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香菇子实体蛋白多糖 Le-3的结构性质研究
杨　娟 1 ,吴谋成 2 ,张声华 2⒇
( 1. 贵州省 ,中国科学院 天然产物化学重点实验室 ,贵州 贵阳　 550002;　 2. 华中农业大学 食品科技系 ,湖北 武
汉　 430070)
摘　要:目的　研究香菇子实体蛋白多糖 Le-3的结构性质。方法　凝胶渗透色谱法测定相对分子量 ,红外扫描、气
相色谱、β-消去反应和琼脂糖凝胶电泳等方法阐述多糖的结构 ,比色法测定糖及蛋白质的含量。 结果　该多糖的重
均分子量和数均分子量分别为 13 700和 12 500,红外扫描有典型的多糖吸收峰 ,糖苷键为 β型。单糖组成为阿拉伯
糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸 ,中性糖摩尔比为 Ara∶ Xy l∶ Man∶ Gal∶ Glu= 0. 31∶ 0. 47∶
1. 00∶ 1. 15∶ 8. 92,总糖含量为 70. 62% ,蛋白质含量为 25. 31% ,多糖与蛋白质为非 O-糖苷键连接。 Le-3中含有
RN A。 结论　 Le-3是从香菇子实体中分离得到的一种新类型多糖。
关键词: 香菇 ;蛋白多糖 ;结构性质
中图分类号: R284. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670 ( 2001) 09 0769 03
Studies on structural characteristics of protein-bond polysaccharide Le-3 from
fruitbody of Lentinus edodos
YANG Juan1 , W U Mou-cheng2 , ZHANG Sh eng-hua2
　　 ( 1. Key Labo ra to r y o f Chemistry fo r Natur al Products of Guizhou Prov ince and Chinese Academy of Sciences, Guiy ang
Guizhou 550002; 2. Depar tment of Food Science and Technolog y , Centra l China Ag ricultura l Univ er sity , Wuhan Hubei
430070, China)
Abstract: Object　 To study the st ructural characteristics of pro tein-bond po lysaccharide Le-3 from
the frui tbody of Lent inus edodos ( Berk. ) Pegler. Methods　 Rela tiv e molecular w eights w ere determined by
gel permea tion ch romatog raphy. St ructural characteristics w ere expounded by inf ra-red scan, gas chro-
ma tog raphy , β -elimination reaction and Sepharose gel elect rophoresis. The content of to tal poly saccha ride
and pro tein were determined by co lorimetry. Results　 Mean mo lecula r w eigh t and molecular number of
Le-3 w ere 13 700 and 12 500. Typical abso rption peak of the po lysaccharide as show n in inf ra-red spect rum
was o f β -type g lycosidic linkage. Le-3 w as composed of arabinose, x ylo se, mannose, g alactose, g lucose
and glucuronic acid. The mo lar ra tio of the neutral saccharides w as Ara∶ Xy l∶ Man∶ Gal∶ Glu= 0. 31∶
0. 47∶ 1. 00∶ 1. 15∶ 8. 92. The content of total saccharide and protein w ere 70. 62% and 25. 31% . The
saccha rides w ere no t linked to peptides chain through O-g lycosidic linkage. Le-3 contained RN A. Conclu-
sion　 Le-3 w as a kind of new type po lysaccharide isolated f rom the f ruitbody of L . edodes.
