全 文 ：基因组学与应用生物学，2014年，第 33卷，第 4期，第 802-807页
Genomics and Applied Biology, 2014, Vol.33, No.4, 802-807
研究报告
Research Report
十字花科黑腐病菌中一个与黄色素合成相关基因的鉴定
杨国奎 1 祁艳华 1 朱艳宁 1 冷明 1 叶玉云 1 苏辉昭 1 陆光涛 1,2*
1广西大学生命科学与技术学院,南宁, 530005; 2亚热带农业资源保护与利用国家重点实验室,南宁, 530005
*通讯作者, lugt@gxu.edu.cn
摘 要 十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris,简称 Xcc)能够产生大量的胞外多糖。胞
外多糖商品名又称为黄原胶，具有广泛用途，在食品生产中可作为添加剂使用。为了得到不含黄色素的黄原
胶，我们采用转座子 EZ-Tn5随机插入诱变的方法对 8004菌株进行突变，获得了一株不产黄色素的突变体。
通过对突变体的转座子 EZ-Tn5插入位点进行分析，发现该突变体是由于编号为 XC_4097的基因被插入突
变后衍生而来。同源性分析表明 XC_4097编码一种脂质酰基转移酶，它与脂质的合成有关。采用同源双交换
方法构建 XC_4097基因的缺失突变体。通过对野生菌、突变体以及功能回补体的表型分析进一步证实了
XC_4097基因功能的丧失只影响黑腐病菌黄色素的合成，而不影响细菌生长以及胞外多糖的合成。这为工
业上生产无黄色素的黄原胶提供了应用基础。
关键词 十字花科黑腐病菌, 胞外多糖, 黄色素, XC_4097
Identification of a Gene Involved in Pigment Synthesis in Xanthomonas
campestris pv. campestris
YangGuokui 1 QiYanhua 1 ZhuYanning 1 LengMing 1 YeYuyun 1 SuHuizhao 1 LuGuangtao 1,2*
1 College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning, 530005; 2 State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Sub-
tropical Agro-bioresources, Nanning, 530005
* Corresponding author, lugt@gxu.edu.cn
DOI: 10.13417/j.gab.033.000802
Abstract Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) produces a mass of exopolysaccharides, which are also
called xanthan gum. Xanthan gum could be used in a variety of products, including used as additive agents in
food production. In order to attain the non-pigment xanthan gum, Xcc8004 strain was mutanted by using transpo-
son EZ-Tn5 and a mutant strain producing no pigment was isolated. Further analysis revealed that the mutant is
derived from the insertion of EZ-Tn5 in XC_4097 in the genome of 8004 strain. Sequence analysis showed that
this gene is predicted to encode a lipid acyl transferase, which is involved in lipid synthesis. The XC_4097 dele-
tion mutant was constructed by the method of homologous double-crossover. Through analyzing phenotype of
wild type, mutant and complementary strains demonstrate that the XC_4097 involved in pigment synthesis but
not exopolysaccharides (EPS) yield and growth in Xcc. This work provides foundation for producing xanthan gum
without pigment.
Keywords Xanthomonas campestris pv. campestris, Exopolysaccharides, Pigment, XC_4097
基金项目：本研究由国家自然科学基金(31171206)项目资助
十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.
