全 文 ：(33∶66∶1)。
References:
[ 1 ]　Yan Y H 1 Simp le separation m ethod of gen ipo side in Gard em ia
jasm inoid es E llis [J ]1 Ch in J P harm A na l (药物分析杂志) ,
1998, 4 (4) : 22722291
[ 2 ]　W ang B Q 1 Q uality S tand ard and S tand ard S ubstance of Ch i2 nese T rad itiona l P a ten tM ed icine (中成药质量标准与标准物质研究 ) [M ]1 Beijing: Ch ina M edico2Pharm aceu tical Scienceand T echno logy Pub lish ing House, 19861[ 3 ]　Ch P (中国药典) [S ]1 V o l É 1 20001[ 4 ]　Chen F K1 D eterm ina tion of A ctive Constituen ts in Comm onCh inese H erba l M ed icine (常用中草药有效成分含量测定)[M ]1 Beijing: Peop les M edical Pub lish ing House, 19971
HPLC 法定量分析熊胆中胆酸类化合物
朱丽玢1, 洪筱坤2Ξ
(11 军事医学科学院毒物药物研究所, 北京　100850; 21 上海中医药大学 化学教研室, 上海　201203)
　　国外常采用离子抑制色谱法[1, 2 ]和离子对色谱
法[3, 4 ]分别测定结合型胆酸和游离型胆酸来实现胆
酸类化合物的分离, 该方法无法一次性测定含胆酸
类物质中胆酸类化合物的种类和含量。在洗脱方式
上, 因为胆酸类化合物的UV 检测波长很低 (205
nm ) , 而洗脱剂又是在该波长下有一定吸收的乙腈、
甲醇等溶剂, 因而均采用等梯度洗脱, 这样就无法一
次性分离极性相差较大的结合型和游离型胆汁酸。
本实验建立了分离胆酸类化合物的双泵双比例反相
离子抑制高效液相色谱法, 效果良好。
1　仪器与材料
P—E series 200 pump , 235C 二极管阵列检测
器, 1022 p lu s 工作站。
　　乙腈 (H PL C 级) , 水为市售 Spak lin 纯蒸馏水,
其他试剂均为分析纯。胆酸 (CA )、脱氧胆酸
(DCA )、脱氢胆酸 (DHCA )、牛磺胆酸 (TCA )、牛磺
去氧胆酸 (TDCA )、鹅去氧胆酸 (CDCA )、牛磺鹅去
氧胆酸 (TCDCA )、牛磺熊去氧胆酸 (TUDCA ) 对照
品为 Sigm a 产品; 熊去氧胆酸 (UDCA ) 由上海医科
大学提供。
　　熊胆样品由国家中药制药工程技术研究中心提
供, 经叶愈青教授鉴定为熊科动物黑熊 S elena retos
th ibetanus Cuvier 的胆囊。
2　方法与结果
211　对照品溶液的配制: 精确称取CA、DCA、UD 2
CA、CDCA、DHCA、TCA、TDCA、TUDCA、TCD 2
CA 对照品适量, 用甲醇溶解, 配成浓度分别为 2
m gömL 的单个对照品溶液。再精确称取上述对照
品适量, 用甲醇溶解, 配成各组份浓度均为 2 m gö
mL 的混合对照品溶液。
212　供试品溶液的制备: 将熊胆风干后研成粉末
(密度约为 1 göcm 3) , 精确称取约 100 m g, 加 25 倍
体积的甲醇, 混合后超声 15 m in, 2 500 röm in 离心
10 m in, 吸取上清液置 10 mL 量瓶中, 重复 3 次, 补
充甲醇溶液至刻度, 进样前用 415 Λm 滤膜滤过, 取
续滤液, 即得。
213　流动相 pH 值的选择: 实验考察了在 pH
215～ 610 时混合对照品溶液的分离情况。结果表
明: 流动相的 pH 值对各组份的保留时间及分离度
的影响是至关重要的。随着流动相pH 值的降低, 分
离效率也越来越好。考虑到柱的承受能力, 本实验选
择流动相的 pH 值为 3。
214　缓冲溶液浓度的选择: 本实验考察了磷酸盐浓
度为 2～ 50 mmo löL 时混合对照品溶液的分离情
况。缓冲溶液浓度的增加提高了各组份的 K 值, 这
是由于流动相的离子强度增加的缘故。但各组份的
分离度并无明显改进, 为了避免不必要的麻烦 (柱的
堵塞) , 选用缓冲溶液的浓度为 5 mmo löL。
215　流动相组成比例对分离的影响: 首先考察了等
梯度分离时的情况。在乙腈含量为 60% 时, TDCA、
DHCA、CA、DCA、UDCA、CDCA 6 种组份得到分
离, 而 TCA、TUDCA、TCDCA 则混在一起出峰。当
乙腈含量为 25% 时, 先洗脱出柱的成分虽然可以分
