全 文 ：高效毛细管电泳法测定苦参碱和氧化苦参碱
第二军医大学 东方肝胆外科医院肿 瘤免疫
和基 因治疗中心 (上 海 2 0 0 4 38)
罗 明 ‘ 贺 平 吴孟超
李琳芳 郭亚军
摘 要 建 立 了测 定苦参碱 和氧化苦参碱含量 的高效 毛细管 电泳 法 。 20 m m o L / L 的磷 酸盐缓 冲
液 (p H = 8 . 0 )为 电泳 电解质 , 电压 为 3 0 kV (运行 电流 为 1 0 0 ~ 1 1 0 拌A ) , 检测 波长为 2 1 4 n m , 内标
氨茶碱 。 苦参碱 0. 126 一 l. 26 m g / m L 、 氧化苦参碱 0 . 10 一 1 . o m g /m L 其浓度与峰面积之 比呈 良好
的线性关系 , r 均 为 0 . 9 9 98 , 日内 、 日间变异 系数均 小于 5 . 7 % , 常用 2 种 药物除地塞米松外其余
的 对其无干 扰 。 用 本 法测 定 了 2 批苦参提取物 , 其 中苦参碱为 (4 5 . 19 士 0 . 0 5 8 )% , (6 2 . 81 士
0
.
1 2 3 )% ;氧化苦参碱为 (8 . 71 士 0 . 0 3) % , (6 . 81 士 0 . 0 86) % 。 结果表 明 , 该方法简单 、灵敏 , 特 异性
和重现性 良好 , 具有 较强的实用价值 。
关键词 高效毛细管 电泳 苦参碱 氧化苦参 碱 含量检测
高效 毛细管电泳法 (H P C E )是 近年发展
起来的一种新的分离分析方法川 。 苦参碱和
氧化苦参碱是常用中草药苦参及广豆根等的
主要有效成分 , 具有镇 静 、镇痛 、解热 、降温 、
抗炎 、抗病毒 、抗肿瘤和免疫调节作用图 。 已
有报道用 H PL C 方法检测 苦参碱和 氧化苦
参碱的方法阁 , 但相 比 H P C E 而言又不及后
者快速 、简便 、高效 。 本实验用 H P CE 中的毛
细管 区带 电泳法 同时测定苦参碱和氧化苦参
碱的含量 , 结果较为满意 。
1 实验材料
P /A C E S0 0 0 型 毛 细 管 电 泳 仪 (美 国
B e e k m a n 公 司 ) , IBM 4 4 6 0 D X Z 型电脑 , E p s o
L Q
一
30 0 型 打 印机 , 石英 毛 细管 57 c m X 50
拜m (美 国 B e ek m a n 公司 ) , 有效长度 5 0 。m 。
对照品苦参碱和氧化苦参碱购于中国药品生
物 制 品 检 定 所 , 批 号 分别 为 0 8 0 5 一 9 7 0 3 和
07 80
一
97 03
。 试剂均为国产分析纯试剂 , 水为
去离子双蒸水 , 待测的两份 苦参碱样 品是分
别 用 乙 醇 法 和 酸水 法 从 苦 参 中 自行 提 取
的 [ ‘〕。
2 方法与结果
2
.
1 测定条件 : 以 20 m m o L / L 磷酸盐缓 冲
液 (pH 一 8 . 0) 作为电泳 电解溶液 。 每次开机
后用 0 . 1 m m o L / L 盐酸 、 0 . 1 m m o L / L 氢氧
化钠 、 20 m m o L / L 磷酸盐缓冲液和水各冲洗
4 m in
。 两次进样之间以磷酸盐缓 冲液和水各
冲洗 2 m in 。真空进样时间为 5 5 , 恒定电压为
3 0 kV
, 运 行 电 流 为 1 0 0 一 1 1 0 拼A , 柱 温
2 3 ℃ , 检测波长 21 4 n m , 设定时间 10 m in , 由
计算机记录并处理峰面积 。
2
.
2 标准液的配制及样 品的处理 : 精确称取
对照品苦参碱和氧化苦参碱一定量 , 去 离子
双蒸水溶解 , 定容 , 最后用 0 . 2 拜m 的滤膜过
滤 , 得贮备液 。待测的两份苦参碱样品干燥恒
重后 , 分别称取一定量溶解于一定 的去 离子
双蒸水中 , 分别用 0 . 2 拌m 滤膜过滤 , 作 为待
测样品 。
2
.
