酸的回收率为 9512 %～11412 %。
216 　样品分析 :对福建、四川和江西 3 个泽泻主产
区的泽泻样品中氨基酸含量进行分析 ,结果见表 3。
可见 ,3 个产地的泽泻中都含有大量的氨基酸 ,总量
在 17124 %～18186 % ,含量较高的是天冬氨酸、谷
氨酸、精氨酸和亮氨酸 , 质量分数在 1140 %～
2130 %。不同产地泽泻中氨基酸含量与分布都有一
定差异 ,天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、
苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和脯氨酸 9 种氨基酸及总氨
基酸含量由高到低的顺序皆为 :建泽泻、川泽泻和江
泽泻。但江泽泻中的精氨酸和胱氨酸的含量比建泽
泻和川泽泻高。其余氨基酸含量相差不大。
表 3 　不同产地泽泻中氨基酸测定结果
Table 3 　Amino acids in A1 orientale collected
from different habitats
氨基酸
质量分数/ %
江西 四川 福建
Asp 11639 7 11866 8 21296 0
Glu 11402 8 11640 2 11965 2
Ser 01672 5 01787 3 01888 5
His 01372 7 01334 6 01411 7
Gly 01692 7 01834 2 01949 4
Thr 01819 4 01830 9 11053 4
Ala 01707 8 01761 6 01800 6
Arg 21175 5 11902 0 11933 6
Tyr 11074 5 11143 7 11011 6
Cys 11089 0 01690 7 01732 8
Val 11158 4 11322 8 11316 6
Met 01425 2 01374 5 01372 3
Phe 11447 0 11254 6 11354 4
Ile 01592 9 01725 4 01617 9
Lys 01559 1 01591 3 01690 7
Leu 11680 4 11830 3 11638 9
Pro 01730 5 01639 8 01829 7
3 　讨论
311 　氨基酸分析在医药、食品和动植物代谢产品检
测等方面应用非常广泛 ,国外早已开展了氨基酸高
效液相色谱检测方法的研究工作[3 ,4 ] ,国内也进行
了这方面的探索[5 ,6 ] 。本实验采用 OPA 与 FMOC
联合柱前衍生 ,衍生化反应 2 min 内完成 ,带伯、仲
氨基的氨基酸同时得到测定 ,是一种理想的全谱氨
基酸分析方法。18 种氨基酸在 22 min 内峰完全 ,
分析时间短。良好的梯度洗脱使各个氨基酸峰得较
好分离 ,定量结果比较可靠。
312 　p H 值对本法的分析结果有重要影响 ,流动相
的最佳 p H 值为 712 ±01025。p H 值小于 711 ,氨基
酸出峰不完全 ;p H 值大于 713 ,色谱峰出峰时间提
前 ,尤其 10～16 min 出峰的氨基酸提前明显 ,影响
色谱分离度。OPA 衍生化反应的 p H 值要大于
815 ,而 FMOC 衍生化反应的 p H 值必须大于 915。
采用 6 mol/ L 盐酸水解样品后 ,残留的酸必须挥发
干净 ,否则会严重影响氨基酸的测定 ,多数氨基酸不
出峰。
313 　在方法的建立过程中 ,几个主要环节需要特别
注意 :样品水解时 ,一定要水解充分 (110 ℃水解 24
h) ,否则就会造成不出峰的现象。样品衍生时应严
格控制衍生的时间 ,保证衍生时间足够 ;另外温度不
可过低 ,否则将造成衍生不完全。本法流动相中含
有无机盐 ,应控制柱温 (40 ℃较佳) ,柱温不可过低 ,
过低将易导致流动相中出现结晶 ,堵塞色谱柱 ,产生
柱压过高等现象。
　　致谢 :样品收集得到厦门大学2开元区高新技术
研究开发基地王文慎经理的帮助 ;深圳职业技术学
院 2002 级制药专业陈颖珠、林丽琼参加了本研究的
实验工作。
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