全 文 ：· 药剂与工艺 ·
H P L c 法测定卫矛醇及检测复方中药
制剂通痹灵中的卫矛醇
沈阳药科大学中药系(l 1 0 0 1 5) 沈 嘉 米 李 铣
岛根医科大学 (日本 ) 李项华 小林裕太 奥西 秀树
摘 要 用 HPI .C 测定复方中药制剂通痹灵中的卫矛醇 。 以衍生物制备法将卫矛醇和内标制成具
有紫外吸收的异氰酸苯酚衍生物 , 用 T S K 一ge ! O D S 一S OT M 柱 . 乙睛一乙醇 一水 (5 : 2 : 3) 为流动相 ,
检测波长 24 om m , 内标法定量 。
关键词 高效液相色谱法 通痹灵片 南蛇藤 卫矛醇
“通痹灵 ”为临床 _L对类风湿关节炎及强
直性脊柱炎显示 出显著疗效的中药复方 , 由
15 种传统中药组成 , 其 _ _仁要药用植物之一为
南蛇藤〔, 户一 5〕 。 从南蛇藤 公la s t , u s o rb ic u la to s
T h u n b
. 中可分离 出卫矛醇 , 已在 临床 _ [ 用
于炎症及类风湿关节炎的治疗 〔”、’〕 。 以标准
D BA / IJ 鼠 制 备 C IA (C o lla g e n 一In d u e e d
A rt hr it
s 胶原引起关节炎 )模型 的动物试验
已证明卫矛醇可改善 C IA 病鼠的临床关节
炎发病率 , 减轻其骨破坏程度 。 FA C S (F lu o -
r e s e e n e e 一 a c t iv a te d c ell s o r t in g )结果证明卫
矛醇可上调 C IA 病鼠的 C D ; 和 C D S 使其接
近正常鼠水平 , 与病理组有显著性差别 。 _ L述
大量试验结果证 明卫矛醇有抗炎及免疫调 节
作用 。 本试验研究以 H P L C 测定出通痹灵中
含有卫矛醇 , 证明卫矛醇为通痹灵 中的有效
成分之一 。 此方法可将无紫外吸收的卫矛醇
等糖醇制备成可用紫外吸收定量的异氰酸苯
醋衍生物 ,所测含量可精确到毫摩尔 ,精确度
高 , 简便 , 省时 。
1 仪器和试剂
干燥的南蛇藤根及通痹灵片剂由广州中
医药大学 提供 。 对 照 品卫 矛 醇 购 自东京
(N a e a la ite s q u e
,
IN C
.
K Y O T O
,
JA PA N ) ; 内
标 D 一葡萄糖二 乙基缩 硫醛 (D 一 g luc os e di -
e thy l m e r e a p t a l
,
G D M )色谱纯 (S G M 公司 ) ,
其余试剂为分析纯 , 水为重蒸馏水 , 流动相为
色谱纯 。
W ate r 4 8 6 型高效液相色谱仪 , 连接紫
外检测器及数据处理仪 。
2 色谱条件
色谱柱 : T S K 一ge l O D S 一 soT M 色 谱柱
(1 5 e m 火 4 . 6 m rn , 5 拼m )(T o yo S o d a , T o k y ,
Ja p a n )
, 流动相 : 乙睛一乙醇一水 (5 : 2 : 3 ) , 检
测波长 : 2 4 0 n m , 流速 1 m L / m in , 进样量 1 0
拌L 。
3 方法与结果
H PL C 分析方法基于下述原理 : 多元醇
如卫矛醇与异氰酸苯醋反应可生成具有紫外
吸收的衍生物 , 以平行条件下制备的 D 一葡萄
糖二乙基缩硫醛 一异氰酸苯脂衍生物作内标 。
本试验在文献〔8〕报道基础上做少量改动 。
来
A dd r e s s : S ll e n Jia
,
D e Pa r tm e n t o f C h in e s e M
a te r ia M
e d ie a
,
S h e n y a n g Ph a r m a e e :一t ie a l U n iv e r s ity ,
S he n v a n 盯
沈 嘉 , 1 9 8 2 年毕业于沈阳药学院药学系 , 学士 、高级 工程师 。 从事药 用植物有效成分富集提取及活性测定工作 。 1 9 9 1 ~ -
1 9 9 3 年在瑞典 U p p sa la 大学生物医学中心进行药用植物中血小板活性因子 (PA F )拮抗剂 、 5 一脂氧合酶 (5 ~ L O ) 、环氧合酶
(C O X )抑制剂 的体外筛选 r 作 。 1 9 9 6 一0 8一 1 9 9 7 一0 3 在 日本岛根 医大参加文部省课题进行复方中药之中抗 炎及免疫调节成分的研究 。
.
7 1 8
.