Key words: Lentinus edodos ( Berk. ) . Peg ler; pro tein-bond po lysaccharide; st ructural cha racteristics
　　目前从香菇子实体中分离到的多糖主要是不与
蛋白质结合的单纯多糖 ,而我们在实验中得到与蛋
白质结合的新类型复合多糖。关于香菇蛋白多糖中
多糖、蛋白质的性质 ,二者的连接方式及多糖的药理
活性是否与蛋白质的协同作用有关等问题 ,未见有
研究报道。本文以研究化学结构为目的 ,初步探讨了
香菇蛋白多糖的结构性质 ,为今后更深入研究香菇
多糖的化学结构和生物活性等工作提供基础资料。
1　材料与方法
1. 1　材料:香菇子实体蛋白多糖 Le-3的制备与纯
化见文献 [1 ] ,经聚丙烯酰胺凝胶电泳、 Sepharose
CL-6B柱层析及凝胶渗透色谱法 ,证明为分子量分
布均一级分 [1 ]。
1. 2　方法
1. 2. 1　凝胶渗透色谱法测定分子量 [2 ]: Wa ters
HPLC仪配以 T SK-5000PW柱 , 0. 2 mo l /L, pH6. 0
·769·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 9期
⒇ 收稿日期: 2000-11-29作者简介:杨　娟 ,女 ,助理研究员。 1996年于贵州大学生化营养研究所毕业 ,获理学硕士 ;同年考入华中农业大学食品科技系攻读博士学位 ,并于 1999年获工学博士学位。 已发表论文 5篇 ,现研究方向主要为天然产物化学。 　 E-mai l: Yangjuan 401@ 263. net
磷酸盐缓冲液为流动相 ,示差折射检测器检测 ,多糖
标准为 Pullulan系列: P-800( Mw 870 000) , P-400
( Mw 432 000) , P-200 ( Mw 186 000) , P-50 ( Mw
48 000) , P-20( Mw 23 700)。
1. 2. 2　紫外光谱分析: 将 Le-3配成 500μg /mL水
溶液 ,在 200～ 500 nm之间进行扫描。
1. 2. 3　红外光谱分析: 在日立 260-10型红外分光
光谱仪上进行 ,样品用溴化钾压片。
1. 2. 4　蛋白多糖组成成分分析:气相色谱法测定单
糖组成及摩尔比:称取 15 mg Le-3,加入 2 mol /L
H2 SO4 4 mL,封管后 ,在 100℃条件下水解 10 h,水
解液用 BaCO3中和 ,过滤所得上清液冷冻干燥后按
文献 [3 ]制成糖的三甲基硅醚衍生物进行气相色谱分
析 ,根据气相色谱分析中各峰的面积比算出摩尔比。
色谱柱为 3 mm× 2 m不锈钢柱 ,担体为 Chro-
moso rb W ( 60～ 80目 ) , 3% SE-30固定液 ,氢火焰
离子化检测器 ,记录仪: C-R6A积分仪。分析条件
为:柱温 180℃ ,进样口温度 230℃ ,空气流速 50
m L /min,氢气流速 50 m L /min,氮气流速 20 mL /
min。
中性糖含量的测定:根据气相色谱测出的蛋白
多糖中中性单糖的组成及各单糖比例 ,取这几种单
糖按比例混后作为中性糖标准 ,采用硫酸 -苯酚法测
定 [4 ]。
糖醛酸含量的测定:硫酸-咔唑法 [5 ]。
蛋白质含量的测定:考马斯亮蓝法 [6 ]。
氨基酸组成分析: 准确称取 25 mg Le-3,以 6
mol /L HCl溶解 ,封管 ,水解 24 h后定容至 50 mL,
取 1 mL蒸干 ,加 0. 02 mo l /L HCl溶解后用氨基酸
自动分析仪分析。
1. 2. 5　糖苷键连接方式的确定: Le-3用 0. 2 mol /L
NaOH于 45℃下处理 1. 5 h后 ,测定其在 220～ 400
nm的吸收光谱。
β -消除反应: 在 N2保护下 , 26 mg Le-3溶于 3
m L, 0. 2 mo l /L NaOH-1. 0 mol /L NaBH4溶液 ,于
40℃反应 24 h ,在冰浴中用 1 mol /L乙酸中和至
pH7. 0. 在 N2气保护下 ,用 6 mo l /L HCl水解 ,用
氨基酸自动分析仪测定氨基酸含量。
2　结果与讨论
2. 1　基本物性质: Le-3为黄色纤维状疏松固体 ,溶
于水 ,不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。 硫酸 -苯酚、硫
酸 -蒽酮、硫酸-咔唑反应 ,考马斯亮蓝反应呈阳性 ;
菲林试剂、碘 -碘化钾反应呈阴性 ,表明其中含有多
糖、蛋白质、糖醛酸 ,不含还原糖和淀粉。
