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Determination of relative molecular weight in polysaccharjde-2b of moutan(PSM2b

丹皮多糖2b主要成分的相对分子质量的测定



全 文 :中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36眷第10期2005年10月
丹皮多糖2b主要成分的相对分子质量的测定
刘长安,赵帜平,沈业寿4,戴玲
安徽大学生命科学学院糖复合物与糖工程实验室,安徽台肥230039)
摘要:目的测定丹皮多糖2b(PSMn)主要成分的相对分子质量,为建立对照品的标准提供依据。方法PSM“
经Sepharose413枉分离,冷冻干燥后得到丹皮多糖的两个成分PSM¨,n和PSM:u小采用HpLC法检泓均一性和相
对分子质量;并分别以0.7“Na:SO,溶液和超纯水作为流动相进行比较。结果PSMtn一为均一性的糖蛋白,是
PSMn的主要成分。流动相为0.7%Na。SO,溶液时,其相对分子质量为3.5962×105,分散度指数(D)为4.15。流
动相为超纯水时,其相对分f质量为4.758×105,分散度指数为1.03。结论采用HI’I。C法测定丹皮多糖主要成
分的相对分子质量时.不同流动相测定的结果有差异.流动相采用超纯水比07%Na:SO。溶液更为适台。
关键词:丹皮多糖2b;高效液相色谱I相对分子质量
中国分类号:R284.11R286.02 文献标识码:A 文章鳙号:0253—2670t2005)10—147703
Determinationofrelativemolecularweightinpolysaccharjde一2bofmoutan(PSM2b)
I.1UChangan,ZHA()Zhi—ping,SHENYe—shou.DAILing
(Laboratoryof(;IycoconJugatesandGlycutechno【ogy.School()fLife ience.AnhuiUniversity,Hefei230039,China)
Abstract:ObjectiveTodeterminetherelativemolecularweight(M,)ofpolysaceharide一2bofmoutan
(PSM2¨)toes ablishthetandardof eferencesubstance.MethodsPSM2bwaseparatedbyaSepharose
4BcolumnandthenPSM?h。^andPSM2bDwereobtainedaftercryodesicca“on.ThenHPI,Cwasusedto
determinetheirM,.Ultrapurewat rwasusedasmobilephasetocomparewith0.7%Na2S04solution.
ResultsPSM¨.^V,rO.Spure.TheMandpolydispersity(D)ofPSM¨.^obtainedbyuseofdextranas
standardwere3.5962×10
5
and4.15i110.7%NatSO^solutionphase,respectively,andinultrapurewater
phasetheM,andDwere4.7585×105and1.03,respectively+ConelusionDIffcrentsultsaredetected
bydifferentmobilephasesindeterminationofMrandDofPSM曲AbyHPI,C.Andtheultrapurewateras
mobilephaseismoresuitablethan0.7%Na2SO。solution.
Keywords:polysaccharideofmoutan(PSM扑);HPJ,C;relativemo]ecularweight(尬)
丹皮为芍药科牡丹PaeomasuJfruticosaAndr.
的干燥根皮,具有清热凉血、活血祛瘀的功效。常见
于降糖复方中。以丹皮为原料制取的丹皮多糖2b
(polysaccharides2bofmoutan,PSM¨)系降血糖
活性有效部位,具有明显降低葡萄糖和四氧嘧啶诱
发的鼠高血糖,降低糖化血红蛋白,升高SOD和载
脂蛋白A。水平,改善氢化可的松琥珀酸钠诱导的
胰岛素抵抗。可降低Ⅱ型糖尿病大鼠空腹血糖,改善
葡萄糖耐量异常及衄脂异常,提高肝细胞膜低亲和
力,胰岛素受体最大结合容量及胰岛素敏感性指数
等作用“。]。本研究对PSMn进一步的分离并测定其
主要成分的相对分子质量M,及其分布.为开发降
血糖药物,建立其对照晶标准提供依据。
1仪器和试药
Uhrospec3100紫外一可见光扫描仪,瑞典
Pharmac[aBiotech;Alphal2冷冻干燥机,德国
Christ;Waters高效液相色谱系统:515HPI。C
Pump,410 RefractivelndexDeteetor,
UitrahydraGel“500柱(300ntm×7,85mm),
Millennium”software(版本3.05.01);Milli—Qplus
超纯水仪,美国Millipore;标准葡聚糖DextranT
系列为Pharmaeia产品:T一500(皿4500 0)、T一100
(M11000)、T70(M。68000)、T一40(M,44
000)、T一10(尬儿000);Sepharose4B,瑞典
pharmacia产品;PSMⅢ安徽大学生命科学学院糖
复合物与糖工程实验室提供;其他试剂均为国产分
收稿日期:2001119
基金颐目,国家自然科学基金资助项日(30840066);安徽省“十五”重大科技专项綦盒资助项目(0180301I)l安徽省自然科学基金资助
项It(0304330t)
作者简介:刘长安(198{1一).男,安徽六爱人.硼土研究生,主要从事多糖类的生物化学、分子生物学研究匣天然药物开发。
E—mail;jiuca8009@yahoo.COITI“n
*通讯作者沈业寿Tel;(0551)5107574E—mail:shysh@ahuedu,cn
万方数据
·1478· 中草药ChineseTrgditionalandHerbalDrugs第36卷第lo期2005年10月
析纯。
2方法和结果
2.1 PSM。。的分离纯化及其主要成分的制备:将
PSMn用蒸馏水配制成20rag/ml,溶液。取1mI。上
Sepharose4B柱(96cm×2cm)。水洗脱,体积流量
为12mI。/h。苯酚一硫酸显色,在490nm波长下比色
检测洗脱液。合并各洗脱峰液,冷冻干燥得两种成
分,分别命名为PSM。¨和PSMm。洗脱曲线见图
1。可见,PSM。b经Sepharose4B柱分离后有两个洗
脱峰,分别冷冻干燥后其平均得率:PSMmn为
29.13%,PSM2bB为13.78%。