campestris,简称 Xcc)是一种植物病原菌，能在世界范
围内侵染十字花科植物，引起黑腐病(Daniels et al.,
1987)，给农业带来巨大的损失。它的寄主包括一些重
要的农作物如甘蓝、芥菜、萝卜等。另外，它所产生的
胞外多糖，是发酵工业上最为成熟的一种产品。胞外
多糖商品名又称为黄原胶，它是由 D-葡糖糖、D-甘
露糖、D-葡萄糖醛酸、乙醇和丙酮酸组成的重复结
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
构单元(Becker et al., 1998)。在 Xcc中，已经证实gum
基因簇的 12个基因(gumB~gumM)是胞外多糖合成、
组装和分泌的关键基因，该基因簇属于同一个操纵
子，它们共用位于 gumB 基因前的一个启动子
(Katzen et al., 1998)。
由于黄原胶具有独特稳定的分子结构，较高的
粘度，易溶于水，以及较高的酸、碱、热稳定性(宋国安
和宋玉峰, 1997)，因此，它作为增稠剂、乳化剂、保水
剂等应用于食品工业、石油工业、医学领域等行业
(Baird et al., 1983)。但在细菌合成黄原胶的同时，还
合成多种色素，其中最主要的是黄色素，因而黄原胶
制品常显黄色，但市场上所需的黄原胶产品有时是
不含黄色素的，如制造牙膏，雪糕等所用的黄原胶。
为了去除黄色素，在工业生产中需要许多流程来达
到目的。这就给工业生产带来额外的花费并对环境
造成污染。
本实验采用转座子 EZ-Tn5诱变 Xcc8004菌株，
获得了 1株不含黄色素的突变体。分析发现该突变
体是由转座子插入基因组中编号为 XC_4097的基因
内衍生而来，本工作即是鉴定 XC_4097与 Xcc黄色
素的合成有关。
1结果与分析
1.1 XC_4097突变影响黑腐病菌黄色素的合成
前期工作采用转座子 EZ-Tn5诱变十字花科黑
腐病菌 Xcc8004菌株，经过筛选获得了 1株不产黄
色素的突变体。根据 Tn5序列设定特定的引物，然后
使用反向 PCR法对 Tn5插入位点的 DNA序列进行
扩增(Lto et al., 2010)，并对得到的 DNA片段进行序
列测定，对 Tn5的插入位点进行定位，发现突变体是
由转座子 Tn5 插入到基因组中编号为 XC_4097 的
基因内衍生而来。
为准确了解 XC_4097的功能，我们构建XC_4097
的缺失突变体 DM4097。通过 PCR扩增出 XC_4097
基因上游 608 bp和下游 616 bp的同源片段，将获得
的 DNA片段克隆在质粒 pK18mobsacB的 EcoRⅠ/
HindⅢ位点上，获得重组质粒。再通过同源双交换法
将 8004基因组中的 XC_4097基因置换下来，从而构
建出 XC_4097的缺失突变体 DM4097。同时 PCR扩
增出含有整个 XC_4097基因的同源片段，将获得的
DNA片段克隆在质粒 pLAFR3的 BamHⅠ/HindⅢ位
点上，获得重组质粒，并通过三亲本结合的方法导入
DM4097，构建突变体的功能互补菌 CDM4097。将得
到的野生菌 Xcc8004，突变体 DM4097，互补菌
CDM4097接种于 NYGA平板上，静止培养 3 d后结
果如图 1A 所示，XC_4097 突变体的菌落明显成白
色，而野生菌和互补菌的菌落均呈现黄色，表明
XC_4097与细菌的黄色素合成有关。
1.2 XC_4097 突变后不影响细胞生长繁殖及胞外多
糖合成产量
为了解 XC_4097是否与细胞 EPS产量有关，将
8004、DM4097、CDM4097 三种菌株接种于含 2%葡
萄糖的 NYGA培养基的平板上，定性比较 EPS产
量。将平板于 28℃培养箱中静止培养三天后观察其
EPS产量，结果如图 1A所示，XC_4097突变体菌落
大小与野生型相当，表明其 EPS 产量可能与
XC_4097无关，但 EPS中所含的黄色素明显减少。
为准确测定三种菌株中 EPS的产量，我们采用
液体培养基培养后，乙醇沉淀法提取 EPS，定量检测
XC_4097 突变体 EPS 的产量。将 8004、DM4097、
CDM4097按 5%的接种量分别接种在含 2%葡萄糖
的丰富培养基 NYGB中，于 28℃摇床培养 5 d后提
取 EPS，并将提取的 EPS烘干后称重并记录，结果所
图 1B所示，XC_4097突变后，菌体的 EPS产量与野
图 1野生型,突变体和互补菌株的 EPS产量比较
注: A:定性分析 EPS; B:定量分析 EPS
Figure 1 The difference of EPS among wild type, mutant and
complementary strains
Note: A: EPS of qualitative analysis; B: EPS of quantitative
analysis
