全 文 ：从 340～ 520 nm扫描 ,其最大吸收峰位于 415 nm ,
与文献报道相同 [2 ]。
4. 5　标准曲线的制备: 精密吸取对照液 0, 2. 0,
3. 0, 4. 0, 5. 0, 6. 0 mL分别置分液漏斗中 ,各加氯仿
至 20 mL,再加入 10 mL pH( 6. 0± 0. 1)溴甲酚绿溶
液充分振摇 ,静置 1 h ,氯仿层滤于 25 m L量瓶中 ,
并加氯仿至刻度 ,于 415 nm处以不加对照品管为
空白 ,测定吸光度 ,求得回归方程 Y= 1. 178 3X -
0. 044 2, r = 0. 998 7,乌头碱含量在 0. 164 8～
0. 494 4 mg其吸光度与乌头碱的量呈良好的线性
关系。
4. 6　回收率试验:精密量取双乌止痛酊约 2. 5 mL,
加入乌头碱对照品约 1. 2 mg ,精密称定 ,按供试品
溶液的制备及含量测定方法测定 ,结果平均回收率
为 97. 19% , RSD= 1. 3% (n= 3)。
4. 7　样品总生物碱含量测定: 精密量取对照液、供
试品溶液与阴性对照品液各 20 mL,分别置分液漏
斗 , 4. 5项下“各加……”依法操作 ,以阴性对照为空
白 ,测定吸光度 ,结果见表 1。
表 1　双乌止痛酊中乌头碱的含量测定 (n= 5)
批　号 乌头碱 ( mg /m L) R SD (% )
1 0. 295 3. 12
2 0. 267 2. 45
3 0. 272 1. 67
5　讨论
5. 1　本品中含有制川乌、制草乌 ,其生药含量为
20% ,按每次用量 2～ 3 m L计 ,一日用量约 10 mL,
相当生药 2 g ,与该药的内服剂量相当 ( 1. 5～ 3 g )。
生川乌、生草乌中的毒性成分是乌头碱 ,人口服
的中毒剂量 3～ 5 mg ,生药中含量分别为 0. 425% 、
0. 599% ,但经炮炙后 ,水解成苯甲酰乌头原碱和乌
头原碱 ,其毒性大大下降 ,前者仅为乌头碱的 1 /50～
1 /200,后者仅为 1 /2 000,因此 ,炮炙后的制川乌、制
草乌已不属毒性中药 ,但由于其药材来源不同 ,炮炙
的程度不同 ,而使乌头碱含量不同 ,为保证用药安
全 ,本品对乌头碱作限量检查 ,其最高限量若以对照
品 10μL作标准 ,仅为人口服中毒剂量的 1 /20。 并
且本品仅作为外用制剂 ,应比较安全。
5. 2　本品以乌头碱作出了对照品进行总生物碱的
含量测定 ,因处方中除含有制川乌、制草乌外 ,还含
有延胡索和川芎 ,经分析 ,川草乌中的生物碱占
63% ,延胡索中的生物碱占 36% ,川芎仅含 0. 33% ,
故总碱以乌头碱作对照 ,用酸性染料比色法测定是
可供质量控制参考。
参考文献:
[1 ]　 WS3-B-0046-89,中成药方制剂 [S ]. 第 1册 .
[2 ]　陈其华 . 中成药中乌头总碱的酸性染料比色测定法 [ J ]. 中国
中药杂志 , 1991, 16( 8): 476-477.
