全 文 ：RP-HPLC制备色谱法分离黄芪甲苷
张　鉴 1 ,张振海 2 ,余增亮 1
( 1. 中国科学院等离子体研究所生物工程中心 ,安徽 合肥　 230031; 2. 天津科器公司 ,天津　 300100)
中图分类号: R927. 2　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 12 1087 02
　 　 黄 芪 Astragalus membranaceus ( Fisch. )
Bunge为常用中药 ,具有益气固表 ,利尿托毒等功
效 [1 ] ,黄芪甲苷 ( astragalo sideⅣ )是其主要活性成
分之一 ,常作为指标性成分用于黄芪药材和制剂的
质量监控 [2, 3 ]。本文研究了采用 RP-HPLC制备色谱
的方法从黄芪药材中分离制备黄芪甲苷单体 ,满足
常规分析检测的需求。
1　仪器与试剂
实验仪器: Waters 600高效液相色谱仪 ;色谱
工作站: M ILLIN U IM 32( 3. 05. 01版 ) ;检测器: 410
示差折光检测器 ;分析柱: SymmetryShield TM C18色
谱柱 ( 3. 9 mm× 150 mm, 5μm); 进样器: Rheo-
dyne7725型 , 10μL进样环。
制备柱: μBondpakTM C18 ( 7. 8 mm× 300 mm ,
15μ) ;制备泵: ZSB型 ;流量调节仪: TL-Ⅲ ;进样
环: 500μL,天津科器公司产 ;馏分收集器: BSZ-160
型 ,上海青浦沪西仪器厂。
试剂均为色谱纯和分析纯。氧化铝为柱层析用 ,
100～ 200目。
2　实验条件和方法
2. 1　实验条件: 分析色谱柱: SymmetryShieldTM C18
( 3. 9 mm× 150 mm , 5μm) ,流动相: 甲醇 -水 ( 70∶
30 ) ,流速: 1 mL /min,检测灵敏度: 1024,柱温:
32℃ ,进样量: 10μL。
制 备 色 谱 柱: μBondpakTM C18 ( 7. 8 mm×
300 mm , 15μm) ,流动相: 甲醇 -水 ( 45∶ 55) ,流速:
5 mL /min,柱温: 25℃ ,进样量: 500μL,馏分收集
器步速: 0. 5分 /格。
2. 2　黄芪甲苷样品溶液制备:将黄芪药材减压烘干
至恒重 ,粉碎后过 50目筛 ,称取 700 g置于 5 L烧瓶
中 ,加入 3 L乙醚分 3次回流脱脂后 ,置于 60℃水浴
中用挥去残留乙醚。
向脱脂后药材中加入 3 L乙醇 , 60℃水浴加热
回流提取 2 h,过滤后经超速离心机离心 ( 10 000
r /min) ,将上清液在 60℃水浴条件下减压旋转蒸
发 ,回收乙醇 ,得到黄芪浸膏。
取 40 g浸膏加纯水超声溶解 ,用水饱和的正丁
醇于分液漏斗 ( 500 mL)中萃取 4次 ,每次 150 mL,
合并 4次正丁醇萃取液 ,用氯试液 ( 80 mL浓氨水加
水配成 200 mL)洗涤 2次 ,每次 100 mL,弃去碱水层
后 ,用正丁醇饱和的纯水洗涤 3次 ,弃去洗液 ,将正
丁醇层在 60℃旋转蒸发仪上减压回收至干。
图 1　黄芪制备色谱用样品 HPLC检测图
(黄芪甲苷含量约为 80% )
以 150 mL 50%甲醇-水溶解残余物 ,调节溶液
以 1 mL /min的速度通过中性氧化铝柱 (柱层析用 ,
100～ 200目 ,柱长约 25 cm,内径 2 cm ) ,并继续用
50%甲醇 -水溶液 40 mL冲柱。 合并洗脱液 ,减压浓
缩至干 ,用甲醇溶解 ,作为制备色谱用进样溶液 ,见
图 1。
2. 3　制备色谱分离:将所得黄芪制备色谱用样品溶
液每次进样 500μL,馏分收集器设定步速为
0. 5分 /格 ,根据检测结果收集相应格数流出液 ,冷
冻干燥后得到制备目标产物黄芪甲苷。 制备谱图见
图 2(阴影区为应收集目标产物的峰及相应时间 )。
目标产物黄芪甲苷 HPLC检测图见图 3。
3　结果和讨论
制备色谱和分析色谱在准备进样用的样品时有