803
生型相当，表明 EPS产量与 XC_4097无关。
为了解 XC_4097是否与细胞的生长有关，我们
对三种菌株在基本培养基 MMX 和丰富培养基
NYGB中的生长繁殖进行测定。将 8004、DM4097和
CDM4097 按 1%的接种量分别接种在 NYGB 的液
体培养基中，按 10%的接种量分别接种在 MMX的
液体培养基中，以时间为横坐标，OD600为纵坐标作
图。实验结果如图 2A和图 2B所示，在相同的时间
点突变体与野生菌的菌体数几乎一致。结果表明在
NYGB 和 MMX 培养基中 XC_4097 突变后不影响
黑腐病菌的生长。
1.3 XC_4097 突变后不影响黑腐病菌的胞外酶活性
及致病性
为了解基因 XC_4097是否影响细胞的胞外酶，
我们分别对三种菌株的胞外淀粉酶，胞外纤维素酶
和胞外蛋白酶的活性进行分析。
将 8004、DM4097、CDM4097分别接种于含 1%脱
图 2野生型,突变体和互补菌株在 NYGB (A)和 MMX (B)培
养基中的生长
Figure 2 The growth of wild type, mutant and complementary
strains in the NYGB (A) and MMX (B)
脂牛奶、0.5%羧甲基纤维素、0.1%可溶性淀粉的 NYGA
培养基中。于 28℃培养箱中培养一天后分别用 KI/I2
溶液和刚果红溶液对羧甲基纤维素和可溶性淀粉的
NYGA平板进行染色，脱脂牛奶的 NYGA平板无需染
色。结果如图 3所示，XC_4097突变后，在这三种培养
基平板上所形成的水解圈大小与野生型的基本一致。
说明XC_4097与细菌的胞外酶活性无关。
研究其对植物的致病性是通过剪叶的方法(陆光
涛等, 2008)。将 8004、DM4097、CDM4097过夜培养
物的浓度稀释至 OD600=0.001后，剪叶接种到萝卜叶
片上，于 28℃恒温室中培养 10 d。结果发现 XC_4097
突变后，细菌在萝卜叶片上形成的病斑长度与野生型
在萝卜叶片上形成的病斑长度相差不大，说明
XC_4097与细菌对植物的致病性无关。
1.4基因 XC_4097的基本特征
基因XC_4097全长 975 bp (NCBI-GI: 66770394)，
位于 Xcc8004基因组中 4 826 475至 4 827 449之间，
该基因编码一个 324个氨基酸残基组成的蛋白质，
其蛋白质预测分子量为 36.2kD，等电点为 9.98 (http://
web.expasy.org/compute_pi)。根据(http://smart.embl-
heidelberg.de)对 XC_4097基因编码的蛋白质序列进
行功能域分析，发现蛋白质序列的第 13~298个氨基
酸残基组成脂质 A酰基转移酶的功能域，预测与脂
多糖的合成有关。利用 Blastx程序，将该基因序列与
swissprot的 database的 DNA序列做同源性比较，未
发现有相关的报告。
2讨论
通过转座子 Tn5诱变 8004菌株的方法，获得了
图 3野生型,突变体及互补菌株的表型板比较
注: A:胞外淀粉酶; B:胞外纤维素酶; C:胞外蛋白酶
Figure 3 Kinds of phenotype assays of wild type, mutant and
complementary strains
Note: A: Detection of extracellular amylase; B: Detection of ex-
tracellular cellulase; C: Detection of extracellular protease
十字花科黑腐病菌中一个与黄色素合成相关基因的鉴定
Identification of a Gene Involved in Pigment Synthesis in Xanthomonas campestris pv. campestris 804
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
一株不能产黄色素的菌株。分析发现突变体是是由
于编号为 XC_4097的基因被插入突变后衍生而来，
该基因突变后，影响黑腐病菌黄色素的合成。黄色素
与花青素同为苯并吡喃的衍生物，广泛存在植物的
花、叶、茎和微生物的胞外分泌物中，易与金属离子作
用而改变颜色。黄单胞菌中的黄素色的结构由溴化芳
基，多烯脂和一些其他修饰物组成(Starr et al., 1977)，
其结构非常复杂。目前研究发现在 Xcc中，pig基因
簇的 7个基因(pigA-pigG)的编码产物与黄色素合成、
组装和分泌有关，突变这些基因中的大多数都会引
起黄素色的丢失(Poplawsky et al., 2000)。但黑腐病菌
中黄色素的具体合成途径尚不清楚。