冬虫夏草多糖提取工艺的优化
余晓斌1 ,罗长才1 ,缪　静 2
( 1. 江南大学生物工程学院 教育部工业微生物重点实验室 ,江苏 无锡　 214036; 2. 烟台师范学院 生物技术科学与技术系 ,
山东 烟台　 264025)
　　自从日本学者千原进行多糖研究以来 ,从一些
真菌中提取生物活性物质 ,尤其是真菌多糖成了人
们的研究热点 [1 ]。据药理学及临床研究表明 ,冬虫夏
草多糖可以增强免疫力、抗肿瘤及降血糖等 [2～ 4 ]。随
着人们保健意识的增强 ,对于虫草多糖的研究及开
发也日益升温 ,但由于天然冬虫夏草资源的稀少 ,为
解决严重的供需矛盾 ,人们采用液体深层培养法来
生产虫草菌丝体 ,以替代天然冬虫夏草 [5 ]。在虫草多
糖的生产过程中 ,涉及到虫草多糖的提取问题 ,为使
虫草多糖提取的质和量达到最佳化 ,本实验采用常
用的乙醇沉析法从乙醇添加量、 pH值及时间 3个因
素对虫草多糖的提取进行了优化 ,利用 SAS分析软
件得出了回归方程 ,并进行了响应面分析 ,从而得出
了虫草多糖的最佳提取工艺。
1　材料与方法
1. 1　实验材料:冬虫夏草菌 Cordyceps sinensis供试
菌种 CS2(自编号 ) ,通过大量筛选获得。 取自 CS2
在 25 L罐培养后的发酵液 ,然后将此发酵液进行减
·1086· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 12期
收稿日期: 2001-12-20作者简介:余晓斌 ( 1965-) ,男 ,安徽芜湖人 ,副教授 ,硕士生导师 , 1985年毕业于南京大学化学系 , 1994年在无锡轻工大学获博士学位 , 1998年在韩国仁荷大学完成博士后研究 ,目前主持省级课题 1项、国家 “十五”攻关课题 1项 ,发表论文 30多篇 , 2篇被 SCI收录。 Tel:
( 0510) 5876272　 E-mail: x byu@ mai l. s ytu. edu. cn
压浓缩至原体积的 1 /5,用 Severg法脱蛋白 [6 ] ,离
心 ,取上清液备用。
1. 2　实验设计:通过调节乙醇添加量、 pH值及时
间 3个因素 ,根据 Box-Benhnken的中心组合设计
原理 ,设计了 3因素 3水平的响应面分析实验 [7 ] ,共
有 15个实验点 ,其中 12个为析因点 , 3个为零点 ,
以估计误差。 实验因素与水平的选取见表 1。
表 1　因素与水平的取值表
水平 因　　素
X1乙醇 /浓缩液 ( V /V ) X2沉淀时间 ( h) X 3 pH值
+ 1 5 15 8
0 3 10 6
- 1 1 5 4
1. 3　实验方法: 多糖测定: 采用干重法 ,将乙醇沉淀
下来的虫草多糖过滤并烘干至恒重称量。 响应面分
析: 实验重复 3次 ,所得的多糖量采用平均值 ,用
SAS-RSREG( Response surface reg ression)程序进
行分析。
2　结果与讨论
2. 1　回归方程的建立及分析: 响应面分析 ( Re-
sponse surface analysis)能以最经济的方式 (如用很
少的实验次数和时间 )对实验进行全面、科学的研究 ,
并取得明确的、有目的的结论。根据表 1对实验因素
与水平的设计 ,采用不同的乙醇添加量、 pH值及沉析
时间 ,进行了 15次实验 ,各因素安排及结果见表 2。
表 2　响应面分析实验结果
编　号 X1 X 2 X3 沉析多糖量 ( g /L)
　　 1 　　 - 1 　　 - 1 　　 0 　　　 2. 4
2 - 1 0 - 1 1. 2
3 - 1 0 + 1 2. 8
4 - 1 + 1 0 2. 6
5 0 - 1 - 1 8. 6
6 0 - 1 + 1 10. 1
7 0 + 1 - 1 8. 2
8 0 + 1 + 1 10. 9
9 + 1 - 1 0 9. 7
10 + 1 0 - 1 8. 3
11 + 1 0 + 1 9. 8
12 + 1 + 1 0 9. 0
13 0 0 0 10. 0
14 0 0 0 10. 5
15 0 0 0 10. 3