3 内标 的选择 : 实验 中考察 了氢化可 的
松 、甘草酸二胺作为内标 的可能性 ,但二者在
10 m in 内无吸收峰 出现 , 而氨茶碱在碱性环
境 中稳定 , 并且不干扰待测成分 出峰 , 重复性
好 , 故选作检测苦参碱和氧化苦参 碱的内标
(图 1 一A ) 。
A d d r e s s
:
L u o M in g
,
O r ie n t al H e p a to b ilia r y
罗 明 3 5 岁 , 博 士学位 , 主治医师和讲师 。
S u r g e r y H o s p it a l
,
T h e S e e o n d M ilit a r y M e d ie a l U n iv e r s ity
,
Sh a n g ha i
1 9 8 6 年毕业于湖北 中医学院中医系 , 先后在同济医科大学和第二军医大学
获硕士及博士学位 。 长期从事中西医结合科研 、临床及教 学工作 , 已发表论文 4 篇 。
《中草药》1 9 9 9 年第 3 0 卷第 4 期 2 6 1
定苦参碱和氧化苦参碱 的干扰 。结果表明 , 除
地塞米松对氧化苦参碱在出峰时间上有干扰
外 , 其余 药对其均无影响 。
2
.
5 标准曲线和线性范围 : 精密移取标准贮
备液不 同量 , 加氨茶碱 (25 m g / m L )液作 内
标 , 用水定容 , 得不同浓度的标准系列溶液 ,
按 开始设定 的工作条件检测 , 每个样本重复
3 次 , 以药物浓度为纵坐标 (Y ) , 药物与 内标
峰面积之比为横坐标 (X ) , 进行线性回归 。 结
果见表 1 。
表 1 苦参碱和叙化苦参碱的线性关系和线性范围
当翻香毛吕. .d。口吧.门亡衬甘的.伙“导.岂浅比眨fn”
呼6 .t |
2
. 面 一 打丽 O _的 2 . 0 0 4 , 0O
时间 t ( m in )
A
一对 照品 B 一样品
图 1 电泳图
2
.
4 干扰试验 : 在本试验条件下 , 检测临床
上常用的 2 种药物 : 维生素 C 、维生素 B 6 、维
生素 B 1 2 、维生素 K l 、维生素 K 3 、青霉素钠盐 、
氨节青霉素 、庆大霉素 、卡那霉素 、链霉素 、红
霉素 、盐酸麻黄碱 、氨甲苯酸 、甘草酸二胺 、三
磷酸腺昔二钠 、肌昔 、肝泰乐 、酚磺乙胺 、地塞
米 松 、氢化可的松 、利多卡因 、氟尿嗜陡对测
药物 线性关系 线性 范围
( m g / m L )
苦参碱 Y = 3 . S X 一 0 . 0 2 4 0 . 12 6 ~ 1 . 2 6 0 . 9 9 9 8
氧化苦参碱 Y = 3 . 64 X 一 0 . 0 4 1 0 . 10 一 1 . 0 0 . 9 99 8
2
.
6 回 收率及精密度 : 用苦参碱和氧化苦参
碱分别配制成表 2 所示的高 、中 、低 3 种不同
浓度 , 按相 同的方法操 作 , 计算 回收率及 日
内 , 日间精密度 ( R S D ) , 结果见表 2 。
表 2 回收率和精密度试验‘士 : )
药 品 加人量
( m g / m L )
测得量
( m g / m L )
回收率
( 环)
日内 R S D
( % ) ( n = 3 )
日间 R SD
(呱 ) ( n = 6 )
苦参碱 1
苦参碱 2
苦参碱 3
氧化苦参碱 1
氧化苦参碱 2
氧化苦参碱 2
0
.
1 2 0 1 1 3 3 士 0 . 0 0 6 5 8 9 . 8 9士 5 , 1 2 4 。 2 3
0
.
6 3 0
.
6 2 8 2 士 0 . 0 0 3 0 9 9 . 9 1士 0 . 4 8 0 . 4 8
2 6 1
.
2 3 3士 0 . 0 0 5 9 9 7 . 8 8士 0 . 1 7 0 . 4 7 0 . 8 7
0
.
1 0 0
.
1 0 2 6 士 0 . 0 0 1 8 1 0 2 。 6 3 士 1 , 7 6
0
.
5 0 0
.
5 1 2 士 0 . 0 0 3 1 0 2 . 4 士 0 . 5 9 0 . 5 8
0 1
.