3. 1 标准曲线的制备
3
.
1
.
1 配制标准溶液 :分别精确称定标准卫
矛醇及 内标 G D M lm m ol , 用双蒸馏水配成 1
拌m ol / m l, 的标准储备液 , 分别精确吸取适当
量进行衍生物制备 , 使其最后反应生成的衍
生物溶液每 10 川J 中分别含有 0 . 3 、 0 . 5 、 1 、
2
、
3
、
4
、
5
、
1 0 n m o l卫矛醇 , 而每一衍 生物 样
品 1 0 拌L 中的内标量则固定为 5 n m ol 。
3
.
1
.
2 衍生物的制备 : 分别精确吸取上述相
同体积的内标标准液及系列体积的卫矛醇标
准液转移进 10 m L 的螺旋盖试管之 中 , 同时
以蒸馏水及同量 内标标准液制备试剂空白及
内标标准品样品 , 将上述所有样 品冷冻干燥 。
向每一冷冻干燥的样 品中加入 140 川一 毗咤
(储存时 毗咤 中放少量 N a O H ) , 加 入 4 0 拼L
异氰酸苯醋 , 盖上试管旋紧 , 5 ℃加热 l h 之
后放置冰浴 _L 1 m in , 向每一样品之 中加入
4 0 拌L 甲醇 , 在 5 ℃继续加热 s m in (以 甲醇
将剩余的异氰酸苯 醋反应 完全 ) , 加入 1 80
川J 毗陡稀释所得的反应混合液 , 得到总体积
4 0 0 拌L 的样品 。 进样前以滤器过滤 , 进样量
为 10 拜l。
3
.
1
.
3 标准曲线 : 以浓度为横座标 , 峰面积
比(卫矛醇 / 内标 )为纵座标绘图得标准曲线 。
回归方程 为 Y = 0 . 0 5 4 3 6 8 + 0 . 2 1 8 7 9 X , r =
0
.
9 98 8
。
卫矛醇在 0 . 3 一 10 n m ol 浓度范 围内线
性灵系良好 。 精密吸取卫矛醇标准溶液制备
的衍生物样品 10 拜L (含标准卫矛醇 5 n m ol ,
内标 5 n m ol )连续 6 次进样 , 测得峰面积比 ,
得变异系数 。. 3 % 。
3
.
2 生药南蛇藤及通痹灵片剂 中的卫矛醇
的分离及 HP L C 鉴定
3
.
2
.
1 从南蛇藤中分离卫矛醇 :干燥的南蛇
藤根 (5 0 0 9 )粉碎 , 用蒸 馏水冷浸提取 (5 0 0
m l
切
X Z)Zh
,过滤 。 滤液水浴加热挥散浓缩至
2 5 om L
, 浓缩 液进行大孔树脂柱层析 (天津
D IOI
,
7 2 5 9 )
, 以蒸馏水洗脱 , 洗脱速度 Zm xJ /
m in
, 每一洗脱体积 20 o m L 。 收集第二洗脱体
积 , 水浴挥散浓缩至 Zo m L , 加冷 乙醇 , 使 最
《中草药》1 9 9 7 年第 28 卷第 12 期
后 乙醇浓度为 70 % , 过滤 除 去沉淀 , 回收乙
醇 , 剩余的水溶液 4 ℃冰箱保存约 3d , 出现大
量 无 色 结 晶 , 重 结 晶 得 1 . 2 9 卫 矛 醇 ,
rn p 1 8 7 ℃一 1 8 9 ℃ , IR 光谱与标 准卫矛醇一
致 。
3
.
2
.
2 通痹灵制剂的分离 : 10 片(2 . 5 0 8 9 )
随机选择 的通痹灵片剂粉碎混合均匀 , 用蒸
馏 水冷 浸提 取 ( 6 . 5 m IJ x 3 ) , 离心 (3 0 0 0
rp m ; 20
‘
C S m in )除去 固体物质 , 合并 上清
液 , 冷冻干燥 , 溶解冷冻干燥粉末 (1 . 0 0 5 9 )于
1 0 m L 蒸馏水 中 , 用分液漏斗以 乙酸 乙酷萃
取 (10 m IJ x s ) 。 合并水相 , 冷冻干燥得水溶
部分(0 . 93 8 9 ) , 将水溶解部分溶于 10 m L 蒸
馏水中 , 加入 2 4 m l才 冷 乙醇 , 离心 (1 0 0 0 0 9 ,
4 ℃ 5 m in )除去沉淀 , 蒸发挥散上清液得固体
粉末 0 . 51 19 , 将其溶于 2 m L 蒸馏水之中 , 取
。. 2 m L 进 行柱 层 析分 离 (S E P 一PA K C 18
C A R T R ID G E W
a te r S A s s o e ia t e s )
, 以 蒸馏
水洗脱 , 0 . 5 m L 为一洗脱体积 , 取第一洗脱
体积 为通痹灵 样 品测 定液 , 制备 H PI 一 样
品 ,用于分析卫矛醇 。
3
.