开但极性小的成分由于保留时间过长而引起的区带
扩散导致峰形过宽, 甚至未见洗出。而试图采用梯度
洗脱时, 基线漂移严重。因而, 考虑采用分级洗脱方
式, 首先用低乙腈含量的洗脱剂分离极性大的组份,
再在适当的时候换上高乙腈含量的洗脱剂以使极性
·5521·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 11 期 2004 年 11 月
Ξ 收稿日期: 20042012253 通讯作者
小的成分在保证分离度的情况下得以尽快洗出。实
验采用最佳洗脱条件为先用 35% 乙腈洗脱 40 m in
后, 再换成 73% 乙腈洗脱 40 m in。
216　色谱条件: 分析柱为 Phenom enex L una C18 (2)
(250 mm ×416 mm , 5 Λm ) , 保护柱为C 18 (40 mm ×
416 mm , 10 Λm ) (中国科学院上海药物研究所) , 流
动相为乙腈22 mmo löL 磷酸缓冲溶液 (37∶63, 洗
脱, 40 m in; 73∶27, 再洗脱 40 m in) , 体积流量为 1
mL öm in, 检测波长为 205 nm , 柱温为室温。
217　线性关系的考察: 精确吸取混合对照品溶液
2、5、10、15 和 20 ΛL 进样, 按照色谱条件测定各组
份峰面积值。以峰面积 Y 为纵坐标, 进样量 X 为横
坐标, 计算回归方程, 结果见表 1。
表 1　各组份的线性方程 (n= 5)
Table 1　L inear equation of ingred ien ts (n= 5)
　组份 方程
线性范围öΛg 相关系数 r
CA Y = 41583 5×105 X + 91880 6×103 1179～ 1719 01997 6
DCA Y = 91837 6×105 X + 41559 0×104 2128～ 2218 01998 3
DHCA Y = 61244 4×106 X + 21786 5×105 0153～ 513 01994 9
UDCA Y = 41683 3×105 X - 31907 6×105 4113～ 4113 01998 4
CDCA Y = 11327 0×106 X - 61089 4×105 2137～ 2317 01993 9
TCA Y = 31476 4×105 X + 41883 2×103 2125～ 2215 01998 9
TDCA Y = 21173 9×106 X - 81795 4×104 2115～ 2115 01999 1
TUDCA Y = 11389 8×105 X - 91852 9×103 0127～ 217 01998 8
TCDCA Y = 11289 2×105 X + 21967 5×104 2106～ 2016 01998 5
218　稳定性试验: 取混合对照品溶液每隔 30 m in
分析一次, 共测 5 次, 测得各组份的峰保留时间和峰
面积, 结果的R SD 见表 2。
表 2　精密度试验结果 (n= 5)
Table 2　Results of prec is ion test (n= 5)
组　份
RSD ö%
保留时间 峰面积
　CA 214 316
　DCA 219 419
　DHCA 119 113
　UDCA 118 219
　CDCA 316 112
　TCA 116 111
　TDCA 212 218
　TUDCA 019 213
　TCDCA 218 216
219　回收率试验: 采用加样回收法。精确称取样品
B 43 m g, 分别精确加入各对照品 2 m g, 一式 5 份,
按照供试品溶液制备方法处理, 最后定容至 2 mL ,
在选定的色谱条件下, 每份平行进样 3 次, 进样量
20 ΛL , 结果见表 3。
2110　熊胆样品的分析: 对每个样品供试液平行测
定 3 次, 结果见表 4。
表 3　回收率试验结果 (n= 5)
Table 3　Results of recovery test (n= 5)
　 　组　份 平均回收率ö% RSD ö%
　 CA 93146 1131
　 DCA 90138 3166
　 DHCA 103169 2189
　 UDCA 98168 2193
　 CDCA 105102 1106
　 TCA 95115 3128
　 TDCA 92118 2108
　 TUDCA 99186 0188
　 TCDCA 104169 3115
表 4　熊胆中各组份的测定结果 (n= 3)
Table 4　Results of bile ac id ingred ien ts in F el U rs i (n= 3)
样
品
来源
含　量ö%
CA DCA DHCA UDCA CDCA TCA TDCA TUDCA TCDCA
A 四川阿坝 21990 01093 - - 11284 - 21140 301030 29180
