全 文 ：青篙醋钠抗人肝癌 一 与诱导凋亡
中山医科大学肿瘤研究所 广州 张 、 星 ” 杨小平 潘启超
摘 要 应用体内外抑瘤实验 、 细胞形态学观察 、流式细胞仪 、 实验进行检测和观察 ,
探讨青篙酷钠抗肿瘤作用及机制 。 结果表明 , 青篙醋钠对人肝癌有体内 、外抗肿瘤作用 诱导人肝
癌细胞凋亡 , 可能是其抗肿瘤作用机制之一 诱导体外人肝癌细胞凋亡通过 非依赖性途径 。
关祖词 青篙酷钠 肝肿瘤 抗肿瘤活性凋亡 非依赖性途径
青篙素 是从菊科艾属植物
黄花篙 中提得 , 为倍
半菇内醋过氧化物 , 是一种新化学结构 的抗
疟药 。 青篙醋钠 为青篙
素衍生物 , 具有水溶性好 、抗疟 活性高等特
点 。近年来发现青篙酪钠有体内 、 外抗肿瘤作
用 , 对小 鼠艾氏腹水瘤细胞 〔〕 、 人鼻咽癌细胞
一 和 一 和 人 宫 颈 癌 细 胞
〔〕生长有明显的抑制作用 , 但未见有
青篙酷钠对人肝癌体内 、 外抗肿瘤作用及其
机制研究的报道 。 我们研究了青篙醋钠对人
肝癌细胞的体内 、 外抗肿瘤作用 , 并从诱导肿
瘤细胞 凋亡的 角度来探讨其抗肿瘤作用机
制 , 为青篙醋钠在肿瘤治疗的新应用提供理
论依据 。
材料和方法
细胞培养和药物 人肝癌 一 细
胞 株在含 有 小牛血 清 、 青霉素
、 链霉素 拜 的 一 培养
液中培养 。 青篙醋钠 由广西桂林第二制药厂
出品 , 系 白色结 晶 , 使用 前以 。 助
溶 , 用生理盐水配成相 应浓度溶液 。
‘ 哗哇蓝还原法 法 将人肝癌细
胞种植于 孔培养板中 ‘ 个细胞
孔 , 加入不 同浓度青篙醋钠 川洲 孔 , 对
照组加等体积生理盐水 。 在 孵
箱 中培养 , 实验结束前 , 加入
液 液 , 产
品 。拼 , 继续孵育 后吸弃上清 , 加入二
甲基亚矾溶解甲腾 , 将培养板置酶联免疫检
测仪在 波长处测光密度值 值 ,
按以下公式计算抑制率 。
抑制率 一 实验组平均 值 对照组平均
值 火 , 用 软件程序求出 。。 。
青篙醋钠对裸鼠异体移植人肝癌生长
的作用 使用 月 一 月龄 裸
小 鼠 , 由中山医科大学实验动物中心提供 合
格证 一 。 将人肝癌 一 细胞接
种至裸鼠腋窝皮下形成实体瘤 , 约 , 待肿
瘤 直径长至 时 , 用青篙醋钠
、 、 · 个剂量 , 每 日
次 , 连续 , 第 日处死小 鼠 , 称体重 ,
剖取瘤块称重 , 计算抑瘤率 。
对照组平均瘤重一实验组平均瘤重 、 , , 。 。 丁甲 于留 」华 一一一一一一一一一 , 夏 下石下言 入 人 、】只只三且月 , 刊 于困 身盆
荧光显微镜检查 细胞经青篙醋钠处理
, 胰 酶 消 化 离 心 , 甲醇 一冰 醋 酸 固 定 ,
产品 染色 , 荧光显微
镜观察 , 并计算凋亡率 计数 个细胞 。
凋亡率 凋亡细胞数 。。个细胞
细胞超微结构观察 体内抑瘤实验结束
时 , 取生理盐水对照组和青篙醋钠高剂量组
· 裸 鼠瘤组织 按常规固定处
理后 〔〕 , 透射电镜下观察超微结构的变化 。
流 式 细 胞 仪 分 析 用 !