0 50 100 】50 200 250 300
洗脱作@{/mL
暖l PSM:b经过Sepharose4B柱分离的洗脱曲线
Fig.1ElutioncurveofPSMnseparated
bySepharose4Bcolumn
2.2色谱条件及相对分子质量标准曲线的制作:采
用HPLC法,先用标准葡聚糖DextranT系列标准
品制作相对分子质量标准曲线,然后根据样品在相
同色谱条件下的保留时间(k),从标准曲线上求出
样品的相对分子质量。
色谱条件:流动相分别为0.7%NazSOt溶液01
和超纯水。以0.7%Na:SO。溶液为流动相时体积流
量为1.0mL/mln,以超纯水为流动相时体积流量
为0.6mL/min。柱温为(30±0.1)C,进样量为
lo“I,。示差折光检测。
将5个标准葡聚糖用流动相溶解配成5rag/
mI,溶液并用0.22”m漶膜滤过。分别取10pL注
入液相色谱仪,记录色谱图和保留时间h。以tn为
横坐标,lgM。为纵坐标作图。得到相对分子质量标
准曲线图和回归方程。各标准葡聚糖在两种流动相
中的保留时间(“)见表1。以0.7%NazSO。溶液为
流动相得回归方程为lgM,=tO.1235—0.6985tn,
r=0.9989}以超纯水为流动相得回归方程lgMr;
7.6007—0.2258tR.r一0.9965。表明在本实验的
两种流动相条件下,标准葡聚糖相对分子质量在1×
104~5×10t时,其保留时间与其相对分子质量对数
均呈良好线性关系。
寰l各标准葡聚精的HPLC保留时间
TableHPLCretentionmeofstandarddextran
2.3 PSMm.和PSM。¨的均一性及相对分子质量
测定:称取6个批号的PSM2bn和PSM2b.u适量,分别
用两种流动相溶解,配成lmg/mI。的溶液。取lo
pL注入液相色谱仪,记录色谱图和保留时间。重均
分子量(Mw)和数均分子量(肘。),分散度指数(D)由
GPC软件按下式计算:
腻:∑(RI。×M)/∑RI,
MP∑RI./∑(RI./M)
D—Mr/M,
孟中RI,为保留时间I的峰高;肘.为保留时闻I的相对
分于质量.可由标准曲线查得。
PSM。bIA和PSM。n,,在两种流动相中的HPI。c分
析结果见图2和图3。PSM。一6次上样的平均保留
时间在水作流动相为7.229min.在0.7%Na:SOt
作流动相为8.604min。PSMnm6次上样的平均保
留时间在水作流动相为9.403min,在0.7%
Na:SO。作流动相为16.391min。测得的M,、%、
^t。。(峰尖相对分子质量)及D值见表2。
2 4 6 8 Iu 12 14 2 4 6 8 10 12 14
,/mIll
圈2超纯水(A)和0.7%NajSO。(B)为流
动相的PSM2k^的HPLC阳请
Fig.2HPLCehromatogramsofPSMn.^elutedhy
ultrapurewater(A)and0.7NNa2S04(B)
3讨论
PSMm.经两种不同流动相洗脱,都呈单一对称
峰型。可认为其为均一性成分。PSMzb、B以0.7%
Na:SO。溶液作流动相时,呈一峰型,而以超纯水作