2
.
3 样品测定 : 精确称定从南蛇藤中分离
出的卫矛醇 配制成 1拌m ol / m l一 的样品储备
液 。 分别精确吸取样品储备液及上述通痹灵
样品测定液转移进 IOm L 螺旋盖试管中 , 其
余操作同 3 . 1 . 2 衍生物的制备 。 H PI 尤 分析
结果见图 l 、 2 。
4 讨论
4
.
1 试验 目的是定性检测生药南蛇藤 及中
药复方通痹灵 中存在的卫矛醇 , 试验结果证
明 : H P LC 测定卫矛醇含量方法简便快速准
确 , 可测定复杂复方中含量较低的卫矛醇 。
4
.
2 通痹灵之中含有一定量的卫矛醇 , 结合
药理试验结果可认为卫矛醇是南蛇藤及通痹
灵抗炎风湿的有效成分之一 。
4
.
3 所制备的衍 生物样品室温放置 1 周后
测定重复性良好 , 说明其衍生物性质稳定 。
4
.
4 标准曲线没有通过原点 , 原因是参加反
应的试剂之中存在着与卫矛醇具有相 同保留
时间的痕量未知化合物 , 其他研究者在试验
·
7 1 9
·
0 0 0 8
.
7 5 17
.
50 2 6
.
2 5
15
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0 0 2 2 5 0
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0 0 0 7
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.
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.
0 0
”曰川朋洲例日一
图 1 卫矛醇 H P LC 谱
a 一卫矛醇标准品 (样 品一 1 , 10 川) b 一南蛇藤中分出的卫
矛醇 (样品一 2 , 10 拜l) e 一样品一 l ( 5 “l)加样品 一2 ( 5 仁l)混
合 工一卫矛醇 l 一内标
之中也发现相 同问题 , 并指 出只要内标量适
当就可得到精确满意的卫矛醇定量结果〔“ , 9〕。
4
.
5 文献报道用此方法可精确测定动物组
织 (如 晶状体或坐骨神经 ) 中微量的多元醇 ,
其精确度可达到 0 . sn m ol 〔8 〕, 本试验结果说明
可扩大此方法的应用范围 。
致谢 : 本工作由 日本文部省 资助 ;沈 阳 药
科大学 59 期药学 系钟敬波 、 中药系金岩分 离
南蛇藤 中卫予醇 , 在此表示谢意 。
参 考 文 献
图 2 H PLC 测定通痹灵中卫矛醉
a 一卫矛醇标准品 (样品一 1 , 10 川) b 一卫矛醇与通痹灵混
合 (样品 一1 , 1 川+ 通痹灵样一 2 , 9 闪) c 一通痹灵 (样品一2 ,
1 0 拜l)
陈纪藩 , 等 . 新中医 , 1 9 93 , ( 1 ) : 53
陈纪藩 , 等 . 中国中西 医结合杂志 , 1 9 4 , (增刊 ) : 16 3
陈纪藩 , 等 . 新中医 , 19 9 4 , ( 7 ) : 2 2
L i S o n g h u
a , e t a l
.
Clin E x p e r im p h
a r m Phy s io l, 1 9 9 6 ,
( 2 3 ) : 2 3 6
李颂华 , 等 . 日本临床风 湿杂志 , 1 9 3 , (5 ) : 12 3
刘肇清 , 等 . 药学通报 , 1 9 5 1 , 1 6 ( s ) : 5 5
周 自永 , 等编 . 新编常用药物手册 . 北京 : 金 盾 出版社 ,
1 9 9 2
.
1 1 0
M iw a l
, e t a l
‘
A n a ly t B io
e
h
e
m
, 1 9 8 8
, 17 3
:
3 9
D e t hy JM
, e t a l
.
A n
a
ly t B io e h
e
m
, 1 9 8 4
, 14 3 : 1 1 9
( 1 9 9 7
一
0 5
一
2 6 收稿 )
·
7 2 0
D e te r m in a tio n o f D u le it o l in T r a d itio n a l C h in e s e C o m Po u n d P r is e r iP tio n
“ T o n g b ilin ” b y H PL C
S h e n Jia
,
T i S o n g h u a
, e t a l
D u leit o l in t r a d itio n a l C h in e s e e o m p o u n d p r e s e r lp tio n
“
T o n g bilin ” w a s d e te rm in e d b y H P LC
.