·1087·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 12期
收稿日期: 2001-06-14作者简介:张鉴 ( 1971-) ,男 ,陕西西安人 ,中国科学院合肥分院等离子体所生物工程中心博士生。研究方向:天然产物和发酵产物活性成分的研究及基因工程产品的分离纯化。 Tel: 0551-5591602　 E-mail: sh angxia@ mail. h f. ah. cn
图 2　黄芪甲苷 HPLC制备色谱图
图 3　目标产物黄芪甲苷 HPLC检测图
一些区别:准备分析用样品时 ,要求方法的回收率尽
量接近 100% 。制备色谱的样品虽也有提取率高低
的问题 ,但更注重样品溶液中目标分离产物的含量 ,
杂质越少 ,制备时相对所得目标产物越多 ,制备效率
越高。 两者也有相似之处 ,即尽量避免在前处理时 ,
由于酸碱或加热等原因造成目标分离分析成分的分
解。
由于加热或药材长时间浸泡 ,会造成黄芪甲苷
受到破坏或与其他成分发生反应而使结构改变。所
以本实验控制溶剂减压蒸发时水浴温度在 60℃ ,回
流提取 2 h。
用乙醚洗涤 ,主要是为了脱去一些脂溶成分和
一些杂质峰的干扰 ,对黄芪甲苷含量和结构并无影
响 ,洗涤后在加入甲醇之前要减压水浴挥干乙醚。
氧化铝同时对黄酮类和皂苷类有吸附作用 ,在
准备分析用样品时 ,不宜使用 ,但应用于制备色谱样
品则是可以的 ,因为通过氧化铝柱后 ,虽然皂苷类略
有损失 ,但可以很好除去黄酮类和色素类成分 ,明显
的提高了洗脱液中黄芪甲苷的含量。
文献中高效液相色谱法大多采用紫外检测 ,但
由于黄芪甲苷仅在 200 nm左右有弱的末端吸收 ,色
谱图中噪音对结果影响较大 ,灵敏度较差 ,采用示差
折光检测 ,谱图清晰 ,峰位准确 ,制备时易于判断、收
集目标产物。
实验中考虑到普通实验室在进行制备实验时 ,
没有大流量高效液相色谱制备泵 ,本文研究了流动
相流速为 5 mL /min时多种制备色谱流动相的条件 ,
实验结果表明在甲醇-水 ( 45∶ 55)的条件下 ,目标产
物分离较为完全 ,单元分离时间也较为合适。
本文研究了通过反相高效液相制备色谱从黄芪
药材中提取、分离黄芪甲苷单体的完整方法。采用反
相高效液相色谱制备的黄芪甲苷经四谱 (核磁共振、
红外光谱、紫外光谱、质谱 )共同检测 ,并同文献数据
对照 ,确定纯度达到 98% ,符合标准物质的质量要
求。
参考文献:
[1 ]　江苏新医学院 . 中药大辞典 (下册 ) [M ] . 上海:上海人民出版
社 , 1977.
[ 2]　王宝琴 ,苏　健 ,鲁　静 .黄芪甲苷的检测在中药质控中的应
用 [ J ]. 中国中药杂志 , 1996, 21( 3): 1613.
[3 ]　田　丰 ,邓英杰 . HPLC法测定黄芪中的黄芪甲苷含量 [ J ]. 沈
阳药科大学学报 , 2000, 17( 1): 43.
动物中药可溶性蛋白凝胶电泳图谱的研究
陈振江 1 ,陈科力 1 ,邹　菁 2
( 1. 湖北中医学院 药学系 ,湖北 　武汉　 430061; 2. 武汉化工学院 ,湖北 武汉　 430071)
中图分类号: 　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 12 1088 03
　　动物胶和蛇类中药属贵重药材 ,经煎煮浓缩而
成的胶均为部分水解的胶质蛋白 ,难以用传统的方
法加以区分。 我们采用凝胶电泳系列技术对下列动
物药进行鉴别研究。
1　实验材料
①乌梢蛇 Zaocys dhumnacles ( canto r) ;②蕲蛇
Agkistrodoun acutus Guenther为蝰科动物五步蛇 ;
③水赤链游蛇 N atrix annulari ;④龟胶 ;⑤鹿角胶 ;
⑥猪皮胶 (自制 ) ;⑦伪品胶 ;⑧鲜王浆 A(湖北扬子
江蜂业公司 ) ;⑨鲜王浆 B(湖北崇阳 , 1999. 11) ;10
·1088· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 12期
收稿日期: 2000-12-13基金项目:湖北省教委自然科学科研项目 ( 98B03)