出品流式细胞仪 。 细胞经青篙醋钠处
理后 , 于 、 收集细胞 , 沉淀加人 液
一 朱 】 , 一 · 一只 一 ,
张 星 女 年 月 毕业于河南 医科大学临床医学 系 , 学士 年 月获中山医科大学肿瘤防治中心肿瘤药理学硕士 专业研究方向 肿瘤药理学 , 主要从事抗癌药物的筛选 、增效减毒 、作用机理方面的研究 。
《中草药》 年第 卷第 期 ·
制成单细胞悬液 , 再加 乙醇 型细胞株 和阿霉素为对照组 。
固定 。 染色前用 液离心沉淀 , 加 沁 结果
‘ 水浴 , 拜 碘化丙咤 染 体外细胞生长抑制作用 青篙醋钠对
色 , 流式细胞仪上测试记录激发波长 一 细胞生长有明显抑制作用 。 随着
处红色荧光 。 药物 浓 度 的 增 加 , 抑 制 率越 来 越大 。 在
青篙醋钠对肝癌细胞中 表达水平的 、 · 、 · 、 2 5 、 5 0 、 1 0 0 拜g / m L 浓度
影响 :采用 W es ter n bl ot 实验 。经药物处理后 下 , 抑制率分别为 19 .4% 、 29 . 0 % 、 3 5 . 1 % 、
1 2 h 收集细胞 , P B S 洗 2 次 , 加入 80 ℃预热 50.9% 、 6 1 . 3 % 和 83 .9 % 。 用 PO M S 软件程
1 只 S D S 凝胶加样缓冲液 (100 m m ol/L T ris 序求出 IC S。为 21.4 拼g / m IJ ( 5 2 . 5 拜m o l/ L ) 。
·
cl
,
p H 6
.
8
,
20
0 m m ol /
L D T T
,
4
% S D S
,
2. 2 对裸鼠异体移植人肝癌生长的作用 :实
0.2% 澳酚蓝 , 20 % 甘油 )10 拌L 溶解细胞 , 验结果表明 , 青篙醋钠对裸鼠异体移植人肝
收集细胞裂解液 , 10 o C 水浴 10 m in 。 取 20 癌的生长有明显抑制作用 , 青篙醋钠各用药
拼L 样 品在 12 % SD S 一聚丙烯酸胺凝胶中电泳 组瘤重均 小于生理盐水对照组 , 而给药组裸
s h (50 m A 恒流条件下)。 电转印至硝酸纤维 鼠体重增 长与对照组基本相同 , 各用药组裸
滤膜 , 5 % 脱脂奶粉封闭过夜 , 加入 P 53单抗 (1 鼠未见死亡 。 在 10 、 1 80 和 32 4 m g / (k g · d)
:
2 0 0 稀释 , S a n ta C ru tz 产品 )室温 反 应 2 剂量下 , 抑瘤率分别为 4 % 、 49 % 和 71 % (P
h , 二抗 (H R P) 室温反应 Z h , 最 后加入荧光 值均 < 0.01 ) , 阿霉素 1.5 m g八kg · d) 剂量
底物 , 在暗室压片及冲洗胶片 。 另设 P 53突变 下的抑瘤率为 3 % (尸< 0. 0 1 ) , 见表 1 。
表 1 青篙醋钠对裸鼠异体移植人肝癌的抑制作用
组别 剂量m g / (kg · d )
次数
(次/日) 给药途径
动物数
开始 结束
体重变化
(g )
平均瘤重
(万士 s) (g )
1 . 0 8 士0 . 1 3
0 . 7 2 士 0 . 2 1
0 . 6 0 士0. 2 0
0 . 5 5 士0 . 3 6
0 . 3 1士0 . 18
抑瘤率
(% )
长苦苦 朴件怪朴粉八JJ 月/l iC
1
内矛J 月4月寸7.
n气门oOJ曰]OCIC,1, l
+
+
h
及Ub产C内匕比h内b几冉h00PP生理盐水
阿霉素
青篙酷钠
1 5
100
180
324
15
15
15
15
15
与生理盐水组比较 :‘ 二 尸< 。. 01
2 . 3 荧光显微镜检查 :经不同浓度青篙酷钠
处理细胞 s h , 用 H oeehst33 258 染色 在荧光
显微镜下可观察到细胞出现凋亡 , 细胞核 或
细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光 , 荧
光较强 , 典型可见新月形改变 、 固缩或片段化
的核 。而正常细胞核呈弥漫均匀荧光 , 荧光较
弱 。 当青篙醋钠浓度为 。、 2 0 、 4 0 、 6 0 、 5 0 、 1 0 0
拌g / m L 时 , 3 次 实验 平 均 凋 亡 率 依次 为
3.7% 、 9 . 5 % 、 2 1 . 4 % 、 4 3 . 3 % 、 5 3 . 4 % 和
66. 2 % 。
2
.