T his
m e th o d 15 ba s e d o n t he fa e t th a t p o lyo ls lik e d u le it o l a n d g lu e o s e d ie tl、yl m e r e a p t o l (in te r n a l s t a n d a r d ) e a n r e
-
a e t w ith p h e n ylis o e y a n a te t o y ie ld IJV
一a bs o r b in g d e r iv a tiv e s w h ie h e a n b e d e te e te d a t 2 4 0 n m by H PL C
.
A
T S K
一
g e l ()D S
一
soT M
e o lu m n a n d n i〔)b ile p h a s e a e e t o n it r ile
一e th a n o l
一
H Z() (5
,
2
,
3 ) w e r e e m p lo y e d
.
灵芝破壁抱子与不破壁抱子的显微镜
观察与生化测定比较研究△
北京理工大学材料科学研究中心( 1 0 0 0 8 1 )
中国无锡三联高科技开发公司
杨新林 米 朱鹤孙 赵 东旭
徐建兰 匡 群
摘 要 首次对灵芝破壁抱子与不破壁饱子进行了初步的比较研究 。 显微镜下观察 , 破壁饱子粉
与不破壁抱子粉的形态明显不同 , 采取水提 、酸提 、水煮三种不同的提取方式 , 破壁饱子粉提取液
中还原糖与多肤含量都明显高于不破壁抱子粉 , 结果提示经过破壁处理后 , 灵芝抱子中的化学成
分更容易被提取出来 。
关键词 灵芝饱子 破壁 还原糖 多肤
近年来 , 随着灵芝人工栽培技术的发展 ,
规模收集其生殖细胞一一灵芝抱子的难题得
到解决 ,逐步开展了对灵芝抱子的研究 。有报
道灵芝抱子具有降血糖作用 〔‘〕 , 能够调节机
体免疫功 能〔幻 , 对磷酸肌酸激酶 (C PK )含量
在免疫性肌炎大鼠肌肉中的下降及血清中的
上升亦有拮抗作用 〔3 , 。 临床试用治疗萎缩性
肌强直等疑难疾病有较满意效果以〕。 灵芝抱
子的化学成分也有报道 〔5 一 7〕 。 但以往研究采
用原料均为不破壁抱子粉 , 本文首次对破壁
抱子与不破壁泡子进行初步的 比较研究 。
1 材料与方法
1
.
1 灵芝抱子的显微镜观察 :灵芝抱子用适
量蒸馏水 配 成悬浮液 , 涂片后 直接在 A x -
io v e r t 4 0 5M 型 荧光倒 置 显微镜 (德 国 O P -
T O N 精密仪器有限公司 )上观察 , 进行显微
摄影 。
1
.
2 灵芝破壁抱子粉与不破壁抱子粉提取
液的制备
1
.
2
.
1 酸提和水提 : 称取破壁与不破壁灵芝
抱子粉 (由中国无锡三联高科技公司生产并
提供 )各 2 9 , 分别置于 一 20 m L 试管 中 , 加
入 2 0 m L Z %盐酸溶液 (酸提 )或蒸馏水 (水
提 ) , 在沸水浴中加热 Z h , 冷却后离心 2 次 ,
每次 1 5。。 m L 、 10 m in , 收 集得 上清 液约 5
m L
, 分装冻干一 20 ℃保存 。
1
.
2
.
2 水煮 : 称取破壁与不破壁灵芝抱子粉
各 29 , 分别置于一 5 0 m L 平底烧杯中 , 加入
生 、州 d毯 5 5 : 卜砂9 X i旦l远, R 瞥 e a r eh C e只t性r o f M at e于ials s c i弓n e兮, B e iji只g 互n ‘v e r sity o f T e c h n o lo g e , B e ijin g杨新林 , 男 , 30 岁 , 傅士 , 剐研咒员 , 1 9 2 一07 毕业十北京帅 范大学生物系 , 获理学博 上学位 。 1 9 9 2 一 0 9 ~ 19 9 4 一0 9 在 中国科学院动物研究所从事博士后研究 : 人 早期滋养层组织和绒毛膜上皮癌细胞系中的激活素和抑制素的研究 。 1 9 9 4一 。9 到北京理工大学材料科学研究中心工作 , 受聘为生物技术与生物材料研究室副研究员 , 现担任该室领导工作 , 研究的主要方向 : (1) 灵芝袍子抗癌成分的分离鉴定与作用机理研究 , (2 )C 6 。的生物学效应的研究 , (3) 复合生物驻极体材料的制备与应用研究 。 正主持国家重点科技项 目 (攻关 )计划 l 项 , 参加的 自然科学基金项 目 2 项 , 自然科学 基金重大项 目 1 项 , 负责校优秀中青年教师基金 l 项 , 共发表各类文章 30 篇 。△ 国家科委主任基金资助项 目
《中草药 》1 9 9 7 年第 28 卷第 12 期 · 7 2 1 ·