全 文 ：冬虫夏草及人工菌丝体的核苷类成分的 HPLC研究
米莉莉 ,王智华 ,洪筱坤
(上海中医药大学药学院 ,上海 200032)
冬虫夏草 Cordyceps sinensis ( Berk ) Sacc. 为麦
角科虫草属的药用真菌 ,为冬虫夏草菌的子座及其
寄主蝙蝠蛾科虫草蝙蝠蛾 Hepialus armoricanus
Oberthus等幼虫尸体的复合体 ,具有广泛的药理作
用。核苷类成分为虫草有效成分之一 ,具有扩张心脏
和外周血管的药效作用 ,其中尤以腺苷的作用为显
著 [1～ 3 ]。 《中华人民共和国药典》 2000年版对冬虫夏
草中腺苷规定 ,不得少于 0. 010%。目前核苷类分析
方法有 HPLC法 [4～ 6 ]、薄层色谱法 [ 7, 8]、高效毛细管
电泳法 [9～ 11 ]等。高效液相色谱法主要针对单个指标
进行评估 ,如以腺苷为指标作含量测定 [5～ 7 ]。而本研
究探讨 HPLC法对冬虫夏草一次进样在同一色谱
条件下使核苷类成分得到理想分离的定性、定量分
析方法。
1 材料与仪器
1. 1 材料: 腺苷、尿苷、鸟苷对照品 ( Sigma公司 ) ;乙腈
( Fisher Scientific HPLC)实验所用样品来源见表 1。
1. 2 仪器: 2695型高效液相色谱仪 ( Wa ters公
司 ) , Wa ter 2996 PDA检测器 ; Sa rto rius十万分之
一分析天平。
2 实验部分
2. 1 色谱条件:色谱柱: YMC-Polyamine柱 ( 5μm,
250 mm× 4. 6 mm) ;流动相: 乙腈 ( A) -水 ( B) ,梯度
洗脱: 0→ 10 min, 90% A-10% B; 10→ 20 min, 85%
A-15% B; 20→ 30 min, 80% A-20% B; 30→ 40 min,
70% -60% B; 40 min以后 60% A-40% B;流速: 1. 0
m L /min;柱温: 28℃ ;检测波长: 261. 8 nm。
2. 2 对照品贮备液的制备:精密称取腺苷 ( adeno-
sine) 25. 29 mg,尿苷 ( uridine) 51. 17 mg ,分别置于
25 m L的容量瓶 ,用 70%乙醇溶解并定容至刻度作
贮备液 ,精密称取鸟苷 ( g uanosine) 10. 10 mg ,置于
20 m L的容量瓶 ,用 70%乙醇溶解并定容至刻度作
贮备液。
2. 3 供试品溶液制备:精密称取样品粉末 0. 1 g,置
于 1 0mL具塞试管 ,加 70% 乙醇 5mL ,超声提取
表 1 天然虫草与人工菌丝体 (粉 )样品
Table 1 Natural Cordyceps and cultural mycelium
类型 编号 样品
人工菌丝
体 (粉 )
1
2
3
4
5
6
7
8
江西国药菌粉
上海菌粉
浙江万丰菌粉
台湾得荣菌粉
台湾金颖菌粉
台湾生展菌粉
山东菌粉
长白山蛹虫草菌丝
天然虫草 9
10
11
12
13
14
青海玉树虫草
西藏昌都虫草
四川甘孜县虫草
新疆阿尔泰山虫草
四川凉山虫草
西藏虫草类似品
( 15 min× 2) , 4 000 r /min离心 10 min,取上清液移
入 5 mL容量瓶 ,用 70%乙醇定容至刻度 ,摇匀即得。
2. 4 标准曲线的制备:分别精密吸取腺苷、尿苷、鸟
苷对照品贮备液适量 ,置于 5 m L的容量瓶配成混
合对照品溶液 ,精密吸取混合对照品溶液适量分别
用 70%乙醇稀释成一系列浓度的溶液 ,每次进样 20
μL,测定腺苷、尿苷、鸟苷的峰面积 ,以进样量 ( X )对
色谱峰面积 (Y )绘制标准曲线 ,得回归方程。 腺苷:
Y= - 313. 605 2+ 2 876. 71X , r= 0. 999 9,线性范
围为 47. 197～ 606. 96 ng;尿苷: Y= 6 221. 204+
2 233. 597X , r = 0. 999 9,线性范围为 127. 327～
1 637. 44;鸟苷: Y= 1 080. 271+ 2 074. 785X , r=
0. 999 9,线性范围为 47. 12～ 606 ng。