万方数据
中草药ChineseTraditions[andHerbalDrugs第36卷第10期2005年10月·1479·
圈3超纯水(A)和0,7%Na3S04(B)为流
动相的PSMmB的HPLC圈谱
Fig.3HPLCehromatogramotPSM;b.Belutedby
ultrapurewater(A)and0.7%Na2SO‘(B)
寰2 PSM:¨和PSM:n·的相对分子质量、数均分子质量
峰尖相对分子质量及分散度指数
Table2 M,,帆,肘㈣andDofPSM2h^andPSM2kB
流动相时,并不是单一峰型,故PSMmn的均一性尚
不能确定。从分离纯化的得率看,PSMmn约为
PSM¨n的2.1倍,故将PSMzbA看作是PSM2b的主
要成分。
HPLC法测定PSMn.n的相对分子质量时,在不
同流动相中的色谱图有所差别。PSMzb,A在水相中的
峰型对称且峰型较窄,分散度指数接近1。但以
0.7%Na。SO;溶液作流动相时,峰型虽较对称,但
谱峰较宽,分散度指数较大。同时,在测定PSM。be
时,在超纯水作流动相时,能分出杂质峰,而以
O.7蛎Na。SO。溶液作为流动相时不能分离出杂质
峰。从实验结果来看,采用超纯水作为流动相比用稀
盐溶液更适合。
PSM。。。为含蛋白质的酸性多糖口]。有报道认
为,酸性多糖在稀浓度的盐溶液中其构象相对紧密,
在水溶液中相对舒展n],故通常采用稀盐溶液作流
动相来测定其相对分子质量。同时国家药典口3中测
定右旋糖酐时采用0.7%Na。SO。溶液作为流动相。
但是本实验发现与此不同。推测PSM¨在水溶液
中可能呈现一种有规则的空问结构,而在稀盐溶液
中,由于离子的作用,干扰了次级键的形成,使其构
象相对舒展.分散度增加。此外.我们还用相同离子
强度的PBS、NaCI、PBS+NaCI溶液作为流动相进
行了测定,结果和以0.7%Na。SO。溶液作流动相时
相近。由于多糖的结构和构象的差异,采用HPl。C
测定其均一性和相对分子质量时,流动相的选择应
有不同。
PSMmn的相对分子质量测定时,以超纯水作为
流动相比用0.7%Na:SO。溶液作流动相测得的
M,、M。及M。。“要大。可能是由于所采用的标准品是
中性多糖的原因。有研究表明,以中性多糖(如
dextran)和酸性多糖(如肝素)5t-别作为标准品测得
同一酸性多糖相对分子质量,前者比后者大得多”]。
有关选用不同对照品测定丹皮多糖2b主要成
分PSMn“相对分子质量及其降血糖生理活性等研
究工作正在进行中。
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万方数据
丹皮多糖2b主要成分的相对分子质量的测定
作者: 刘长安, 赵帜平, 沈业寿, 戴玲, LIU Chang-an, ZHAO Zhi-ping, SHEN Ye-shou,
DAI Ling
作者单位: 安徽大学生命科学学院,糖复合物与糖工程实验室,安徽,合肥,230039
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2005,36(10)
被引用次数: 1次

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本文链接:http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200510015.aspx