根据信息分析，基因 XC_4097编码一种细菌脂
质酰基转移酶，它与酰基转移有关。而黑腐病菌中黄
色素的组成成分包括多烯脂肪酸和苯环等结构。黑
腐病菌中黄色素的合成过程非常复杂，推测黄色素
先被合成一个前体物质，前体物质在 pig基因簇所编
码的酶催化下，才能生成黄色素。在合成前体物质的
过程中需要一些酶如酰基转移酶等。XC_4097编码
的酰基转移酶可能参与前体物质的合成。因此，
XC_4097突变后，黑腐病菌不能产生黄色素的前体。
但有关这些途径还有待进一步探究。
3材料与方法
3.1菌株和质粒
实验所用菌株和质粒见表 1。
3.2试剂
限制性内切酶、Es Taq酶、Taq酶、T4连接酶和各
表 1本实验所用菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids in this work
菌株和质粒
Strains and plasmids
Escherichia coli
DH5α
DH5α/pRK2073
DH5α/pL3C4097
DH5α/pkSacB4097
Xcc
Xcc8004
DM4097
8004/EZ-Tn5/4097M
CDM4097
质粒
Plasmids
Pk18mobSacB
pL3C4097
pkSacB4097
特征
Characteristics
fhuA2, Δ (argF-lacZ) U169, phoA, glnV44, Φ80, Δ (lacZ) M15, gyrA96, recA1, relA1,
endA1, thi-1, hsdR17
DH5α中含 pRK2073质粒,三亲本结合试验的帮助菌, Spcr
DH5α harbouring pRK2073, assist conjugation process, Spcr
DH5α中含有互补质粒 pL3C4097, Tcr
DH5α harbouring pL3C4097, Tcr
DH5α中含有带有 XC_4097上下游基因的重组质粒 pk18mobSacB, Kmr
DH5α harbouring pk18mobSacB having the fragment of upstream and downstream of
XC_4097, Kmr
野油菜黄单胞菌野生型, Rifr
Xanthomonas campestris pv. campestris, Rifr
没有基因 XC_4097的 Xcc8004的突变体, Rifr
As 8004, but XC_4097 was deleted, Rifr
EZ-Tn5转座子插入在基因 XC_4097的 ORF内的 Xcc8004的突变体, Rif, Km
As 8004, but the ORF of XC_4097 is inserted with an EZ-Tn5 transposon, Rif, Km
含有 pL3C4097质粒的 DM4097突变体的互补菌
DM4097 harbouring pLAFR3 containing a internal fragment including the XC_4097
gene, Rifr, Tc
黄单胞菌中的自杀质粒, Kmr
Suicide plasmid in Xanthomonas campestris pv. campestris, Kmr
含有 XC_4097的互补片段的 pL3质粒, Tcr
pLAFR3 containing a internal fragment including the XC_4097 gene, Tcr
含有 XC_4097上下游基因的 pK18mobSacB质粒, Kmr
pk18mobSacB having the fragment of upstream and downstream of XC_4097, Kmr
来源
Sources
Gibco BRL company
Leong et al., 1982
本实验所用
This work
本实验所用
This work
实验室
Laboratory collection
本实验所用
This work
本实验所用
This work
本实验所用
This work
实验室
Laboratory collection
本实验所用
This work
本实验所用
This work
注: Rifr为利福平抗性; Kmr为卡那霉素抗性; Spcr为壮观霉素抗性; Tcr为四环素抗性
Note: Rifr is Rifampicin resistance; Kmr is Kanamycin resistance; Spcr is Spectinomycin resistance; Tcr is Tetracycline resistance
805
种酶的 Buffer购自 Promega公司。质粒提取试剂盒
购自 BioFlux。DNA纯化和胶回收试剂盒购自天根