2. 5 精密度试验: 取混合对照品溶液连续进样 5
次 ,每次 10μL,按色谱条件测定 ,色谱峰面积 ,结果
腺苷、尿苷、鸟苷的 RSD分别为 1. 23% , 0. 56% ,
0. 95%。
2. 6 重现性试验:取 9号样品 ,分别精密称取 5份 ,
每份 0. 1 g ,按供试品溶液制备方法制备供试液 ,按
色谱条件进行测定 ,结果腺苷、尿苷、鸟苷的 RSD
分别为 1. 01% , 0. 58% , 1. 48%。
2. 7 回收率的测定:分别精密称取已知含量的虫草
·573·中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 第 34卷第 6期 2003年 6月
收稿日期: 2002-12-20作者简介:米莉莉 ( 1971- ) ,女 ,广西人 ,讲师 ,现在上海中医药大学攻读药学博士学位 ,研究方向为中草药质量标准控制。
Tel: ( 021) 54231358
样品 (江西国药菌粉 ,批号为 0202026)共 5份样品 ,
每份约 0. 05 g ,精密加入已知量的对照品溶液适量 ,
按供试品溶液制备项下测定 ,并计算出腺苷、尿苷、
鸟苷的平均回收率分别为 99. 44% , 98. 22% ,
95. 67% , RSD分别为 0. 34% , 2. 44% , 0. 94%。
2. 8 样品测定:样品 (除菌粉外 )粉碎后过 50目筛 ,
30℃真空干燥 6 h,按供试品溶液制备方法制备样
品供试液 ,溶液过 0. 45μm微孔滤膜 ,取续滤液进
样 ,采用标准曲线法计算样品中腺苷、尿苷、鸟苷的
含量。 天然虫草和人工虫草中核苷类成分色谱图见
图 1,含量测定结果见表 2。
1-腺苷 2-尿苷 3-鸟苷
1-adnosine 2-uridin e 3-guanosine
图 1 混合对照品 (A)和天然虫草 (B, 10号
样品 )的 HPLC色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of mixted standard
substance (A) and natural Cordyceps
(No. 10, B)
表 2 虫草样品中核苷类成分的含量测定结果 (n= 3)
Table 2 Contents of nucleosides in Cordyceps ( n= 3)
样品 腺苷
/ ( mg· g- 1)
尿苷
/ ( mg· g- 1)
鸟苷
/ ( mg· g- 1)
总和
/ ( mg· g- 1)
1 3. 38 3. 80 3. 09 10. 27
2 1. 61 2. 31 1. 04 4. 96
3 3. 04 2. 75 2. 29 8. 08
4 2. 44 3. 13 1. 76 7. 33
5 1. 08 0. 14 - 1. 22
6 0. 72 0. 51 0. 24 1. 47
7 0. 87 0. 60 0. 33 1. 80
8 0. 67 0. 45 - 1. 12
9 0. 20 0. 58 0. 09 0. 87
10 0. 31 0. 56 0. 09 0. 96
11 0. 30 0. 42 0. 08 0. 80
12 0. 07 0. 07 - 0. 14
13 0. 27 0. 26 0. 08 0. 61
14 - 0. 37 0. 02 0. 39
3 讨论
3. 1 人工菌丝体中所测得的核苷类成分含量明显高于
天然虫草 ,其中鸟苷的含量更是远远高于天然虫草。
3. 2 以核苷类成分总和计算结果可知 ,人工菌丝体
中以 1号江西国药菌粉核苷类成分含量最高、其次
为 3号浙江万丰菌粉、 4号台湾得荣菌粉 ;天然虫草
以 10号西藏昌都虫草核苷类成分含量最高、其次为
9号青海玉树虫草、 11号四川甘孜虫草。
3. 3 本研究采用梯度洗脱技术将核苷类成分一次
进样即在给定的色谱条件下获得理想分离 ,并将其
定量分析。实验结果表明 ,该法操作简便 ,灵敏度高、
重现性。
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