2. 2　相对分子量:以 pullulan系列分子量对数对其
在凝胶渗透柱上的保留时间作图 ,得到分子量标准
曲线 ,标准方程为 logMw= 9. 49- 0. 555RT, r=
0. 999 6。 Le-3的数均分子量为 125 000,重均分子
量为 13 700. 多分散系数 ( M w /M n)为 1. 1,分子量
分布比较均一。
2. 3　紫外可见光谱分析: Le-3在 280 nm无吸收
峰 , 260 nm附近有特征吸收 ,表明其中可能含有核
酸和较少的色氨酸。由于 Le-3在 260 nm处有吸收 ,
猜测可能有核酸存在 ,因此用琼脂糖凝胶水平板电
泳加以验证。胶浓度为 0. 7% , TAE电泳缓冲液:
0. 04 mol /L Tris-乙酸 , 0. 001 mol /L EDT A。 电压
1～ 5 V /cm,电泳结束后 ,用 0. 5μg /mL的溴化乙锭
水溶液染胶 20 min,在紫外光 (λ为 254 nm )下观
察。结果发现 Le-3约在 1 000个碱基对处有很亮的
拖尾带 ,估计是 RNA,加适量 RNA酶于 Le-3中 ,
于 37℃温育 1 h,再与未经酶处理的样品一起电泳
比较 ,结果发现亮带消失 ,证明 Le-3中确实含有
RNA。这在以往有关香菇子实体多糖的研究中未见
报道。香菇中双链 RNA有诱生干扰素产生的作
用 [7 ] ,是否 Le-3也具有此功能 ,可做进一步探讨。
2. 4　红外光谱解析: Le-3在 2 925 cm- 1 ( C-H)、
1 620～ 1 650 cm- 1 ( C= O)、 1 000～ 1 200 cm- 1 (吡
喃糖环醚键 C-O-C)和 1 420 cm- 1 ( C-O)处有多糖吸
收峰 ; 3 400 cm- 1处有一级氨基、二级氨基、 1 620～
1 650 cm
- 1有酰胺基的特征吸收峰 , 1 420 cm- 1处的
C-N伸缩振动 ,都证明有蛋白质存在 ,红外分析进
一步证实 Le-3为蛋白多糖。 Le-3在 890 cm- 1 (β-D-
葡聚糖特征吸收 )处有明显吸收 ,说明该蛋白多糖含
β-D-葡萄糖。在 870, 800 cm- 1有甘露吡喃糖特征吸
收峰。
2. 5　组成分析
2. 5. 1　单糖组成及其摩尔比: Le-3酸水解物的气
相色谱表明 ,其中性糖组成为阿拉伯糖 ( Ala )、木糖
( Xyl )、甘露糖 ( Man)、半乳糖 ( Gal )、葡萄糖 ( Glc) ,
摩尔比为 0. 31∶ 0. 47∶ 1. 00∶ 1. 15∶ 8. 92, Le-3中
中性糖、葡萄糖醛酸、总糖含量 (% )分别为 30. 57,
40. 05, 70. 62。
2. 5. 2　蛋白质含量及氨基酸组成、含量 ( g /100 g ):
蛋白质含量为 25. 31% ,氨基酸含量 (% )分别为天
门冬氨酸 3. 81;苏氨酸 1. 72;丝氨酸 2. 12;谷氨酸
4. 04;甘氨酸 1. 96;丙氨酸 1. 58;缬氨酸 1. 25;蛋氨
酸 0. 53;异亮氨酸 0. 81;亮氨酸 1. 19;酪氨酸 0. 71;
苯丙氨酸 1. 03;赖氨酸 1. 28;组氨酸 0. 30;精氨酸
·770· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 9期
1. 09;脯氨酸 1. 07。
2. 6　β -消去反应确定糖肽链的连接方式: Le-3经碱
处理后 ,在 240 nm处未出现新的吸收峰 ,说明在
Le-3中可能不存在 O-糖苷键。 因为如有 O-糖苷键
存在 ,由于形成 O-糖苷键的丝氨酸和苏氨酸经碱处
理后分别生成 α-氨基丙烯酸和α-氨基丁烯酸 ,这两
种不饱和氨基酸会导致 240 nm处的光吸收增加 [8 ]。
为进一步确定 O-糖苷键是否存在 ,对 Le-3进
行 β-消去反应。结果反应后 Le-3中丝氨酸和苏氨酸
含量减少 ,其中丝氨酸为 1. 21,减少了 42. 9% ;苏氨
酸为 1. 08,减少 37. 2% ,但丙氨酸未见有相应增加 ,
这也说明了 Le-3中存在 O-糖苷键。但须指出 ,丝氨
酸和苏氨酸经碱处理后 ,发生了何种反应 ,生成了什
么物质 ,有关这方面的问题还需进一步研究。
Le-3中蛋白质、多糖、 RNA三者的存在 ,使其
结构变得尤为复杂 ,阐明三者的连接方式比较困难 ,
本文只是对香菇子实体蛋白多糖 Le-3的结构性质
进行了初步研究 ,有待进一步的深入。
参考文献:
[ 1 ]　杨　娟 ,吴谋成 ,张声华 . 香菇子实体多糖 Le-Ⅲ的分离纯化
及性质研究 [ J] .华中农业大学学报 , 1999, 18( 2): 16-17.