0 0 6 8 士 0 . 0 0 3 1 0 0 , 6 8 士 0 . 3 0 0 . 3 0 0 7 7
2
.
7 重现性 : 为确定上述分析条件下定量分
析的精密度 , 通过 6 次重复进样 , 考察了苦参
碱 和氧化苦参碱的相对迁移时间和峰面积之
比的重现性 , 结果见表 3 。
表 3 苦参碱 、权化苦参碱的相对迁移 时间
和峰面积之 比 ( n = 6)
相对迁移时间 峰面积比
药物——妥士 s ( m in ) RS D (% ) 牙士5 R S D (% )苦参碱 2 . 0 68土 0 . 03 4 1 . 6 4 4 0 . 36 17士 0 . 00 3 2 0 . 8 8 5氧化苦参碱 2 . 5 25士 0 . 01 7 0 . 6 7 3 0 . 28 60士 0 . 00 2 1 0 . 73 42 . 8 最低 检测 限 : 当信噪 比大于 2 时 , 苦参· 2 6 2 。
碱和氧化苦参碱的最低检测限分别是 1 . 0 和
0
.
5 拌g / m L 。
2
.
9 应用 : 取 配制好 的两批待测 苦参碱样
品 , 分别加人相同的氨茶碱 内标 。照开始设定
工作条件开始检测样品中苦参碱和氧化苦参
碱的含量 , 每个样品重复 3 次 , 结果见表 4 。
3 讨论 ‘
开始考察 了 4 种不同浓度的缓 冲液作为
电泳 电解 质 的可能 , 结果 发现 30 m m o L / L
的磷酸盐缓 冲液 ( p H 一 6 . 7) 和 10 m m o L / L
的醋酸缓 冲液 ( pH 一 3 . 0) 完全不能将苦参碱
表 4 样品中苦参碱和叙化苦参碱的含t
(x 士 s n = 3)
样品 苦参碱 (% ) 尸 氧化苦参碱 P
1 4 5
.
1 9士 0 . 0 5 8 8 . 7 1士 0 . 0 3
2 6 2
.
8 1士 0 . 1 2 3 < 0 . 0 1 6 . 8 1士 0 . 0 8 6 < 0 . 0 1
和氧化苦参 碱分离 ; 而 10 m m o L / L 的磷 酸
盐缓 冲液 (p H 一 6 . 37 )又分离不彻底 。 相 比之
下 , 20 m m o L / L 的磷酸缓冲液 (pH 一 8 . 0) 分
离效果 较好 , 待测 成分 及 内标 均可在 2 ~ 4
m in 内出峰 , 而 且相互 之 间分离完 全 (图 1 -
A )
。 通过干扰试验发现临床上与苦参碱和氧
化苦参碱相关的 2 种常用药物中除地塞米
松对氧化苦参碱 的色谱峰干扰外 , 其余 的均
无干扰 。 回收率及 日内 、 日间 R S D 均在允许
范围之内 。 所试验 的两份样品 , 尽管样品不
纯 , 含杂质较多 , 但该系统仍然较好地将各个
成分分开 (图 1一B ) 。 同时也说明 , 乙醇法提取
的氧化苦参碱含量较高 , 而酸水渗滚法提取
的苦参碱含量较高 。 经对 同一样本 的反复测
试 , 证明方法的重现性 、精确性均达到要求 ,
较 常规的 H PL C 法简便 、快速 、经济 , 具有较
高的实用价值 。
参 考 文 献
l 王 杰 , 等 . 中国医药工业杂志 , 1 9 9 7 , 28 (7 ) : 3 2 7
2 李 丹 , 等 . 中草药 , 1 9 9 6 , 2 7 (5 ) : 3 08
3 金莉 霞 , 等 . 药 学学 报 , 1 9 93 , 2 8 (2 ) : 13 6
4 张守芳 . 中草药通讯 , 1 9 7 , 1 : 3 8
(1 9 9 8
一
0 6
一
30 收稿 )
D e te r m in a tio n o f M a tr in e a n d O x ym a tr in e b y H P C E
L u o M in g
,
H e Pin g
,
W
u
M
e n g e h a o
, e t a l
.