B 四川阿坝 21315 11171 - - 11001 21690 41030 421860 9104
C 四川阿坝 31616 11348 - 21137 11423 - 11930 321160 25142
D 四川阿坝 (吊胆) 41126 11374 - 11925 11748 - - 361830 33163
E 四川阿坝 (偏胆) 41329 21065 - - 21877 01820 01845 521060 8148
F 云南 21518 21956 - - 11672 01690 11410 621890 7166
3　讨论
311　TUDCA 是熊胆的特征成分, 但在 6 个熊胆样
品中含量差异较大, 其中样品 F 中含量最大。引流
熊胆所含胆汁酸成分及其含量在各地熊胆中无明显
差异。从外观上比较颜色深的熊胆所含胆汁酸成分
比较复杂, 如样品D、E 及引流熊胆A。其结合型胆
汁酸的含量较颜色浅的B、C、F 样品少而非结合型
胆汁酸含量则较高。文献报道中品质最优的云胆 F
样品中 TUDCA 的含量最高, 而其他类型胆汁酸的
含量均很少。因此, 仅就胆汁酸组份而言, 质优的熊
胆即意味着所含胆汁酸组份单一 TUDCA 量高。
312　目前尚无便于广泛推广应用的分离分析熊胆
中胆汁酸的方法。气相色谱法不能直接分析结合型
胆汁酸, 必须将结合型胆汁酸预先用碱液水解成游
离胆汁酸, 衍生化后再进行气相色谱分析[8 ] , 因而比
较繁琐; 薄层色谱多数采用硅胶薄层, 方法简便, 但
分离效率低, 无法区分 TUDCA 与 TCDCA 等[4 ]; 液
相色谱法在分析中将胆汁酸的羧基酯化, 同时引入
具有紫外吸收的基团, 需要衍生, 只适用于游离型胆
汁酸与甘氨酸结合型胆汁酸的分离, 不适用于分离
牛磺酸型胆汁酸, 还存在反应液中的副产物无法去
除, 石胆酸的归属很难确定等缺点[1, 3, 5 ] , 利用固定
相化酶作检测器的液相色谱法须将 3Α羟基甾体氧
化酶作成固相化酶引入到液相色谱系统中去, 制作
难度高, 不利于推广[6 ]。张启明等采用H PL C 法直
接测定结合型胆汁酸的含量, 方法简便易行。但只能
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测定熊胆中结合型的胆汁酸[7 ]。
313　本法首次在常规条件下一次性分离 9 种结合
及游离型胆汁酸, 仅基线在改变洗脱溶剂比例时会
抬高, 但总的来说并不影响其定量的可靠性。
References:
[ 1 ]　M uraca M , Ghoo s Y1 Glyco27Α2dihydroxy25Β2cho lan ic acid as
in ternal standard fo r h igh2p ressu re liqu id ch rom atograph ic
analysis of con jugated b ile acids [J ]1 J L ip id R es, 1985, 26:
1009210111
[ 2 ]　Ghoo s Y, Rutgeerts P, V an trappen G1 T auro27Α, 12Α2dihy2
droxy25Β2cho lan ic acid as in ternal standard in the gas2liqu id
ch rom atograph ic analysis of b ile acid m ethyl ester acetates
[J ]1 J L ip id R es, 1983, 24: 1376213791
[ 3 ]　Zeng W G, T ian S J , T u G S1 A nalysis of b ile acids by H PL C [J ]1 Ch in J P harm A na l (药物分析杂志) , 1989, 9 (5) : 2841[ 4 ]　Hofm ann A 1 T h in2layer adso rp tion ch rom atography of freeand con jugated b ile acids on silic acid [J ]1 J L ip id R es, 1962,3: 12721281[ 5 ]　N akayam a F, N akagak i M 1 Q uantit ive determ ination of b ileacids in b ile w ith reverse2phase h igh2perfo rm ance liqu id ch ro2m atography [J ]1 J Ch rom a tog r, 1980, 183: 28722911[ 6 ]　Reid A D , Baker P R 1 H igh perfo rm ance liqu id ch rom atogra2phy of b ile acids