　　由表 2中的数据 ,采用 SAS-RSREG程序回归
拟合得出回归方程:
Y = 10. 267+ 3. 478X1 - 0. 012 5X 2+ 0. 913
X 3- 4. 133X
2
1- 0. 208X
2
2- 0. 608X
2
3- 0. 225X 1 X 2-
0. 025X 1X 3+ 0. 30X 2X 3
　　对回归方程作显著性检验和方差分析 ,见表 3。
对回归模型进一步分析和计算可以发现:回归
模型的 F值 (= 195)大于 F0. 01 ( 9, 5) ,线性相关系数
达到了 0. 998,说明方程的因变量与全部自变量之
间的线性关系很显著 ,方程的失拟性很小 ,所以用
SAS程序拟合得到的回归模型有较好的代表性 ,从
而可用回归方程对实验进行分析和预测。另外 ,从表
中可以看出 ,方程的一次项及二次项对响应值的影
响显著 ,而交互项的影响不显著。
表 3　回归方程的显著性检验及方差分析
方差来源 自由度 平方和 平均平方和 F 显著性
一次项 　　 3 103. 27 　 34. 42 431. 2 < 0. 01
二次项 3 63. 46 21. 15 265. 0 < 0. 01
交互项 3 0. 57 0. 19 2. 359
失拟项 3 0. 27 0. 09 1. 434
误差　 2 0. 13 0. 07
总和　 14 167. 70
线性相关系数 0. 998
　　 F0. 05 ( 3, 2)= 19. 16, F 0. 01( 3, 2)= 99. 17,F 0. 01 ( 9, 5)= 10. 2
2. 2　虫草多糖提取工艺的优化:在用 SAS-RSREG
程序计算出回归方程中各系数的基础上 ,以虫草多
糖沉析量回归模型进行数学分析 ,即对模型方程求
偏导 ,并令其等于零 ,可得到曲面的最大点 ,结果: 乙
醇 /发酵液 ( V /V )为 3. 8∶ 1,醇析时间为 11. 7 h, pH
值为 7. 65,虫草多糖醇析量为 11. 35 g /L发酵液。
为了进一步验证虫草多糖最优的提取工艺 ,采
用上述条件即乙醇添加量为 3. 8倍体积、沉析时间
为 12 h、 pH值为 7. 65进行了实验 ,结果虫草多糖
的沉析量达到了 11. 36 g /L,优化效果显著。
通过实验 ,发现在虫草多糖的沉析过程中 ,乙醇
添加量对多糖沉析的影响最大 ,其次是 pH值 ,且当
pH值为 7. 65时沉淀量最大 ,这可能是虫草多糖分
子带电荷有关 ,所以可以通过调整乙醇添加量、沉析
时间及 pH使虫草多糖的沉析达到最佳化。
在响应面分析的基础上 ,采用回归模型进行计
算 ,可以预测虫草多糖的提取量 ,并得到虫草多糖提
取的优化工艺 ,这为以后虫草多糖的提取打下了
基础。　
参考文献:
[1 ]　唐茂芝 . 食用菌类食品作为功能性食品的优势和特点 [ J ]. 食
品科技 , 1999, 3: 5-6.
[ 2 ]　李绍平 ,季　晖 ,李　萍 ,等 . 冬虫夏草抗肿瘤作用研究进展
[ J ]. 中草药 , 2001, 32( 4): 373-375.
[ 3]　季　晖 ,涂红湖 ,李耐三 .人工虫草菌丝多糖的分离提取及其
降血糖作用研究 [ J ]. 中国药科大学学报 , 1993, 24( 1): 39-42.
[4 ]　龚　敏 ,朱　勤 ,王　彤 ,等 . 冬虫夏草多糖分子结构与免疫活
性 [ J] . 生物化学杂志 , 1990, 6( 6): 486-488.
[ 5 ]　肖宏亮 ,高孔荣 ,谭盈科 .冬虫夏草及其菌丝体研究进展 [ J ].
中国食用菌 , 1997, 16( 2): 3-5.
[6 ]　 Staub A N. Removal of proteins f rom polys accharides [ J ] .
M ethod Carbonh ydr Chem, 1975, 5: 5-6.
[7 ]　费荣昌 . 试验设计与数据处理 [M ] . 第 4版 . 无锡:无锡轻工
大学出版社 , 1997.
·1087·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 12期