[2 ]　陈春英 ,丁玉强 , Elmahadi E A,等 . 箬叶多糖的分离纯化及其
理化性质的研究 [ J] .中国生物化学与分子生物学报 , 1998, 14
( 4): 422-431.
[3 ]　李铁林 ,吴昌贤 ,蒋挺大 ,等 . 糖和糖醇的气相色谱分析 ,Ⅱ ,单
糖三甲基硅醚衍生物的气相色谱分析 [ J] . 分析化学 , 1981, 9
( 3): 295-298.
[4 ]　林　颖 ,吴毓敏 ,吴　雯 ,等 . 天然产物中的糖含量测定方法正
确性的研究 [ J] .天然产物研究与开发 , 1996, 8( 3): 5-9.
[ 5]　 Bit ter T, Muir H M. A modif ied uronic acid carbazole reaction
[ J ]. Anal Biochem, 1962, 4: 330-334.
[6 ]　 Bradfo rd M M. A rapid and sensit ive meth od for th e quan ti ta-
tion of microgram quanti ti es of protein u tili zing th e p rinciple of
p ro tein binding [ J] . Anal Biochem, 1976, 72: 248-254.
[ 7 ]　 Tak ehara M , Toyomasu T, Mori K, et al . Is olation and an-
tivi ral act ivi ti es of th e doules tranded RN A from Lentin us edo-
des ( Shii take) [ J ]. Kobe J Med Sci, 1984, 30: 3-4.
[ 8 ]　 Plantner J J, Carlson D M. Studies of mucin-type glycopro-
teins olefinic amino acids , p rod ucts of th eβ-elimination reac-
tion [ J ]. Anal Bioch em, 1975, 65: 153-163.
一株产生 醌类化合物的真菌的化学成分研究 (Ⅰ )
刘为忠 1 ,李维莉 2 ,沈云修 1 ,陈远腾 2 ,谢金伦 2⒇
( 1. 滨州医学院 化学教研室 ,山东 滨州　 256603;　 2. 云南大学 发酵工程重点实验室 ,云南 昆明　 650091)
摘　要: 目的　研究菌寄生菌属真菌 ( Hypomyces sp. )菌丝体的化学成分。 方法　用丙酮提取 ,硅胶柱分离纯化 ,化
学和波谱学方法进行结构鉴定。 结果　从菌丝体中分得 5个化合物 ,分别鉴定为: 竹红菌甲素 (Ⅰ ) ,竹红菌丙素
(Ⅱ ) ,痂囊腔菌素 C(Ⅲ ) , 1-吩嗪羧酸 (Ⅳ )和 1, 8-二羟基 -9, 10-蒽醌 (Ⅴ )。 结论　化合物Ⅱ ～ Ⅴ为首次从该菌中分
得。
关键词: 菌寄生菌属真菌 ; 醌类化合物 ;发酵
中图分类号: R284. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670 ( 2001) 09 0771 03
Studies on chemical constituents of fungus producing perylenequinonesⅠ
LIU Wei-zhong1 , L I Wei-li2 , SHEN Yun-xiu1 , CHEN Yuan-teng2 , X IE Jin-lun2
　　 ( 1. Depa rtment o f Chemistry , Binzhou Medica l Colleg e, Binzhou Shandong 256603, China; 2. Key Labo ra to ry o f Fer-
mentation Engineering , Yunnan Univ er sity , Kunming Yunnan 650091, China)
Abstract: Object　 To study the chemical consti tuents in the mycelia of Hypomyces sp. . Methods　
The mycelia w ere ex t racted wi th acetone and the chemical consti tuents of the ex tract were iso la ted and pu-
rified on silica gel co lumn. Chemical and spectral methods w ere used to determine the structures of the iso-
lated compounds. Results　 Five compounds were obtained and identified as: hypocrellin A (Ⅰ ) , hypocre-
llin C (Ⅱ ) , elsinochrome C (Ⅲ ) , 1-phena zinecarboxylic acid (Ⅳ ) , and 1, 8-dihydroxy-9, 10-an-
thraquinone (Ⅴ ) . Conclusion　 CompoundsⅡ ～ Ⅴ were obtained from the mycelia of Hypomyces sp. fo r
the fi rst time.
Key words: Hypomyces sp. ; perylenquinones; fermenta tion
·771·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 9期
收稿日期: 2000-09-20作者简介:刘为忠 ,男 ,山东高密人 ,讲师 ,硕士。 研究方向:天然产物化学。 Tel: ( 0543) 3256043　　 E-mai l: Lw zh@ b zmc. edu. cn