4 超微结构观察 :青篙醋钠用药组 324
m g/(k g · d) 可观察到细胞凋亡特征的形态
学改变 :凋亡细胞在组织中常呈单个散在分
布 , 核染色质浓缩 、 聚集于核膜呈境界分明的
颗粒块状或新月形小体 , 胞质浓缩 , 细胞体积
·
4 6 8
·
缩小 , 内质网扩张 , 形成一 系列膨胀小泡 , 胞
质内细胞器及膜性结构保持完整 。
2
.
5 流式细胞仪分析 :在 D N A 直方图上 ,
青篙醋钠加药组细胞出现二倍体峰(G l细胞
峰)的减少 , G , 峰左侧出现亚二倍体细胞群
的峰型即凋亡峰(亚 G l峰) , 表明青篙醋钠能
诱导人肝癌 BE L 一 7 4 0 2 细胞发生凋亡 。 青篙
醋钠浓度为 。、 3 0 、 6 0 和 90 拼g / m L 时 , 1 2 h
凋 亡 率 分 别 为 3.7% 、 14 . 8 % 、 16 . 8 % 和
37 .0 % , 2 4 h 凋亡率分别为 8.2% 、 1 6 . 0 % 、
1 5
.
4 % 和 44.1% 。
2
.
6 青篙醋钠对 P 53蛋 白表达的影响 :肝癌
细胞未经阿霉素处理时 P53表达很低 , 经阿霉
素刺激后表达大量增加 , 表明肝癌细胞中 P 53
基因为野生型 。 与未经青篙醋钠处理的肝癌
细胞中 P 53表达无明显差异 , 表明青篙酷钠对
肝癌细胞中 P 53表达水平无影响 。 对照组
Fad u 在阿霉素刺激前后均 显示 P 53高度表
达 , 无明显差异 。
3 讨论
青篙醋钠是青篙素衍生物 , 是一种新型
的抗疟药物 , 近年来发现其具有抗肿瘤作用 。
继 W oe denb ag 和杨小平等人研究报道之后 ,
本研究结果显 示 , 青篙醋钠体外对人肝癌
B E L 一 7 4 0 2 细胞及体内对裸鼠异体移植人肝
癌生长均有明显的抑制作用 。 1 9 9 3 年 w oe -
de nb ag 等报道用 M T T 法检测与青篙素有
关的内过氧化物对艾 氏腹水癌细胞有细胞毒
活性 ;杨小平等报道青篙醋钠对人 H eL a 细
胞和人 SU N E 一 1 和 C N E 一 1 细胞均有体外杀
伤作用 , 且对裸鼠异体移植人鼻咽癌细胞生
长有抑制作用 。 实验结果与上述报道一致 , 进
一步证实青篙醋钠的抗肿瘤作用 。
细胞凋亡在肿瘤的治疗中具有重要的意
义 , 凋亡调节紊乱与肿瘤的发生发展 有着密
切 的关系 , 凋亡功能丧失或抑制可能导致癌
症的发生和肿瘤细胞耐药性的出现 , 许多肿
瘤促进剂能明显抑制肿瘤细胞凋亡 , 而多种
抗肿瘤的化学药物具有诱导肿瘤细胞凋亡的
作用〔‘ , 5 〕 。
我们通过光镜 、 电镜 、 流式细胞仪等实验
研究表明青篙醋钠能诱导人肝癌细胞发生凋
亡 , 并从诱导细胞凋亡 的角度探讨了青篙醋
钠抗肿瘤作用机制 。 细胞凋亡是基因调控下
的细胞主动死亡过程 , 目前认为细胞凋亡途
径可分为两种 :P 。。依赖型 和 P53非依赖型途
径 〔卜“〕 。 分化诱导细胞 因子如白细胞介素一 6
( lL
一
6)
、 白血病抑制因子 (LI F ) 、 生长抑制因
子如转化生 长 因子 (IG F 一助 、 D N A 损伤剂
M M S (M ethy lm eth an e S ulfate)介导 P 53非依
赖性途径的凋 亡 , 并且研究发现 M yD ll6 、
M y D l l s 家族的 M yD lls 、 G a d d 4 5 、 C R 6 以
及 P 21、 B a x 和 B d 一 2 等基因参与调控此种类
型的凋亡途径〔9 , 。 W e s t e r n B l o t t i n g 实验结果
显示青篙醋钠诱导的凋亡细胞中 P 53表达并
不升高 , 表明青篙醋钠诱导 B E L 一 7 4 0 2 细胞
凋亡是通过 P 53非依赖性途径 。 有关青篙酷钠
诱导 P 53非依赖性凋 亡途径 的机制是 否与
M yD lls 家族 p小 Bax 和 Bel一 2 等基因的调
控有关 , 还有待进一步探讨 。
参 考 文 献
1 W oerdenbag H J, e t a l . J N a t P r o d , 1 9 9 3 ; 5 6 ( 6 ) : 8 4 9
2 杨小平 ,等 . 中国肿瘤临床 , 1 9 9 5 ; 2 2 ( 增刊):101
3 R aeker D K , e t a l . T r a n s m i s s i o n E l e e t r o n M i e r o s e o -
p y
.