(T u m o r Im m u n o lo g y a n d G e n e T he r a p y Ce n te r
,
O rie n t a l
H o s p it a l
, th e S e e o n d M ilit
a ry M
e d ic a l U n iv e r s it y
,
S h a n g h a i 2 0 0 4 3 8 )
A b s tr a e t A m e th o d h a s be e n d e v e lo p e d fo r t h e d e te r m in a tio n o f m a t r in e a n d o x y m a t r in e b y h ig h p e r
-
fo rm a n c e c a Pilla r y e le et r o p h o r e s is (H PC E )
.
A m in o Ph y llin e w a s u s ed a s in te r n a l s ta n d a r d
.
C o m p le te se p a r a
-
tio n w a s a e h ie v e d w ith 2 0 m m o l/ L
r u n n in g p h o s p h a te b u ffe r (pH = 8
.
0 ) a t a e o n s ta n t v o lta g e o f 3 0 k V (eu r
-
r e n t o f 1 0 0~ 1 1 0 拜A ) a n d d e te e te d a t a w a v e le n g th o f 2 1 4 n m . G o o d lin e a rity w a s s h o w n b e tw e e n t h e e o n e e n -
tr a tio n a n d p e a k a r e a in th e e o n e e n t r a tio n r a n g e o f 0
.
1 2 6一 1 . 2 6 m g / m L fo r m a tr in e a n d 0 . 1 0 ~ 1 . 0 m g / m L
fo r o x ym a t r in e
, r 一 0 . 9 9 9 8 . T h e r e la tiv e s t a n d a r d d e v ia tio n (R S D ) fo r w it h in 一d a y a n d be tw e e n 一d a y w a s le s s
th a n 5
.
7 %
.
2 2 diffe r e n t d r u g s in e o m m o n u s e e x e e p t d e x a m e th a s o n e s h o w e d n o in t e rfe r e n ee
.
T w o sa m ple s o f
e x t r a e t o f SoP h
o
ra 刀a v es c e n s A it . g a v e r e su lts o f (4 5 . 1 9 士 0 . 0 5 8 )% a n d (6 2 . 8 1士 0 . 1 2 3 )% fo r m a t rin e a n d
(8
.
7 1士 0 . 0 3 )% a n d (6 . 8 1士 0 . 0 8 6 )% fo r o x ym a t rin e o n a tr ia l d e te r m in a t io n . It s e e m e d t ha t t he H PC E
m e th o d 15 fa st e r
,
m o r e e o n v e n ie n t a n d e e o n o m ie a l a s e o m p a r e d w ith H PL C
.
K ey w o rd s h ig h p e r fo rm a n e e e a p illa ry e le e t r o p ho r e s is (H P C E ) m a t rin e o x ym a t rin e
《中草药 》杂志 1 9 9 8 年第 29 卷增刊 (总第 3 10 期 ) 征订启事
为了扩大学术交流 , 提高新药研究水平 , 经 国家科学技术部 (国科发信字 〔1 9 9 8〕 2 17 号文 ) 批准 , 我们
编 辑出版 了 《中草药 》杂志 1 9 9 8 年第 2 9 卷增刊 (总第 310 期 ) 。 本增刊共收载论文 8 0 篇 , 并 以当今国际研究
的热点 “银杏叶的开发研究 ” 为专论重点 , 包括银杏叶的化学成分 、 提取工艺 、 质量控制 、 药理作用及临床应
用等方面的科研论文 26 篇 , 并特邀国内从事银杏叶研究的知名专家和 中青年学科带头人撰写综述文章 , 充分
反 映了国 内、 外在 “银杏叶的开发研究 ” 方面的新成果 、 新进展和新动态 。 另外收载反 映我 国中药植化 、 药理 、
分析 、 制剂 、 药材和 临床等方面的新理论 、 新方法 、 新成就的科研论文和有关综述文章 54 篇 。 本增刊选题广
泛 , 内容丰富 , 学术水平较高 , 科学性较强 , 集中反映了我 国中草药研究领域近 1 ~ 2 年 的新进展 。
增 刊为 1 6 开本 , 采用激光照排 , 胶版印刷 , 彩色封面 , 1 60 页 (约 3 0 万字左右 ) , 夭津市报 刊增 刊特许
准印证 (9 8 ) 第 12 号 , 本部发行 , 定价 50 元 ; 另加包装 费 、 邮费 5 元 , 订阅请向我部索取订单 。
电话 : (0 2 2) 2 7 4 7 4 9 1 3 邮政编码 : 3 0 0 1 9 3 天津市南开区鞍山西道 308 号 《中草药》杂志编辑部
《中草药 》1 9 9 9 年第 3 0 卷第 4 期 . 2 6 3 .