w ith a reversed2phase radial comp ressioncloum n [J ]1 J Ch rom a tog r, 1982, 247: 14921561[ 7 ]　Zhang Q M , Yuan H N 1 D eterm ination of con jugated b ileacids in F el U rsi by H PL C [J ]1 Ch in J P harm A na l (药物分析杂志) , 1993, 13 (5) : 32123231[ 8 ]　Patrick P H , E llio tt W H 1 A nalysis of b ile acids seero ls byh igh2perfo rm ance liqu id ch rom atography w ith a m icrobo re co l2um n [J ]1 J Ch rom a tog r, 1985, 347: 15521621
RP-HPLC 法测定芪参胶囊中丹参酮Ê A 的含量
李　钦1, 2, 韩　光1, 2, 许启太1, 贾天柱2, 程铁峰1Ξ
(11 河南大学药学院, 河南 开封　475001; 21 辽宁中医学院, 辽宁 沈阳　110032)
　　芪参胶囊主要由黄芪、丹参、人参、茯苓、三七、
玄参、水蛭等组成, 具有益气活血、化瘀止痛功效, 用
于冠心病稳定型心绞痛证属气虚血瘀者。丹参为主
要君药, 主要成分为丹参酮Ê A、隐丹参酮、丹参素、
原儿茶醛等, 其中丹参酮Ê A 为主要活性成分。丹参
酮Ê A 的测定方法有高效液相色谱法[1～ 3 ]、超临界流
体萃取联用毛细管气相色谱法[4 ]等。芪参胶囊原质
量标准中采用薄层扫描法测定丹参酮Ê A 的含量。
为了提高其标准, 本实验采用H PL C 法测定丹参酮Ê A 的含量, 结果符合有关规定, 可用于该制剂的质
量控制。
1　仪器与试药
日本岛津L C—10A 液相色谱仪, CR—3A 记录
仪, SPD—10AV 检测器, S IL —10A 自动进样器。
丹参酮Ê A 对照品 (中国药品生物制品检定所,
批号: 076629909, 供含量测定用) , 甲醇、乙腈为色谱
纯, 水为重蒸馏水。芪参胶囊由新谊医药集团生产,
规 格: 015 gö粒, 批 号: 20031012、 20031015、
20031018)。
2　方法与结果
211　色谱条件: 色谱柱: Sh im pack CL C2OD S (150
mm ×610 mm ) ; 柱温: 40 ℃; 流动相: 甲醇2乙腈2水
(35∶40∶25) ; 体积流量: 110 mL öm in; 检测波长: 270 nm。在上述色谱条件下, 丹参酮Ê A 峰的保留时间约为 1816 m in, 与共存的其他成分分离良好, 以丹参酮Ê A 峰计算色谱柱的理论板数为6 263。212　对照品溶液制备: 精密称取丹参酮Ê A 对照品适量, 加甲醇溶解, 制成每 4 ΛgömL 的溶液, 置棕色量瓶中备用。213　供试品溶液制备: 取本品装量差异项下内容物, 研细, 精密称取 3 g, 置具塞锥形瓶中, 精密加入甲醇 25 mL , 称重, 超声处理 (功率 250 W , 频率 33kH z) 20 m in, 取出, 放冷, 称重, 补足减失的质量, 摇匀, 滤过, 取续滤液经 0145 Λm 微孔滤膜滤过, 溶液置棕色瓶中备用。214　空白试验: 按处方比例及工艺自制不含丹参的阴性样品, 按供试品溶液的制备方法处理, 进样。结果处方中其他药材和辅料不干扰测定, 见图 1。215　线性关系的考察: 精密称取丹参酮Ê A 对照品10150 m g, 置 100 mL 量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀。精密吸取 1 mL 置 25 mL 量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 制成 01004 2 ΛgömL 的溶液。分别精密吸取 3、5、7、9、11 ΛL 溶液进样, 测定色谱峰面积。以进样量为横坐标, 色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线, 回归得回归方程: Y = 1 022 773181X - 8 525115, r= 01999 9。结果表明丹参酮Ê A 在
·7521·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 11 期 2004 年 11 月
Ξ 收稿日期: 2004203227
作者简介: 李　钦 (1965—) , 男, 河南中牟人, 博士研究生, 副教授, 研究方向为中药质量标准及炮制工艺。
T el: (0378) 5956970　E2m ail: liqin@henu1edu1cn