1 l l i
n o
i
s :
C h
a r
l
e s
C T h
o
m
a s
P
u
b l i
s
h
e r ,
1 9 8 3
:
1 4
4
W
i l l i
a
m
s
G T
, e t a l
.
Ce
l l
,
1 9 9 1
;
6 5
:
1 0 9 7
5 B
o s
m
a n 一F T
, e t a
l
.
P
a t h R
e s
P
r a e t
,
1 9 9 6
;
1 9 2
:
6 7 6
6 M
a e
f
a r
l
a n e
M
, e t a
l
.
M
o
l P h
a r
m
a e o
l
,
1 9 9 6
;
5 0
:
9 0 0
7 T
a
m
u r a
T
, e t a l
.
N
a t u r e ,
1 9 9 5
;
3 7 6 ( 1 7 )
:
5 9 6
8 G
a r t e n
h
a u s
R B
, e t a
l
.
P
r o e
N
a t l A
e a
d s
e
i U S A
,
1
9 9 6
;
9 3
:
2
6 5
9
L i
e
b
e r
m
a n n
D A
, e
t a l
.
O
n e o g e n e
,
1 9 9 5
;
1 1
:
1 9 9
( 1 9 9 8
一
0 1
一
0 8 收稿)
Studies o n the A n titum or E ffect a nd A P oP tosis Ind u etion in H u m a n L iver
C an eer C ell L in e (B E L 一 7 4 0 2 ) b y S o d i u m A r t e s u n a t e
Z h a n g X i n g
,
Y
a n
g X i
a o
p i
n
g
,
P
a n
Q i
e
h
a o
( C
a n e e r I
n s t i t
u t e
,
S
u n
Y
a t s e n
U
n i
v e r s
i t y
o
f M
e
d i
c a
l s
e
i
e n e e ,
G
u a n g
z
h
o u
5 1 0 0 6 0 )
A b
s
t
r a c
t T
o s t u
d y
t
h
e a n t i t
u
m
o r a e t i
v
i t y
o
f
s o
d i
u
m
a r t e s u n a t e
( S A )
a n
d i
t s
m
e e
h
a n i
s
m
o
f
a e t i
o n , a n -
t i t
u
m
o r e x p
e r
i m
e n t s i n v i t
r o a n
d i
n v
i
v o , e e
l l m
o r
p h
o
l
o
g y
,
f l
o
w
e
y t
o
m
e t r y a n
d
W
e s t e r n
b l
o t w
e r e
p
e r -
f
o r
m
e
d
.
S
e r v e r a
l
e o n e
l
u s
i
o n s e a n
b
e o
b
t a
i
n e
d
:
1
.
S A h
a
d
a n t i t
u
m
o r e
f f
e e t s o n
h
u
m
a n
l i
v e r c a n c e r e e
l l
s
( B E L
-
7 4 0 2 ) i
n v
i t
r o a n
d i
n v
i
v o
.
2
.
S A i
n
d
u e e
d
a
p
o
p t
o s
i
s
i
n
h
u
m
a n
l i
v e r e a n e e r e e
l l
s ,
w h i
e
h m
a
y b
e o n e o
f
t
h
e
m
e e
h
-
a n
i
s
m
s o
f i
t s a n t i t u m
o r e
f f
e e t s
.
3
.
A P
o
p t
o s
i
s
i
n
B E L
一 7 4 0 2 e e l l s b y S A m a y b e i n d u e e d b y P 5 3
一i n d e p e n d e n t
p a t h w a y
·
K
e y w o
r
d s S
o
d i
u
m
a r t e s u n a t e
( S A ) H
u
m
a n
B E L
一 7 4 0 2 l i v e r e a n e e r e e l l l i n e a p o p t o s i s i n l i v e r e a n
-
e e r e e l l P
5 3 一i n d e p e n d e n t p a t h w a y
《中草药》1 9 9 8 年第 29 卷第 7 期 . 4 6 9 .