公司。EZ-Tn5TMTNP Transposome
Kit购自 Epicentre。
3.3引物
本实验所用引物(表 2)均由华大基因公司合成。
3.4菌株培养条件
十字花科黑腐病菌的液体培养基为 NYGB培养
基(每升培养基含 5 g蛋白胨, 3 g酵母提取物, 20 g甘
油, pH 7.0)；固体培养基为 NYGA 培养基(NYGB+
1%的琼脂粉)。大肠杆菌的液体培养基为 LB培养基
(每升培养基含 10 g胰蛋白胨, 5 g酵母提取物, 10 g
NaCl, pH 7.0)；固体培养为 LA培养基(LB+1%琼脂
粉)。菌株培养时间参考文献(薛番艳等, 2012)，抗生
素用量参考文献(谭旖宁等, 2007)。
3.5 DNA的操作
Xcc8004总 DNA的提取参考文献(Chen and Kuo,
1993)。质粒 DNA的提取，DNA片段的纯化及胶回
收，DNA的连接转化以及限制性内切酶的酶切反应
均按照所购买的试剂盒的说明操作。所有需要测序
的基因片段均由华大基因公司完成。
3.6 XC_4097缺失突变体的构建
根据 XC_4097基因上游序列设计引物 4097LF、
4097LR，下游序列设计引物 4097RF、4097RR如表 2
所示。通过 PCR分别扩增 XC_4097基因上游 608 bp
和下游 616 bp的同源片段。将所得的 DNA片段一
起克隆到自杀质粒 pk18mobsacB的 EcoRⅠ/HindⅢ
位点上，获得含有重组质粒 pkSacB4097的大肠杆
菌。在帮助菌 DH5α/pRK2073的作用下，通过三亲本
结合将重组质粒从大肠杆菌中转移到野生菌株 8004
中。在含有 Rif和 Km的丰富培养基 NYG中筛选重
组质粒融合于 8004菌株总 DNA的转化结合子。为了
从转化结合子中获得缺失突变体，过夜培养蔗糖敏感
的转化结合子，并稀释涂布于含有 Rif和 5%蔗糖的
NYG平板上。于 28℃静止培养 3 d之后，抗 Rif和蔗
糖的克隆子被挑选出来，同时检测这些菌株的 Km敏
感性。找出抗 Rif和蔗糖，但对 Km敏感的菌株，并以
4097LF、4097RR为引物进行 PCR验证，确定这些菌
株通过双交换丢失了 XC_4097基因。
3.7 XC_4097功能互补菌的构建
以 8004 总 DNA 为模板，C4097F/C4097R 为引
物，PCR扩增一段含有完整 XC_4097基因的同源片
段。所得的片段经 DNA测序证实后克隆到广谱宿主
质粒 pLAFR3，获得重组质粒 pL3C4097。将重组质粒
采用三亲本结合的方法导入 DM4097突变体，实现
基因的功能互补。
作者贡献
本实验在陆光涛研究员提供实验设计和实验指
导下，主要由杨国奎完成实验操作和论文初稿；祁艳
华、朱艳宁和叶玉云参与部分实验和数据分析；冷明
和苏辉昭对实验提出宝贵意见并参与论文的修改；
陆光涛研究员参与本论文的修改和最终定稿。全体
作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究是在国家自然科学基金(31171206)项目
的支持下完成，衷心感谢参与本研究的全体老师和
所有同学。
参考文献
Baird J.K., Sandford P.A., and Cottrell I.W., 1983, Industrial ap-
表 2本实验所用引物
Table 2 The primers used in this work
引物名称
Name of primers
C4097F/C4097R
4097LF/4097LR
4097RF/4097RR
引物序列(5-3)
Primers sequence (5-3)
GGATCCACGCTTGCCGCAGGTGAAGT/
AAGCTTAAGGTGGTCGTCTCGCGATA
GAATTCGTCTGTTTCCCGAAGGCACG/
TCTAGACTCGGGGCGTTGTTTCCAGT
TCTAGAGATTACGCCGCCAGGCTGGA/
AAGCTTACACTTTCGATGCAGCGCAG
扩增片段长度(bp)
Length of amplified fragment (bp)
1 300
608
616
注:下划线所示碱基为引物前所加的酶切位点序列
Note: The bases of underline are sequence of restriction enzyme cutting site
十字花科黑腐病菌中一个与黄色素合成相关基因的鉴定
Identification of a Gene Involved in Pigment Synthesis in Xanthomonas campestris pv. campestris 806
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